Summary
De senaste verken avslöjar den neuronala inverkan på högkvalitativa pediatrisk gliom (pHGG) celler och deras ömsesidiga interaktioner. Det nuvarande arbetet visar utvecklingen av en in vitro-modell samodling pHGG celler och glutamatergic nervceller och registrerade deras elektrofysiologiska interaktioner för att efterlikna dessa interactivities.
Abstract
Pediatrisk hög kvalitet gliomas (pHGG) representerar barndom och ungdomar hjärncancer som bär en snabb dyster prognos. Eftersom det finns ett behov av att övervinna resistensen mot nuvarande behandlingar och hitta ett nytt sätt att bota, är modellering av sjukdomen så nära som möjligt i en in vitro-inställning för att testa nya läkemedel och terapeutiska förfaranden mycket krävande. Att studera deras grundläggande patobiologiska processer, inklusive glutamaterg neuron hyperexcitabilitet, kommer att vara ett verkligt framsteg i förståelsen av interaktioner mellan miljöhjärnan och pHGG-celler. Därför, för att återskapa nervceller/pHGG cell interaktioner, visar detta arbete utvecklingen av en funktionell in vitro modell co-culturing mänskliga-inducerad Pluripotent Stem (hiPS)-härledda när glutamatergic nervceller pHGG celler i compartmentalized microfluidic enheter och en process för att registrera deras elektrofysiologiska modifieringar. Det första steget var att differentiera och karakterisera mänskliga glutamatergiska nervceller. För det andra odlades cellerna i mikrofluidiska enheter med pHGG härledda cellinjer. Hjärnan microenvironment och neuronal aktivitet ingick sedan i denna modell för att analysera den elektriska effekten av pHGG celler på dessa mikro-miljömässiga nervceller. Elektrofysiologiska inspelningar kopplas med hjälp av multielektrodmatriser (MEA) till dessa mikrofluidiska enheter för att efterlikna fysiologiska förhållanden och för att registrera den elektriska aktiviteten i hela neurala nätverket. En betydande ökning av neuron excitability betonades i närvaro av tumör celler.
Introduction
Pediatrisk hög kvalitet gliomas (pHGG) uppvisar en utökad genotypisk och fenotypisk mångfald beroende på patientens ålder, tumör anatomiska plats och förlängning och molekylära drivrutiner1. De är aggressiva hjärntumörer som är dåligt kontrollerade med de nuvarande tillgängliga behandlingsalternativen och är den ledande dödsorsaken relaterad till hjärncancer hos barn och ungdomar2. Så, mer än 80% av patienterna återfaller inom 2 år efter sin diagnos, och deras median överlevnad är 9-15 månader, beroende på hjärnplatser och föraren mutationer. Frånvaron av botande behandling är det främsta anloppet för laboratorieforskning och belyser det omedelbara behovet av nya innovativa terapeutiska metoder. För detta ändamål utvecklades patient-härledda cellinjer (PDCL) med hopp om att tillhandahålla pHGG mångfald3 i tvådimensionella (2D) linjer och/eller tredimensionella (3D) neurosfärer. Ändå efterliknar de patient-härledda in vitro cell kulturer inte alla hjärnan variabla situationer. Dessa modeller anser inte makroskopiska och mikroskopiska neuro-anatomiska miljöer som vanligtvis beskrivs i pHGG.
Vanligtvis utvecklas pHGG hos yngre barn främst i pontinska och thalamic regioner, medan ungdomar och unga vuxnaS HGG koncentrerar sig i närområdena, särskilt i frontotemporallober1. Dessa plats-specificiteter över pediatrisk ålder verkar involvera olika miljöer som leder till gliomagenesis och ett inveckling nätverk mellan tumör celler och specifika neuronal verksamhet4,5,6. Även om mekanismer fortfarande inte identifieras, utvecklas pHGG främst från neurala prekursor celler längs differentieringsbanan för astroglia och oligodendroglial härstamningar. Även om rollen för dessa glia härstamningar har länge begränsats till enkelt strukturellt stöd för nervceller, är det nu tydligt fastställt att de integreras helt i neurala kretsar och uppvisar komplexa dubbelriktade glia-neuronala interaktioner som kan omorganisera strukturella regioner i hjärnan och omforma neuronala kretsar4,7,8 . Dessutom tyder ökande strimlor av bevis på att centrala nervsystemet (CNS) spelar en avgörande roll i hjärncancerinitiering och progression. De senaste verken fokuserade på neuronal aktivitet, som verkar driva tillväxt och mitos av glia maligniteter genom utsöndrade tillväxtfaktorer och direkt elektrokemisk synaptisk kommunikation6,9. Ömsesidigt, hög kvalitet glioma celler verkar påverka neuronal funktion med en ökande glutamatergic neuronal aktivitet och modulera driften av kretsar där de är strukturellt och elektriskt integrerade9. Så, studier med patienten-härledda modeller och nya neurovetenskapliga verktyg som styr neuron åtgärder visat en krets-specifika effekt av neuronal aktivitet på glioma plats, tillväxt och progression. De flesta av dessa neuronal projektioner inblandade i gliomas är glutamatergic och kommunicera genom glutamat sekret. Specifika glutamatergiska biomarkörer som mGluR2 eller vGlut1/2 beskrivs ofta6.
Intressant nog, trots deras molekylära heterogenitet, visar pediatriska och vuxna höggradiga gliom ett typiskt proliferativt svar på glutamaterg neuronal aktivitet och andra utsöndrade faktorer som neuroligin-3 eller BDNF (hjärnan-härledd neurotrofisk faktor)4,6,10,11,12,13 . I när regioner, pediatrisk och vuxna HGGs kan inducera neuronal hyperexcitability genom en ökad glutamat utsöndring och hämma GABA interneurons leder till gliomas associerade med epileptiska nätverk verksamhet14,15. Dessutom kan neurala kretsar omformas av gliomas som driver specifika neurologiska uppgifter, till exempel språk, och kan rekvisition ytterligare organiserad neuronal aktivitet9.
Baserat på denna logik, främja förståelsen av dubbelriktad kommunikation mellan glioma celler och nervceller måste vara helt klarlagt och integreras med de tidiga stadierna av in vitro pHGG metoder. Sådan innovativ modellering är avgörande för att förstå och mäta den neuronala elektriska aktivitetspåverkan under drogtester och förutse pHGG-svar i hjärnkretsar. Den senaste utvecklingen inom neurovetenskapliga verktyg, såsom mikrofluidiska enheter och pHGG-forskningsarbete, är sängen för att utveckla nya modelleringsmetoder och nu kunna integrera hjärnmikromiljön i in vitro pHGG-modeller3,16,17,18,19. Tillsammans med elektrofysiologiska inspelningar med multielektrodmatriser (MEA), erbjuder mikrofluidiska enheter20,21,22 möjligheten att efterlikna fysiologiska förhållanden samtidigt som man registrerar den elektriska aktiviteten i hela neurala nätverket och extrahera nätverksanslutningsparametrar under flera förhållanden. Denna enhet23,24 tillåter först exakt deponering av celler i en kammare direkt på MEA. Denna teknik möjliggör kontroll av cellsåddtäthet och homogenitet på MEA och fin kontroll av medieutbyte, vilket är ett kritiskt steg för mänsklig neural stamdifferentiering direkt till enheter. Dessutom kan den nuvarande deponeringskammaren sås med flera celler vid olika tidpunkter.
Så, denna studie syftade till att utveckla en funktionell in vitro-modell samodling mänskliga Pluripotent Stem (hiPS)-härledda när glutamatergiska nervceller och pHGG-härledda celler till mikrofluidiska enheter och registrera deras elektriska aktivitet för att utvärdera elektriska interaktioner mellan båda cellpopulationerna. För det första erhölls hiPS-härledda när glutamaterg neuroner och karakteriseras i mikrofluidiska enheter i olika stadier av kultur [dag 4 (D4), som hiPS-celler och dag 21 (D21) och dag 23 (D23), som glutamatergiska mogna nervceller). För det andra steget i samkultur användes två pHGG-modeller: kommersialiserade pediatrisk UW479 linje och pHGG celler initieras från en patient tumör (BT35)3, med en H3.3 K27M drivrutin mutation. Slutligen utförde vi elektrofysiologiska inspelningar av glutamatergic celler vid D21 före pHGG cell sådd och D23 efter 48 h av samodling i samma microfluidic enhet. Interaktionerna mellan glutamatergiska nervceller och pHGG celler kännetecknades av en betydande ökning av den registrerade elektrofysiologiska aktiviteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För detta protokoll är ackrediteringsnumret för användning av mänskliga material DC-2020-4203.
1. Mikrofluidisk tillverkning, beredning och behandling av mikrofluidiska enheter
- Tillverka SU-8 formar med konventionella fotolitografitekniker18.
OBS: För detta ändamål har två fotolitografimasker utformats för att konstruera två lager av fotoresiststrukturer på kiselskivans substrat och ett tunt SU-8 2005-fotoresistskikt (3,2 μm högt och 6 ± 1 μm brett) som definierar asymmetriska mikrogroover under mönstrar av huvudkanaler tillverkade i SU-8 2100 (200 μm hög, 1 mm bred, 1 mm bred, 1 mm bred, 1 mm bred, och 13 mm lång) (se kompletterande figur S1). - Aktivera skivan med hjälp av en plasmarengörare (5,00e-1 torr, hög radiofrekvens (RF) nivå) i 1 min och silanisera den med 1 ml (triklor (1H,1H,2H,2H-perfluorotyl)silan i en aluminiummapp till en desiccator i 30 min.
- Förbered ett 10:1-förhållande av Polydimethylsiloxan (PDMS), blanda prepolymeren med katalysator, passera den i en vakuumdesiccator för att ta bort fångade bubblor och kasta den långsamt på formen innan den härdas i en ugn vid 80 °C i 40 min.
- Skär den efter det med en rakhyvel i önskad storlek innan du skalar av formen. Stansa ut inloppet och utloppszonerna för att få 3 mm breda hål, rengör PDMS och skydda det med tejp.
OBS: Tjockleken på den slutliga PDMS-enheten är ca 5 mm. - Behandla enheten med en plasmarengörare (5.00e-1 torr, Hög RF-nivå under 1 min), montera den med en polystyren Petri-skål och exponera dammsugaren under UV-ljus i 30 min.
- Fyll med en pipett inloppet på den mikrofluidiska enheten före användning med 70% etanol och töm den genom pipetteringsaspiration.
- Tvätta den mikrofluidiska enheten genom att tillsätta inloppsreservoarer Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS) och töm den genom pipetteringsambition tre gånger i följd.
- Täck enheten med 0,05 mg/ml Poly-D-Lysin och placera den i en inkubator (37 °C, 5% CO2). Efter 24 h, skölj enheten genom att lägga i inloppsbehållaren neurobasalmediet och tömma det genom pipetteringsaspiration tre gånger i följd.
- Fyll det mikrofluidiska chipet med cellodlingsmediet och låt det ligga kvar i rumstemperatur tills det används i högst 2 timmar.
2. Cellberedning och sådd i den mikrofluidiska enheten
- Kultur, sådd och immunofluorescent karakterisering av mänskliga hiPS-härledda när glutamatergiska nervceller
OBS: Utför experiment med kommersialiserade hiPS-härledda närglutala glutamaterga nervceller (Bild 1A). Bevara material som härrör från människor och hantera dem med godkännande och enligt lagstiftningens riktlinjer.- Töm inlopps- och utloppsreservoarerna i den mikrofluidiska enheten genom pipetteraspiration före sådd, så att endast enhetens kanaler kan fyllas med medium.
- Frö hiPS-cellerna på dag 0 (D0) genom att placera 10 μL av en 6,5 x 106 hiPS-celler/ml-suspension (t.ex. 900 cell/mm2-koncentration ) med mediet, vars sammansättning anges i tabell 1, och låt anordningen vara under huven (vid rumstemperatur) i 15 minuter så att cellerna kan fästas.
- Fyll efter 15 min både inlopps- och utloppsreservoarer med 50 μL D4-odlingsmedium, vars hela sammansättning anges i tabell 1, och överför enheten till inkubatorn (37 °C, 5% CO2).
- Upprätthålla glutamaterg neuron differentiering i 23 dagar (figur 1A.1, mikroskopi) under en kontrollerad miljö (37 °C, 5% CO2) och med ett specifikt cellodlingsmedium, vars sammansättning beskrivs i tabell 1. Byt ut mediet regelbundet enligt nästa steg 5. nedan och följ stegen som i figur 1B.
- Byt ut mediet var 3:e till 4:e dag efter tabell 1-kompositionen . Använd såddmedium tillS D4, D4 medium till D7, D7 medium till D11 och D11 medium under den återstående tiden av kulturen.
- Ta mikroskopiska bilder på D4, D21 och D23 med hjälp av ett standardmikroskop för faskontrast för att bedöma cellens livskraft och tillåta cellräkning.
- För karakterisering, fixa de differentierade glutamatergiska nervcellerna i 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 min vid rumstemperatur efter medelambition och följ protokollet för immunofluorescensfärgning.
- Tvätta cellerna tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och permeabilisera dem i 10 minuter med 0,1% Triton-X följt av 30 min med 3% Bovine Serum Albumin (BSA). Tillsätt primära antikroppar och inkubera enheten över natten vid 4 °C.
- Skölj cellerna tre gånger med PBS och inkubera ytterligare med motsvarande sekundära antikroppar i 2 h vid rumstemperatur.
OBS: Immunofluorescenta antikroppar som används i studien förtecknas i tabell 2. - Skölj cellerna tre gånger med PBS och mothåll med DAPI (4',6-diamino-2-fenylindole) i 10 min vid rumstemperatur.
- Skaffa bilder med ett inverterat epifluorescensmikroskop utrustat med en CMOS-kamera (Complementary metal-oxide-semiconductor) och analysera med hjälp av lämplig bildanalysprogramvara.
- Öppna DAPI-färgade bilder och binarize med tröskelvärdesrutinen i programvaran. För att göra detta klickar du på Bild > Justera > tröskelvärde och ställer in lämpliga parametrar för att skilja kärnan från bakgrunden. Klicka sedan på Apply > Process > Watershed för att dela den aggregerade kärnan.
- Därefter använder du den medfödda programvaran Analyze Particles för att tolka de binära bilderna. För att göra detta, klicka på Analysera och sedan på Analysera partiklar och ställ in lämpliga parametrar efter detta: storlek och cirkularitetsfilter (exkludera från analysobjekt mindre än 7 μm, större än 20 μm, eller med en cirkularitet mindre än 0,1 μm).
- Sammanfoga kontur bilder som erhållits från DAPI analys till korrespondent immunofluorescent bilder för att validera rätt färgning.
- Slutligen, spara tillhörande data (antal objekt, medelvärdesområde, % av täckningen osv.) för de olika biomarkörerna och kvantifiera uttrycket vid D4 och/eller D21 med hjälp av lämplig kvantifieringsprogramvara.
- Cellkultur av kommersialiserad pHGG-linje, UW479, och patientbaserad cellinje, BT353
- Odla båda cellinjerna i DMEM/F-12 GlutaMAX kompletterat med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) i en cellodlingskolv. Vänta på 80% sammanflöde av varje cellinje som presenteras i figur 1C.
- Underhåll dessa pHGG-celler under en kontrollerad miljö vid 37 °C under normoxiska förhållanden under hela experimenten.
3. Samkulturprotokoll
- Justera sådddagen och koncentrationen för UW479 och BT35 cellinjer för att nå 80% av de konfluenta cellerna när samkulturen ska starta, motsvarande 21 dagars odling för glutamatergiska nervceller.
- Trypsinize UW479 och BT35 celler och så dem på toppen av glutamatergiska nervceller i varje dedikerad mikrofluidisk enhet (med en måltäthet på 900 cell/mm2 för varje celltyp) innan du sår pHGG-cellerna i den mikrofluidiska enheten som innehåller mogna glutamatergiska nervceller.
- Bevara samkulturerna i 2 dagar under en kontrollerad miljö (37 °C, 5% CO2) med glutamaterg neuron D11 och framåt medium som beskrivs i tabell 1.
- Räkna pHGG-celler med hjälp av de mikroskopiska bilderna som analyseras med en bildanalysprogramvara för att bedöma deras livskraft. Beräkna procentandelen celler.
OBS: Använd följande formel: 100 - ((antal celler vid D23 / antal celler vid D21) x 100).
4. Elektrofysiologisk inspelning
- Utför den elektrofysiologiska inspelningen med ett kommersiellt system och kommersiellt tillgänglig programvara.
OBS: Experimenten utfördes med en MEA som bestod av elektroder med diametern 30 μm med en diameter på 100 μm. - Utför en första elektrofysiologisk inspelning på glutamatergiska nervceller vid D21 före sådd av pHGG-celler. Använd de differentierade glutamatergiska nervcellerna som kontroll och odla dem ensamma parallellt med samkulturen. Gör en andra inspelning för båda villkoren enligt beskrivningen i nästa steg numrerad 3.
- Utför en andra elektrofysiologisk inspelning vid D23 (efter 2 dagars samkultur).
5. Elektrofysiologisk databehandling
- Filtrera rådata med ett 2:a ordningens Band-pass Butterworth-filter (med passbandsfrekvenser på 100 Hz och 2500 Hz).
- För toppidentifiering beräknar du signalens rotmedel kvadrat över 10 min-inspelningen för varje elektrod och ställer in en amplitudtröskel som motsvarar åtta gånger detta rotmedels kvadratvärde.
- Använd en PTSD-algoritm (Precision Timing Spike Detection25), med en maximal varaktighet på 2 ms för en åtgärdspotential.
- Betrakta som en aktiv elektrod, varje elektrod detekterar minst 5 spikar / min. Fortsätt analysen om minst 10% av inspelningselektroderna är aktiva.
- Dividera antalet upptäckta spikar med inspelningstiden för att beräkna den genomsnittliga avfyrningshastigheten för varje aktiv elektrod. Beräkna en genomsnittlig genomsnittlig avfyrningshastighet för varje oberoende experiment. I slutändan beräknar du ett genomsnitt efter villkor (±SEM) och uttrycker det som en funktion på inspelningsdagen.
- Beräkna en rasterplot för varje experiment som representerar de händelser som detekteras för varje aktiv elektrod som en funktion av tiden. Beräkna sedan de temporala matrisomfattande avfyrningshastigheterna (eller momentana avfyrningshastigheter) för alla aktiva elektroder, vilket gör det möjligt att övervaka synkroniciteten hos neural nätverksaktiviteten.
- Slutligen generera stapeldiagram med hjälp av kvantifieringsprogramvaran och utför jämförelser med Kruskal Wallis-tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan studera elektriska interaktioner mellan glutamatergic nervceller och glioma celler, hiPS-härledda när glutamaterg neuroner karakteriserades för att validera möjligheten att odla dem i mikrofluidiska enheter (figur 1A). Deras karakterisering bedömdes med Nestin, Sox2, mGlurR2 (metabotropiska glutamatreceptorer 2) och vGLUT1 immunostaining, representerade i figur 1A(2-7). Eftersom Nestin är ett mellanliggande filamentprotein som krävs för överlevnad, förnyelse och mitogenstimulerad spridning av neurala stamceller, uttrycks det således i odifferentierade CNS-celler under utveckling. Sox2 är medlem i SRY-liknande HMG-box gen (SOX) transkription faktor familj som är involverade i regleringen av embryonal utveckling, och det uttrycks främst i omogna och odifferentierade celler i neurala epitel i CNS. mGluR2 är utbredd i hela hjärnan, med högt uttryck i cortex och hippocampus. Vanligtvis definierar det de presynaptiska cellerna med deras neuronala excitabilitet och synaptiska överföring (t.ex. glutamatergiska nervceller). vGLUT1 används också som glutamaterg biomarkör. Därför fokuserar figur 1 på glutamaterga nervceller med Nestin- och Sox2-uttryck vid D4 och D21 för att validera deras progressiva differentiering i odlingsförhållandena (figur 1A(2-4). Nestinpositiv cells andel minskade från 5,4 ± 0,4% vid D4 till 0,69 ± 0,3% vid D21 (p < 0,01, figur 1A5). På samma sätt minskade andelen Sox2-positiva celler från 12, 2 ± 2, 1% vid D4 till 5,5 ± 1,7% vid D21 (p < 0, 05, se figur 1A6). Uttrycket av mGluR2 upptäcktes i 45,4 ± 4, 7% av glutamatergic celler vid D21 (data visas inte), och en större vGLUT1 immunstaining observerades under glutamatergic differentiering vid D21. Dessa resultat visade att andelen neurala stamceller förblev låg och att de flesta celler var väl differentierade efter en 21-dagars kultur i de mikrofluidiska enheterna. I figur 1B beskrivs UW479- eller BT35-cellsådden i mikrofluidiska enheter vid D21 i ett allmänt protokoll för multistegskokulturer och elektrofysiologisk registrering. Dessa cellinjer (figur 1C) har redan beskrivits och är jämförbara med de tidigare iakttagelserna från oss 3,19. I slutändan erhölls två elektrofysiologiska inspelningar: en vid D21 före samodling och den andra vid D23 efter 48 h av pHGG cellinje sådd.
För att förstå och följa rörlighet och livskraft av BT35, UW479 och glutamaterg neuroner under samkulturer, mikroskopiska bedömningar utfördes regelbundet under den elektrofysiologiska inspelningsperioden från D21 till D23 och presenteras i figur 2. De mikroskopiska bilderna visade en progressiv förlängning och särskild fördelning av glutamatergiska nervceller över mikrofluidiska enheter (figur 2A). Glutamatergiska celler bildar vissa aggregat gradvis på ett liknande sätt i samkulturen och när de odlas ensamma fram till D23 (kontrollexperiment). I figur 2B, C, när man lägger till BT35 och UW479, observerades att de flytande cellerna som finns omedelbart efter gliomcellernas sådd vid D21 gradvis försvann fram till D23 och blev vidhäftande pHGG-celler i enheten. Detta var särskilt anmärkningsvärt för UW479-linjen.
Dessutom fanns det ingen ökning av flytande celler efter alla elektrofysiologiska inspelningar vid D23 (data visas inte). Andelen livskraftiga celler i figur 2D uppskattades dock till 83, 02 % respektive 85,16 % för BT35 respektive UW479. Båda linje viabilities var jämförbara och betonade det faktum att patientens-härledda cellinjer kan användas på lämpligt sätt. Den tekniska beredningen av mikrofluidiska enheter kopplade till MEA och cellmanipulationer ändrar inte deras vidhäftningskapacitet. Det verkar inte inducera celldöd eller ändra deras mikroskopiska aspekter. BT35 och UW479 celler verkar kartlägga de exakta platserna för glutamaterg neuroner i enheten, migrera nära till excitatoriska nervceller.
Figur 3 beskriver som ett exempel UW479/glutamaterg neuron co-cultures med deras spikdetektering längs inspelningstiden i figur 3A och dess raster plot vid D23 i figur 3B, som visar ökad elektrisk aktivitet när man lägger till pHGG-celler. Figur 3C presenterar den tidsmässiga matris-wide avfyrning hastighet i BT35/glutamaterg neuron co-cultures. Skillnaderna mellan kontrollexperimentet (glutamatergiska nervceller) och samkulturer av glutamatergiska nervceller med pHGG-celler är betydande vid registrering av D23 elektrisk aktivitet, som visas i figur 3D, vilket indikerar en inverkan av pHGG på neuron excitabilitet.
| Komponenter | Såddmedium | D4 medium | D7 medium | D11 och framåt medium |
| DMEM/F-12 Medium | 0,5x | 0.25x | 0.125x | Ø |
| Neurobasal Medium | 0,5x | 0.25x | 0.125x | Ø |
| BrainPhys Medium | Ø | 0,5x | 0.75x | 1x |
| SM1 Tillägg | 1x | 1x | 1x | 1x |
| N2 Tillägg-A | 1x | 1x | 1x | 1x |
| Ala-Gln (GlutaMax) | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM | 0,5 mM |
| BDNF | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| GDNF | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| TGF-β1 | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL | 1 ng/mL |
| Geltrex | 30 μg/ml | Ø | Ø | Ø |
| Sådd tillägg | 1x | Ø | Ø | Ø |
| Tillägg dag 4 | Ø | 1x | Ø | Ø |
Tabell 1: Kulturmediesammansättning för hiPS-härledda glutamatergiska nervceller.
| Antikroppar | Koncentrationer av bestånd | Utspädningar av arbetet |
| Nestin | 0,5 mg/ml | 1:500 |
| (1 μg/ml) | ||
| Sox2 | 1 mg/ml | 1:500 |
| (2 μg/ml) | ||
| mGluR2 | 0,2 mg/ml | 1:50 |
| (4 μg/ml) | ||
| vGlut1 | 0,25 mg/ml | 1:50 |
| (5 μg/ml) | ||
| Åsne antikanin IgG H&L (AF 647) | 2 mg/ml | 1:1000 till 1:2000 |
| (1 till 2 μg/ml) | ||
| Åsna antimus IgG H&L (AF 555) | 2 mg/ml | 1:1000 |
| (2 μg/ml) |
Tabell 2: Förteckning över immunfluorescenta antikroppar.
Figur 1: Cell karakterisering och samkultur protokoll glutamatergic nervceller och hög kvalitet pediatrisk gliom (pHGG) linjer. (A) Förutsättning mikroskopiska och immunofluorescent karakterisering av glutamatergic nervceller. (1) Mikroskopiska bilder på dag 21 (D21) och dag 23 (D23) av glutamatergiska nervceller. (2) Nestin-märkning i grönt och DAPI i blått vid D4 (övre raden) och D21 (nedre raden). (3) Sox2-märkning i grönt och DAPI i blått vid D4 (övre raden) och D21 (nedre raden). (4) mGluR2-märkning i grönt och DAPI i blått vid D21. (5 och 6) Statistiska jämförelser mellan Nestin och Sox2 märkning vid D4 och D21 av kultur, visar cell differentiering. (7) vGlut1 färgning i grönt och DAPI i orange vid D21. (B) Allmänt protokoll för elektrofysiologisk registrering för att studera interaktioner vid samodling glutamatergiska nervceller och gliomceller på enheter. C) Nödvändiga mikroskopiska aspekter av cellinjerna BT35 och UW479. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Mikroskopiska bilder av glutamatergiska celler och gliomceller odlade i mikrofluidiska enheter kopplade till multielektrodmatriser (MEA). Glutamatergiska nervceller differentieras och odlas ensamma i den mikrofluidiska enheten fram till dag 21 (D21). (A) För denna experimentella kontroll tillsattes endast mediet till glutamatergiska celler vid D21, medan antingen BT35 (B) eller UW479 (C) cellinjer tillsattes i deras respektive villkor. Bilder på D22 och D23 utfördes före de elektrofysiologiska register för varje villkor. Alla bilder erhölls med hjälp av ett klassiskt faskontrastmikroskop. (D) Tumör cell livskraft för BT35 och UW479 vid D23 uppskattades med hjälp av ett automatiserat antal med bildanalys programvara. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Elektrofysiologisk inspelning. (A) Spike detection längs inspelningstiden i UW479/glutamaterg neuron co-cultures. (B) Ett exempel på den beräknade rasterplotten vid D23 representerar de händelser som detekteras för varje aktiv elektrod som en funktion av tiden i UW479/glutamaterg neuron co-cultures. C) Temporal matrisomfattande avfyrningshastighet (eller momentan avfyrningshastighet) för alla aktiva elektroder som registrerar elektrisk aktivitet i BT35/glutamaterg neuron co-kulturer, vilket gör det möjligt att övervaka synkroniciteten hos neural nätverksaktiviteten. (D) Stapeldiagram över genomsnittlig avfyrningshastighet i kontrolltillståndet (t.ex. kulturen hos glutamaterga nervceller) och när tumöral UW479-cellinje (i grönt) och BT35-cellinje (i rött) tillsätts. Uppgifterna visas som medelvärde ± SEM. (* p < 0,05). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande figur S1: 3D (3-dimensionell) representation av SU-8 formar. (A) Skapande och bild av SU-8 formar med AutoCAD programvara. B) Bild av SU-formarna med de två skikten av fotoresiststrukturer och fyra hål med 3 mm bredd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver en korrekt funktionella in vitro modell att utvärdera interaktionen mellan mänskliga hiPS-härledda när glutamatergic nervceller och hjärnan tumöral celler i microfluidic enheter. Ett av de avgörande stegen i detta protokoll var hiPS differentiering i glutamatergic nervceller, som bekräftades av minskningen av Nestin och Sox2 immunofluorescent färgning och samtidiga utseende av mGluR2 och vGLUT1 färgning. Ändå återstod få neurala stamceller som endast hälften av de glutamatergic cellerna uttryckt mGluR2, vilket innebär en heterogen neuron cellpopulation. Sammantaget betonar dessa resultat att särskild omsorg måste ägnas åt glutamaterg celltillväxt i sådana enheter. Dessutom var nästa steg som studerar neuroners elektriska beteende i närvaro av pHGG-celler relativt arbetsintensivt att ställa in databehandlingen för att optimera spikdetektering och tolkning. Ändå, som förväntat och beskrivs i andra nyligen publicerade verk4,5,6,9,10, ökar förekomsten av pHGGs och glutamatergic nervceller elektrisk aktivitet som bekräftar excitatoriska funktionen hos dessa nervceller.
Den största begränsningen av denna modellering kan vara den heterogena fördelningen av nervceller på MEA själv som kan påverka elektrofysiologiska inspelningar. Det skulle kräva underhåll av högdensitetskultur i den mikrofluidiska enheten. För sådd av en sekundär celltyp på enheten är det viktigt att upprätthålla en snabb spridning och migrering initialt i 48 timmar och få som för nervceller en homogen fördelning i 48 h-tekniken för registrering. En annan begränsning är att skilja de olika typerna av cellpopulationer i sådana enheter visuellt, men nya metoder med fluorescerande nanopartiklar kan hjälpa till att följa båda celltyperna26. Slutligen gjordes prestandan hos denna microfluidic strategi endast i två typer av phGG linjer och bör utvidgas till mer patient-härledda cellinjer med olika molekylära drivrutiner. Kompletterande bedömningar kan göras för att förstå denna excitatoriska effekt när man samkulterar dessa celler. Det är dock möjligt med pHGG-celler med en H3.3 K27M drivrutin mutation, såsom i BT35 linje3.
Den övergripande metod som utvecklats i detta arbete är ett av de nya metoderna för att utforska den elektriska påverkan. Det har visat kapaciteten av neurala nätverk analys att transducera interaktionen mellan hiPS-härledda glutamatergic nervceller och pHGG tumoral cellinjer i mikrofluidic kultur villkor. Denna metod är användbar för många applikationer, särskilt för funktionella och mekanistiska studier och för att analysera effekterna av farmakologiska medel som kan blockera pHGG-cellmigration och interaktion med nervceller. Det betonar användningen av mikrofluidiska enheter, men särskilt när experiment kan registrera den elektrofysiologiska aktiviteten och kan läggas till en MEA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD är anställda av NETRI, FL är Chief Technology Officer på NETRI och TH är Chief Scientific Officer på NETRI. De andra författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Satt Conectus program, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» och «Semeurs d'Etoile» föreningar. Vi tackar de barn och familjer som drabbats av tungagg för deras bidrag till denna forskning och deras stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
| Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex's lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, Suppl 10 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M.
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
