बाकुलोवायरस-कीट सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी) 2 वेक्टर के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए प्रक्रिया विकास
Summary
इस प्रोटोकॉल में, AAV2 वेक्टर को सह-संस्कृति स्पोडोप्टेरा मितव्ययीperda (Sf9) कीट कोशिकाओं द्वारा बाकुलोवायरस (बीवी)-AAV2-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या चिकित्सीय जीन और BV-AAV2-rep-टोपी संक्रमित Sf9 कोशिकाओं के साथ निलंबन संस्कृति में उत्पादित Sf9 कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किया जाता है । एएवी कणों को डिटर्जेंट का उपयोग करके कोशिकाओं से छोड़ा जाता है, स्पष्ट किया जाता है, आत्मीयता कॉलम क्रोमेटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया जाता है, और स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन द्वारा केंद्रित किया जाता है।
Abstract
Adeno से जुड़े वायरस (AAV) जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए वैक्टर का वादा कर रहे हैं । यहां, AAV2 वेक्टर Sf9 कोशिकाओं के साथ Sf9 कोशिकाओं के साथ Sf9 कोशिकाओं की सह संस्कृति द्वारा उत्पादित है baculovirus (BV-AAV2-GFP (या चिकित्सीय जीन) और बीवी-AAV2-rep-टोपी सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में । कोशिकाओं को एक कक्षीय शेखर या वेव बायोरिएक्टर में एक फ्लास्क में सुसंस्कृत किया जाता है। एएवी कणों को छोड़ने के लिए, उत्पादक कोशिकाओं को बफर युक्त डिटर्जेंट में lysed किया जाता है, जिसे बाद में कम गति वाले अपकेंद्री और निस्पंदन द्वारा स्पष्ट किया जाता है । एएवी कणों को एवीबी सेफ्रॉस कॉलम क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके कोशिका से शुद्ध किया जाता है, जो एएवी कणों को बांधता है। बाध्य कणों को पीबीएस से धोया जाता है ताकि संदूषकों को हटाया जा सके और पीएच 3.0 पर सोडियम साइट्रेट बफर का उपयोग करके राल से एल्यूट किया जा सके। अम्लीय एल्यूएट को क्षारीय ट्रिस-एचसीएल बफर (पीएच 8.0) के साथ निष्प्रभावी किया जाता है, जो फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ पतला होता है, और आगे स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन (टीएफएफ) के साथ केंद्रित होता है। प्रोटोकॉल मानव जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर नैदानिक ग्रेड एएवी विनिर्माण के लिए पैमाने के साथ संगत छोटे पैमाने पर पूर्व नैदानिक वेक्टर उत्पादन का वर्णन करता है ।
Introduction
एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) गैर-छांग मानव पर्वोवायरस हैं जिनमें 4.6 केबी का एक-फंसे डीएनए होता है। एएवी वैक्टर जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए अन्य वायरल वैक्टर 1 ,2,3,4के लिए कई फायदे हैं। AAVs स्वाभाविक रूप से प्रतिकृति-अक्षम हैं, जिससे प्रतिकृति के लिए एक सहायक वायरस और मेजबान मशीनरी की आवश्यकता होती है। एएवी से कोई बीमारी नहीं होती है और संक्रमित मेजबान3,5में इम्यूनोजेनिसिटी कम होती है . एएवी शांत और सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं दोनों को संक्रमित कर सकता है और मेजबान कोशिकाओं के जीनोम में एकीकृत किए बिना एपिसोम के रूप में बना रह सकता है (एएवी शायद ही कभी मेजबान जीनोम में एकीकृत होता है)1,3। इन सुविधाओं ने एएवी को जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए एक वांछनीय उपकरण बना दिया है।
एएवी जीन ट्रांसफर वेक्टर उत्पन्न करने के लिए, चिकित्सीय जीन सहित ट्रांसजीन कैसेट को दो आंतरिक टर्मिनल रिपीट्स (आईटीआर) के बीच क्लोन किया जाता है, जो आमतौर पर एएवी सेरोटाइप 2 से प्राप्त होता है। ट्रांसजीन सीक्वेंस सहित 5 ‘ आईटीआर से 3 ‘ आईटीआर का अधिकतम आकार ४.६ केबी6है । अलग-अलग कैप्सिड में एक अलग सेल या टिश्यू ट्रॉपिज्म हो सकता है। इसलिए, कैप्सिड को एएवी वेक्टर7के साथ लक्षित करने के उद्देश्य से ऊतक या सेल प्रकार के आधार पर चुना जाना चाहिए।
Recombinant AAV वैक्टर आमतौर पर मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं के रूप में स्तनधारी कोशिका लाइनों में उत्पादित कर रहे हैं, HEK293 एएवी जीन हस्तांतरण वेक्टर, एएवी प्रतिनिधि टोपी, और सहायक वायरस प्लाज्मिड्स2,3के क्षणिक ट्रांसफेक्शन द्वारा । हालांकि, अनुयायी HEK293 कोशिकाओं के क्षणिक ट्रांसफैक्शन द्वारा बड़े पैमाने पर एएवी उत्पादन के लिए कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, बड़ी संख्या में सेल स्टैक या रोलर बोतलों की आवश्यकता होती है। दूसरा, उच्च गुणवत्ता वाले प्लाज्मिड डीएनए और ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स की जरूरत होती है, जिससे मैन्युफैक्चरिंग की लागत बढ़ जाती है । अंत में, अनुयायी HEK293 कोशिकाओं का उपयोग करते समय, सीरम को इष्टतम उत्पादन के लिए अक्सर आवश्यक होता है, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण1,2, 3को जटिल बना दियाजाताहै। एएवी विनिर्माण की एक वैकल्पिक विधि में कीट कोशिका रेखा, स्पोडोप्टेरा फ्रुगिपेरा (एसएफ 9) कोशिकाओं का उपयोग करना शामिल है, और एक कीट वायरस जिसे रीकॉम्बिनेंट ऑटोग्राफा कैलिफोर्निका मल्टीकैप्सिड न्यूक्लियर पॉलीहेड वायरस (एसीएमएनपीवी या बाकुलोवायरस)8,9,10कहा जाता है। Sf9 कोशिकाओं सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में बड़े हो रहे है कि बड़े पैमाने पर आसान है और एक बड़े पैमाने पर वर्तमान अच्छा विनिर्माण अभ्यास (सीजीएमपी) उत्पादन के साथ संगत है, जो प्लाज्मिड या ट्रांसफैक्शन अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, Sf9-baculovirus प्रणाली का उपयोग कर एएवी उत्पादन की लागत HEK293 कोशिकाओं11में प्लाज्मिड के क्षणिक ट्रांसफेक्शन का उपयोग करने की लागत से कम है ।
बाकुलोवायरस-एसएफ 9 कोशिकाओं का उपयोग करके मूल आरएवी उत्पादन प्रणाली में तीन बाकुलोवायरस का उपयोग किया गया: एक बाकुलोवायरस जिसमें जीन ट्रांसफर कैसेट होता है, दूसरा बाकुलोवायरस जिसमें प्रतिनिधि जीन होता है, और तीसरा बाकुलोवायरस जिसमें सेरोटाइप-विशिष्ट कैप्सिड जीन12,13होता है। हालांकि, प्रतिनिधि निर्माण युक्त बाकुलोवायरस मार्ग के कई दौर पर आनुवंशिक रूप से अस्थिर था, जिसने बड़े पैमाने पर एएवी उत्पादन के लिए बाकुलोवायरस के प्रवर्धन को रोका। इस मुद्दे को हल करने के लिए, एक उपन्यास आरएवी वेक्टर प्रणाली विकसित की गई थी, जिसमें दो बाकुलोवायरस (टूबाक) शामिल थे: एक बाकुलोवायरस जिसमें एएवी जीन ट्रांसफर कैसेट और एक अन्य बाकुलोवायरस होता है जिसमें एवीवी प्रतिनिधि-कैप जीन एक साथ होते हैं जो मूल प्रणाली की तुलना में आनुवंशिक रूप से अधिक स्थिर होते हैं और तीन14के बजाय टूबाक का उपयोग करने के कारण rAAV का उत्पादन करने के लिए अधिक सुविधाजनक होतेहैं। 15. वनबाक प्रणाली एएवी जीन ट्रांसफर कैसेट और एक ही बाकुलोवायरस में निरसित-कैप जीन का उपयोग करती है जो दोबाक या थ्रीबाक2 ,16,17का उपयोग करने के बजाय एक बाकुलोवायरस का उपयोग करने के कारण आरएवी का उत्पादन करने में अधिक सुविधाजनक है। हमारे अध्ययन में, टूबाक सिस्टम का उपयोग अनुकूलन के लिए किया गया था।
एएवी उत्पादन के लिए बाकुलोवायरस प्रणाली की भी सीमाएं हैं: बालुलोवायरस कण सीरम-मुक्त माध्यम11में दीर्घकालिक भंडारण के लिए अस्थिर हैं, और यदि बाकुलोवायरस टाइटर कम है, तो बाकुलोवायरस सुपरनेट की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, जो एएवी उत्पादन (व्यक्तिगत अवलोकन) के दौरान एसएफ 9 कोशिकाओं के विकास के लिए विषाक्त हो सकती है। टाइटर-कम संक्रमित-कोशिका संरक्षण और स्केल-अप (टिप्स) कोशिकाओं, या बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं (बीआईआईसी) का उपयोग, एएवी उत्पादन के लिए एक अच्छा विकल्प प्रदान करता है जिसमें बाकुलोवायरस-संक्रमित एसएफ9 कोशिकाएं तैयार की जाती हैं, क्रायोप्रेयर्ड, और बाद में ताजा Sf9 कोशिकाओं के संक्रमण के लिए उपयोग किया जाता है। एक अन्य लाभ क्रायोप्रिजर्वेशन10, 11के बाद एसएफ 9 कोशिकाओं में बाकुलोवायरस (बीवी) की बढ़ी हुईस्थिरताहै।
एएवी उत्पादन को सक्षम करने के लिए दो प्रकार की टिप्स कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं: बीवी-एएवी 2-जीएफपी या चिकित्सीय जीन के साथ Sf9 कोशिकाओं के संक्रमण से पहला, और बीवी-एएवी2-प्रतिनिधि-कैप के साथ Sf9 सेल के संक्रमण से दूसरा। टिप्स कोशिकाओं को छोटे और तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एलिकोट्स में क्रायोप्रेयर किया जाता है। एएवी वैक्टर सीरम-मुक्त निलंबन संस्कृति में एक कक्षीय शेखर या वेव बायोरिएक्टर में रखे गए फ्लास्क में सह-संस्कृति युक्तियों कोशिकाओं द्वारा उत्पादित होते हैं जो बाकुलोवायरस और ताजा एसएफ 9 कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। Sf9 कोशिकाओं baculoviruses कि AAV2-GFP वेक्टर और प्रतिनिधि टोपी दृश्यों को ले एएवी उत्पन्न करने के लिए ले से संक्रमित हैं । चार से पांच दिन बाद जब एएवी की पैदावार सबसे ज्यादा होती है तो उत्पादक कोशिकाओं को एएवी कणों को छोड़ने के लिए डिटर्जेंट के साथ lysed किया जाता है । बाद में कम गति वाले अपकेंद्रित्र और निस्पंदन द्वारा सेल lysate को स्पष्ट किया जाता है। एएवी कणों को एवीबी सेफ्रॉस कॉलम क्रोमेटोग्राफी द्वारा लिसेट से शुद्ध किया जाता है। अंत में, एएवी वैक्टर TFF का उपयोग कर केंद्रित कर रहे हैं। प्रोटोकॉल एक छोटे पैमाने पर एएवी के उत्पादन का वर्णन करता है, अनुसंधान और पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए उपयोगी है । हालांकि, जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए नैदानिक ग्रेड एएवी वैक्टर के निर्माण के साथ विधियां स्केलेबल और संगत हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
उत्पादन, शुद्धिकरण, और एएवी वैक्टर की एकाग्रता की प्रक्रिया के विकास के लिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल मापदंडों जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए AAV वैक्टर के दोनों छोटे और बड़े पैमाने पर विनिर्माण के लिए ल…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ रॉबर्ट एम कोटिन (राष्ट्रीय हृदय, रक्त और फेफड़े संस्थान, NIH) उदारता से हमें AAV प्लाज्मिड्स और डेनिएल Steele और रेबेका अर्नेस्ट (सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल) उनकी तकनीकी सहायता के लिए प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । यह काम सिनसिनाटी चिल्ड्रन रिसर्च फाउंडेशन से एमएन तक स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
References
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
- Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
- Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
- Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
- Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
- Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
- Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
- Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
- Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
- Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
- Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
- Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).
