Summary
このプロトコルでは、AAV2ベクターは、バキュロ ウイルス (BV)-AAV2-緑色蛍光タンパク質(GFP)または治療遺伝子およびBV-AAV2-Rep-cap感染したSf9細胞を懸濁培養中にSf9細胞と共培養することによって産生される。AAV粒子は、洗浄剤を使用して細胞から放出され、精製され、親和性カラムクロマトグラフィーによって精製され、接線流ろ過によって濃縮される。
Abstract
アデノ関連ウイルス(AAV)は、遺伝子治療用途に有望なベクターです。ここで、AAV2ベクターは、BV-AAV2-GFP(または治療遺伝子)とBV-AAV2-rep-capを無血清懸濁液培養においてBf9細胞に感染させたSf9細胞を有する スポドプテラ・フルギペルダ (Sf9)細胞の共培養によって産生される。細胞は、軌道シェーカーまたはウェーブバイオリアクター内のフラスコで培養される。AAV粒子を放出するために、生産者細胞は、後に低速遠心分離および濾過によって明らかにされる洗剤を含む緩衝液中に取り込まれる。AAV粒子は、AAV粒子を結合するAVBセファローズカラムクロマトグラフィーを使用して細胞溶解物から精製される。結合粒子をPBSで洗浄し、pH3.0でクエン酸ナトリウムバッファーを使用して汚染物質を除去し、樹脂から溶出する。酸性溶出物はアルカリ性Tris-HCl緩衝液(pH-8.0)で中和し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、さらに接線流ろ過(TFF)で濃縮する。このプロトコルは、ヒト遺伝子治療用途向けの大規模臨床グレードのAAV製造に対するスケールアップと互換性のある小規模な前臨床ベクター産生を記述する。
Introduction
アデノ関連ウイルス(AAV)は、4.6kbの一本鎖DNAを含む非エンベロープヒトパルボウイルスである。AAVベクターは、遺伝子治療アプリケーション1、2、3、4に対する他のウイルスベクターに対していくつかの利点があります。AAV は自然にレプリケーションを行う必要がなっており、それにより、レプリケーションにはヘルパー ウイルスとホストマシンが必要になります。AAVは、感染した宿主3,5において疾患を引き起こせず、免疫原性が低い。AAVは静止細胞と積極的に分裂する細胞の両方に感染し、宿主細胞のゲノムに統合することなくエピソームとして持続する(AAVはめったに宿主ゲノムに統合しない)1,3。これらの特徴はAAVを遺伝子治療の適用のための望ましい用具にした。
AAV遺伝子導入ベクターを生成するために、治療用遺伝子を含むトランスジーンカセットは、2つの内部末端反復(ITR)の間でクローニングされ、これは典型的にはAAV血清型2に由来する。5' ITR から 3' ITR までの最大サイズは、トランスジーン配列を含めて 4.6 kb6 です。異なるキャプシドは、異なる細胞または組織のトロピズムを有することができる。したがって、カプシドは、AAVベクター7で標的とされることを意図した組織または細胞タイプに基づいて選択されるべきである。
組換えAAVベクターは、ヒト胚性腎臓細胞などの哺乳動物細胞株において一般的に産生されるが、HEK293はAAV遺伝子導入ベクターの一過性トランスフェクションによって、AAV rep-cap、およびヘルパーウイルスプラスミド2,3である。しかしながら、付着性HEK293細胞の一過性トランスフェクションによる大規模なAAV産生にはいくつかの制限がある。まず、多数のセルスタックまたはローラーボトルが必要です。第2に、高品質のプラスミドDNAとトランスフェクション試薬が必要であり、製造コストが増加します。最後に、付着性HEK293細胞を使用する場合、血清は最適な生産のために頻繁に必要とされ、下流処理1、2、3を複雑にする。AAV製造の代替方法は、昆虫細胞株、スポドプテラ・フルギペルダ(Sf9)細胞、および組換えオートグラフ・カリフォルニカ多重重体核多重体症ウイルス(AcMNPVまたはバクロウイルス)8、9、10と呼ばれる昆虫ウイルスを使用することを含む。Sf9細胞は、スケールアップが容易で、現在の良好な製造実践(cGMP)生産と大規模な製造に対応する無血清懸濁液培養で増殖し、プラスミドやトランスフェクション試薬を必要としません。また、Sf9-バキュロウイルス系を用いたAAV産生のコストは、HEK293細胞11へのプラスミドの一過性トランスフェクションを用いたコストよりも低い。
バキュロウイルス-Sf9細胞を用いた元のrAAV産生系は、3つのバキュロウイルスを用いた:遺伝子導入カセットを含む1つのバキュロウイルス、Rep遺伝子を含む第2のバキュロウイルス、および血清型特異的キャプシド遺伝子12、13を含む第3のバキュロウイルス。しかし、rep構築物を含むバキュロウイルスは、複数の通過時に遺伝的に不安定であったため、大規模なAAV産生のためのバキュロウイルスの増幅を妨げた。この問題を解決するために、2つのバキュロウイルス(TwoBac)を含む新しいrAAVベクターシステムが開発されました:AAV遺伝子導入カセットを含む1つのバキュロウイルスと、元のシステムよりも遺伝的に安定しており、3つの14の代わりにTwoBacを使用しているためにrAAVを生成するのに便利なAAVレップ遺伝子を含む別のバキュロウイルス、 15.OneBacシステムは、単一のバキュロウイルスにおいてAAV遺伝子導入カセットおよびRep-cap遺伝子を用い、TwoBacまたはThreeBac2、16、17を使用する代わりに1つのバキュロウイルスを使用するため、rAAVを産生する方が便利である。我々の研究では、TwoBacシステムは最適化のために使用された。
AAV産生のためのバキュロウイルスシステムにも制限があります:バキュロウイルス粒子は、無血清培地11中で長期保存のために不安定であり、バキュロウイルス価が低い場合、大量のバキュロウイルス上清が必要であり、AAV産生中にSf9細胞の増殖に毒性を持つ可能性があります(個人的な観察)。価動菌を使用して、増殖を防除する感染細胞保存とスケールアップ (TIPS) 細胞、またはバキュロウイルス感染昆虫細胞 (BIIC) は、バキュロウイルスに感染した Sf9 細胞を調製し、凍結保存し、その後、新鮮な Sf9 細胞の感染に使用する AAV 産生に適した選択肢を提供します。もう一つの利点は、凍結保存10、11の後のSf9細胞におけるバキュロウイルス(BV)の安定性の増加である。
AAV産生を可能にする2種類のTIPS細胞が生成される:BV-AAV2-GFPまたは治療遺伝子によるSf9細胞の感染による最初の細胞と、BV-AAV2-rep-capによるSf9細胞の感染による第2の細胞。TIPS細胞は、小さくてすぐに使えるアリコートで凍結保存されています。AAVベクターは、バキュロウイルスおよび新鮮なSf9細胞を産生するTIPS細胞を共培養することによって、軌道シェーカーまたはウェーブバイオリアクターに置かれたフラスコ中の無血清懸濁液培養で産生される。Sf9細胞はAAV2-GFPベクターとRep-cap配列を運ぶバキュロウイルスに感染してAAVを生成する。4~5日後、AAV収量が最も高い場合、生産者細胞は洗浄剤で洗浄され、AAV粒子を放出する。細胞のライセートは、その後、低速遠心分離および濾過によって明らかにされる。AAV粒子は、AVBセファローズカラムクロマトグラフィーによって溶解物から精製される。最後に、AAV ベクターは TFF を使用して濃縮されます。プロトコルは、研究や前臨床試験に有用な小規模でのAAVの生産を記述します。しかし、この方法は、遺伝子治療用途向けの臨床グレードのAAVベクターの製造と拡張性と互換性があります。
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Protocol
プロトコルの概要を示す図については、 図 1 を参照してください。
1. バキュロウイルスに感染したTIPS細胞の生成
- Sf9細胞のバイアルを1本解凍し、50mLの昆虫細胞培地にすぐに播種します。Sf9細胞を軌道シェーカーインキュベーターで125 rpmで成長させ、丸底フラスコでは28°C、空気8,9の交換用に緩く取り付けられたキャップを持つ。200 mLの培地を含む1Lフラスコで細胞を伝播し、TIPS細胞産生に十分な細胞を得る。
- 2つのフラスコに2 x 106 細胞/mLのSf9細胞の50 mLを加える:BV-AAV2-GFP(または治療遺伝子)の0.5 mLとBV-AAV2-rep-capの他のフラスコを有するSf9細胞の1フラスコに感染させる。
注:AAVベクタープラスミドは、ロバート・M・コティン博士(NIH)によって寛大に提供されました。バキュロウイルスのバキュロウイルスの生産はバクミドDNA(Bac-to-Bacシステム)から8,9.通過中のバキュロウイルスの安定性は、rAAVのスケールアップ生産にとって重大な問題である。バキュロウイルスの通過数を低くする方が良いです(通過番号4まで)。TIPS細胞産生中にフローサイトメトリー(図2)を用いてバキュロウイルス感染効率をチェックすることにより、バキュロウイルス上清の最適な体積を経験的に決定する。 - 感染したSf9細胞でバキュロウイルスgp64を染色することにより、感染後3~4日のバキュロウイルス感染を監視する。
- 染色2 x 105 Sf9細胞(未感染細胞とバキュロウイルス感染細胞の両方)に0.5μgのマウス抗バキュロウイルスgp64抗体(1:200)を有し、100μLの蛍光色素を含むブロッキングバッファーを100μLで周囲温度で30分間遮断した。
- 1 mLのPBSで細胞を洗浄し、抗体を除去し、0.5%のウシ血清アルブミンを含むPBSの300 μLで染色された細胞を再懸濁します。
- フローサイトメトリーを用いて細胞上でのバキュロウイルスgp64発現を解析する(図2)。
注: フローサイトメトリーの取得と解析の測定方法を実証的に決定します。合計10,000個の単一の生細胞が獲得される。Sf9細胞表面上のバキュロウイルスgp64発現は、バキュロウイルス感染を示す。3〜4日後、ほとんどのSf9細胞はバキュロウイルスに感染し、バキュロウイルスgp64発現によって証明される(図2)。
- 細胞が80%~90%の直径の増加に伴って生存可能である場合(図3)、細胞を収穫し、1mLの昆虫培養培地で10%の胎児ウシ血清と10%のジメチルスルホキシドを-80°Cでゆっくりと固化容器に収穫する。 翌日、TIPS細胞を含むチューブを液体窒素冷凍庫に移し、長期保存します。
注:バイオセーフティレベル2(BSL-2)の標準的無菌実験室技術に従って、バイオセーフティキャビネットで細胞培養を行います。
2. AAVベクトルの製造
- 1日目:バキュロウイルスに感染したTIPS細胞との共培養Sf9細胞
- AAV産生に必要なシェーカーインキュベーターで400mLの昆虫細胞培養液を含む数個のLフラスコで28°Cで1 x 106 細胞/mLでナイーブSf9細胞を培養し増殖させる。3〜4日後、細胞密度は5 x 106 -6x 106 細胞/mLまで増加する。
注:CO2 と湿度は、Sf9細胞の成長のための重要な要因ではありません。 - Sf9細胞を振るフラスコまたはバイオリアクターに次のようにシードします。
- 軌道シェーカーインキュベーターのフラスコでのAAV生産:ピペットまたは蠕動ポンプを使用して、2 x 106 細胞/mLで400mLのSf9培養を無菌で2 Lフラスコに播種します。軌道シェーカーを125rpmと28°Cに設定します。
注 AAV の生産の規模に応じて、蠕動ポンプまたは標準的なピペットを使用してください。 - バイオリアクターでのAAV生産:蠕動ポンプを使用して、2 x 106 細胞/mLのSf9培養液の1Lを無菌で10 Lバイオリアクターバッグに播種します。28°Cで培養するために、バッグをバイオリアクターユニットに積み込みます。 0.1 psiでバイオリアクターバッグに40%の酸素を加えます。20°の角度でバイオリアクターユニットを設定し、25 rpmで袋を振ります。
- 軌道シェーカーインキュベーターのフラスコでのAAV生産:ピペットまたは蠕動ポンプを使用して、2 x 106 細胞/mLで400mLのSf9培養を無菌で2 Lフラスコに播種します。軌道シェーカーを125rpmと28°Cに設定します。
- 各BV-AAV2-GFP(または治療遺伝子)およびBV-AAV2-rep-cap TIPS細胞の1つのバイアルを解凍する。20 mLの昆虫培養培地で細胞を希釈し、トリパンブルーを用いて細胞の生存率カウントを行う。シェーカーフラスコまたはバイオリアクターで培養したナイーブSf9細胞に対して、両方のTIPS細胞を1:10,000の比率で接種する。
注:TIPS細胞の生存率は凍結保存のために減少し、細胞の生存率はトリパンブルー染色で決定されると約50%です。大規模なrAAV産生前にTIPS細胞とナイーブSf9細胞の比率を実証的に決定するためのパイロット実験を行います。
- AAV産生に必要なシェーカーインキュベーターで400mLの昆虫細胞培養液を含む数個のLフラスコで28°Cで1 x 106 細胞/mLでナイーブSf9細胞を培養し増殖させる。3〜4日後、細胞密度は5 x 106 -6x 106 細胞/mLまで増加する。
- 2日目:文化モニタリング
- Sf9培養物の収穫1 mLを無菌で収穫する。トリパンブルー色素で染色し、細胞数、生存率、形態を解析します。
- 3日目:文化モニタリングと摂食
- Sf9培養の1 mLを収穫し、細胞数、生存率、および形態を分析する。ステップ1.3で述べたようにSf9細胞を染色した後、バキュロウイルス感染の状態を確認してください。
注:細胞の直径および細胞パシー効果の増加は、バキュロウイルス感染の徴候である。直径の増加は、細胞の生存率の低下に先立ち、これらのパラメータは、AAV産生中の細胞収穫時間を決定するために使用されます。最適な時点を経験的に決定します。 - Sf9培養液に、無菌の割合1:5で新鮮な昆虫培養培地を供給します。
- Sf9培養の1 mLを収穫し、細胞数、生存率、および形態を分析する。ステップ1.3で述べたようにSf9細胞を染色した後、バキュロウイルス感染の状態を確認してください。
- 4日目:文化モニタリング
- Sf9培養の1 mLを収穫し、細胞数、生存率、および形態を分析する。バイオリアクターバッグから酸素供給を取り外します。
- 5日目:文化のモニタリングと収穫
- Sf9培養の1 mLを収穫し、細胞数、生存率、および形態を分析する。Sf9細胞の生存率が50%程度に低下した場合に培養培地および細胞を収穫する(図4)。
- 4°Cで15分間、2100 x g で細胞懸濁液を回転させます。 上清と細胞ペレットを回収し、-80°Cで保存します。
3. 細胞のリシスとAAVの放出
- AAVプロデューサー細胞ペレットを解凍します。細胞ペレットに100mLの細胞リシスバッファー(20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM塩化ナトリウム、0.5%トリトン-X-100)を加え、激しく混合し、周囲温度で30分間インキュベートしてAAV粒子を放出します。
- 4°Cで30分間2100×gで遠心分離機を行い、細胞のライセートを新しい容器に移します。 解凍後に細胞ライセートと細胞培養上清を混ぜます。
- 20 U/mLヌクレアーゼと10 mMMgCl2 を細胞ライセートに加え、DNAとRNAを消化します。37°Cで2〜4時間インキュベートする。
- 0.8 μm および 0.2 μmpolyethersulfone デュアル濾過システムで、ポンプを使用してライセートをフィルター処理します。
- 透明化した細胞ライセートを一晩4°Cで保管するか、AAVを直ちに浄化してください。
4. アフィニティーカラムクロマトグラフィーシステムを用いたAAVベクターの精製
- 滅菌水、1 N N水酸化ナトリウム、水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)を50mL/minの流量で順次洗浄して、クロマトグラフィー装置を準備します。
- AVBセファローズカラム(10.0 mL)をクロマトグラフィーシステムにマウントし、5 mL/minの流量で100mLのPBSを実行します。
注:AAV生産の規模に応じてAVBセファローズカラムの低いまたはより大きなボリュームを使用し、列または樹脂メーカーが提案したように流量を設定します( 資料表を参照)。 - AAV粒子を含むカラムパススルー溶液、洗浄バッファ、および溶出バッファーの画分を収集するために、クロマトグラフィー器具のフラクションコレクタスロットにチューブを挿入する。
- 5.0 mL/minの流量でカラムをPBSと平衡化します。
- サンプルポンプを搭載したクロマトグラフィー機を使用して、AAV粒子を含む濾過された細胞溶解物をカラムにロードします。1分あたり3.0 mLの流量でサンプルを実行します。
- 紫外線(UV)吸光度曲線(280nm)がベースラインに戻り安定するまで、3.0 mL/minの流量でAVBセファローズカラムを通してPBSを実行します。
- 50 mM クエン酸ナトリウム (pH 3.0) バッファーを用いてカラムから AAV 粒子を 3.0 mL/min の流量で溶出する (図 5)。
注:AAV粒子が樹脂から解離してUV検出器を通過する間、クロマトグラムにはタンパク質の溶出ピークが見えます。 - 直ちにAAV上清を500mM Tris-HCl(pH 8.0)の1/5体積で希釈し、上清を含むAAVのpHを約pH5.5に増加させ、酸性溶出バッファーによるpH媒介分解を防ぎます。また、AAV上清をPBSで10倍希釈し、pHを完全に中和する。
注: pH 値は、rAAV 溶液を中和した後で約 5.5 です。AAVを中和した後、aAVが生理学的緩衝液に入るように、rAAV溶液をPBS(pH 7.4)で10倍希釈する。 - 各カラムランスルーサンプルの1mLを保存し、洗浄バッファー、および100μLの溶出したAAV上清を、標的細胞の感染によるAAVの存在を評価する。
- AVB セファローズカラムは、100 mL のクエン酸 (pH 2.1) と 100 mL の PBS (pH7.4) の流量 5.0 mL/分で洗浄します。5.0 mL/minの流量で20%エタノールでカラムをすすい、4°Cで保管してください。
- セクション 4.1 で説明されているように、カラムオフラインの位置でクロマトグラフィー装置のパイプラインをクリーニングします。最後に、200 mLの200 mLのエタノールを流量50.0 mL/minでリンスし、20%エタノールで保管します。
5. 接線流ろ過(TFF)を用いたAAVベクターの濃度とダイアフィルトレーション
- ポリスルホン膜カートリッジ(100kDa分子量カットオフ)を搭載したTFFシステムを設置し、AAVを濃縮します。
- 200 mLのPBSを10分間平衡化します。
- 2-3 psiで膜間圧を維持しながら、サンプルが所望の体積に低下するまでポンプの流れを制御してAAVサンプルをロードします。
- この研究で使用される100mLのPBSでリテン酸をダイアフィルト、またはAAVの長期安定性をサポートする代替緩衝液を経験的に定義する。
- AAVサンプルを目的のボリュームに濃縮した後、AAVサンプルを収集し、0.2 μmのポリエーテルスルホンフィルター(アリコート)を通して濾過し、-80°Cで保存します。
6. 精製工程におけるAAVの存在を評価するために、標的細胞へのAAVサンプルの感染
- 感染前日に1%L-グルタミン、1%のピルビン酸ナトリウム、および10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したダルベッコの修飾鷲培地(DMEM)の500 μLの24ウェルプレートに7 x 104 HT1080細胞/ウェルを接種します。培養器中の細胞を37°Cおよび5%CO2で培養する。
- 感染前に細胞を数える。カラムランの前に希釈した未精製のAAVバルクサンプル、カラムランスルーサンプル、洗浄バッファー、溶出精製AAVサンプルを加えます。
注:血球計でトリパンブルー染色された細胞を数えます。AAVサンプルの希釈係数と体積(μL)を経験的に決定します。AAVの価が高いほど、希釈が必要になります。カラムランの前に未精製バルクサンプルのバキュロウイルス粒子を確認し、カラムランスルーサンプル、洗浄バッファーは、標的細胞に感染する前に50分間50°Cで熱不活性化され、AAVの感染力価を決定する。 - 感染の2日後、フローサイトメーターを用いて細胞内のタンパク質発現(例えば、GFPまたは治療遺伝子)を解析する。
- AAVの感染力価を、感染時の細胞数、希釈因子、およびGFP+細胞の割合を使用して計算する式:(細胞の総数 x GFP+細胞x希釈因子)/AAVの体積をミリリットルで示す。
注: 例えば、セル数は 1 x10 5、GFP+ セルの割合は 3.4%、希釈係数は 100、追加される AAV の体積は 2 μL です。AAVの力は1.7 x 108感染単位(IU)/mLである。溶出した分率の25mLにおける精製AAV粒子の総量は、4.3 x109感染単位(IU)/mLである(図6)。初期未精製 AAV 粒子の総数は 1.09 x 1010 IU/mL で、精製された AAV 粒子は 4.3 x 109 IU/mL です。したがって、回復率は39.4%です。GFP+ 細胞の割合は 1%~30%の範囲にする必要があり、AAV の感染力素を計算するために使用する場合は線形範囲に相当します。より濃縮されたAAVベクター粒子が標的細胞に感染している場合;AAV粒子の複数のコピーが、ベクターの単一コピーとして示される単一の細胞に感染する可能性がある。したがって、AAVベクター上清を希釈して、標的細胞における1%〜30%のベクター感染を得る。AAVベクターにレポーター遺伝子がない場合は、フローサイトメーターを用いて検出および定量することができる蛍光色素を含む抗体を用いてAAVベクターによって発現されるトランスジーンまたは治療遺伝子を染色する。すべてのAAV血清型がHT1080細胞に効率的に感染できるわけではありません。従って、他のAAV血清型に対する感染性アッセイを行うために、異なる細胞株を用いる。精製前およびHT1080細胞で精製後のAAV2-GFP粒子を力乗し、フローサイトメトリーによりGFP発現を測定した。精製されたAAV粒子の数と精製前のAAV粒子数の比率に100を掛けて回収率(%)を算出する。
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Representative Results
ここで、Sf9昆虫細胞系を用いたAAVベクターの製造および精製のためのプロセス開発の代表的な結果を示す。この方法は、Bf9細胞とバキュロウイルス感染したTIPS細胞の共培養、増殖培地を細胞に供給し、AAV粒子を放出する産生細胞の収穫および溶解、ヌクレアーゼ処理による細胞溶解物の明確化、遠心分離および濾過、AVBセファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いたAAVの精製、および図1(図1)を有する濃度を含む。
TIPS細胞は、BV-AAV2-GFPまたは治療用遺伝子およびBV-AAV2-rep-capをSf9細胞に別々に感染させることによって生成される。Sf9細胞のほとんどは、複数の感染に起因する3〜4日間でバキュロウイルスに感染し、バキュロウイルス糖タンパク質gp64発現(図2)および細胞が直径の増加を示す(図3)。TIPS細胞は、感染後3〜4日採取され、凍結保存される。Sf9細胞は、ナイーブSf9細胞に感染する培地中のバキュロウイルス粒子を分泌するTIPS細胞と共培養される。バキュロウイルスは複製に優れ、また、バキュしたがって、感染細胞の数は、培養培地8,9に分泌される新たに産生されたバキュロウイルス粒子による複数の丸型感染によって急速に増加する。細胞は、AAV産生の完了の兆候である5日間の感染後に、直径、細胞パシー効果、および約半数の細胞が死ぬことを示す(図4)。
AAV生産者細胞は、低速遠心分離によって回収され、洗浄剤を含む緩衝液でリセ化され、AAVを細胞のライセート中に放出する。その後、DNAとRNAを消化するためにヌクレアーゼで処理して粘度を下げ、0.8μmと0.2μmの膜を通して濾過し、その後精製して濃縮します。細胞溶解物はクロマトグラフィーシステムを使用してAVBセファローズカラムにロードされる。AVBセファロース樹脂は、キャプシドタンパク質への親和性に起因するAAV2粒子を結合します。洗浄バッファーは、AVB セファローズ列を通って、紫外線(UV)吸光度曲線(280 nm)がベースラインで安定するまで、結合されていない緩やかに結合した材料を除去する。AAV粒子はAVBセファローズに強く結合するので、洗浄中に有意な数のAAV2粒子が検出されない。AAV粒子は酸性緩衝液(pH 3.0)で溶出し、AAV粒子とAVBセファロース樹脂との相互作用を解約する。酸性溶液によるAAVのpH媒介分解を防止するために、溶出液はアルカリ性緩衝液(pH8.0)で中和される。AAV画分に対応する酸性緩衝液を溶出している間にタンパク質のピークが見られる(図5および図6)。精製されたAAVは、PBSで10倍希釈し、濃縮し、TFFシステムと交換するバッファー。この例では、細胞溶解物中の全AAV粒子(560mL)は、1.1 x 1014ベクターゲノム(vg)であり、AVBセファロースクロマトグラフィー精製(25mL)の後、4.1x1013vg、およびTFF(25mL)での濃度後に2.4 x 10 13vgである。精製されたAAVサンプルは、SDS-PAGEと銀染色後の3つの異なるキャプシドタンパク質、VP1、VP2、VP3を示しています(図7)
図2:Sf9細胞におけるバキュロウイルスgp64発現のフローサイトメトリー解析 バキュロウイルスに感染したSf9細胞は、フローサイトメトリーによって検出される蛍光色素を含むマウス抗バキュロウイルスgp64抗体で染色される。(A) 感染していない Sf9 細胞。(B)感染したSf9細胞のバキュロウイルスは、ほとんどの細胞においてgp64発現を示している。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:バキュロウイルス感染Sf9(TIPS)細胞の形態 バキュロウイルスは、TIPS細胞を産生するためにSf9細胞に感染する。(A) 感染していない Sf9 細胞。(B) バキュロウイルス感染 Sf9 (TIPS) 細胞.細胞は200倍の倍率で示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:AAV産生中のバキュロウイルス感染Sf9細胞の形態 TIPS細胞は、AAV産生中に共培養されたナイーブSf9細胞に感染するバキュロウイルスを分泌する。(A) 感染していない Sf9 細胞。(B)バキュロウイルス感染Sf9細胞は、直径の増加を示す。感染後5日間、細胞のほぼ半数が死ぬ(トリパンブルー染色後の反転相顕微鏡下で可視化)。赤い矢印は、ライブ セルを示し、青い矢印は死んだセルを示します。細胞は200倍の倍率で示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:AVBセファローズカラムクロマトグラフィーを用いたAAV精製 クロマトグラムは、カラム、洗浄、溶出のサンプルローディング中に280 nmでのタンパク質サンプルの吸光度を示します。クロマトグラムは、図に収まるように変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:カラムへのロード、洗浄、溶出中のフロースルー中の感染性AAV粒子の数。合計560 mLのAAVサンプルが10 mL AVBセファローズカラムに積み込まれます。カラム負荷の分数体積は50mL、カラム洗浄量は50mL、溶出量は25mLです。AAVのチターは、カラム、洗浄、溶出にロードしながらカラムランスルーサンプルでHT1080細胞を感染させた後、精製の各ステップでAAVの存在を調査する。精製されたAAVの総収量は4.3 x 109の感染単位である。各ダイヤモンド形のシンボルは、各画分におけるAAVの感染単位(IU)を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.SDS-PAGE及びカプシドタンパク質を示す純粋なAAVベクターの銀染色。 減らされたAAVサンプルはSDS-PAGEで実行され、銀染色が行われる。AAVキャプシドタンパク質の3つの異なるバンド、VP1、VP2、VP3が目に見えます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
AAVベクターの製造、精製、および濃度のプロセス開発のためにこのプロトコルで使用されるパラメータは、遺伝子治療用途のためのAAVベクターの小規模および大規模な製造の両方に適用することができます。アップストリームおよびダウンストリームプロセス全体は、現在のグッドマニュファクチャリングプラクティス(cGMP)と互換性のある閉じたシステムで実行できます。Sf9-baculoウイルスシステムの主な利点は、手頃なコストで大規模なGMPグレードのAAV生産のためのスケーラビリティです。このシステムは、HEK293細胞を使用したAAVの製造に必要な高価なプラスミドおよびトランスフェクション試薬を必要としません。HEK293細胞とSf9細胞の両方が類似の品質AAVベクターを生成することが報告されている(エリックD.ホロウィッツ、ASGCT 2018、アブストラクト#100)。大きな課題は、このシステムは、かなりの時間と労力を必要とするバキュロウイルスとTIPS細胞の生成を必要とすることです。
このプロトコルでは、AAV遺伝子導入カセットを用いたバキュロウイルスを含むTIPS細胞とAAV-rep-capを含む別のTIPS細胞の2種類のTIPS細胞(TwoBacシステム)を用いた。OneBacシステム2、16、17は、単一のバキュロウイルスにAAV遺伝子導入カセットおよびrep-cap遺伝子の両方を含むTIPS細胞を生成することができる。OneBac システムは、TwoBac システムで説明されているように、2 つのセットではなく TIPS セルのセットを 1 つだけ使用して rAAV を生成する別のアプローチを提供します。
このプロトコルは、Sf9細胞におけるAAV生産について説明する。バキュロウイルスに感染したTIPS細胞と生産者のナイーブSf9細胞の比率を最適化し、良好なAAV収率を得ることが重要です。この比率が最適でない場合、AAVの収率は11に減少する。例えば、TIPSおよびプロデューサー細胞の最適でない比率のために、遺伝子導入ベクターを含むAAV ITRがプロデューサー細胞のキャプシドよりも多く生成された場合、利用可能なすべての遺伝子導入ベクターは、完全なAAV粒子を生成するのに十分なキャプシドを得られない。一方、生産者細胞内のAAV遺伝子導入ベクターよりも多くのキャプシドが生成された場合、全てのキャプシドは、空のAAV粒子をもたらす遺伝子導入ベクターを含むAAV ITRを得られない。
細胞が増殖するにつれて、培養培地の栄養素が枯渇し、代謝廃棄物が蓄積します。したがって、TIPS細胞とSf9細胞の共培養の2日後に細胞培養に20%の新鮮な成長培地を補充すると、AAV力素を有意に増加させることができる(アミンA.Kamen、カナダ国家研究評議会、個人的なコミュニケーション)。
AAV粒子の純度は、インビトロおよびインビボ試験3,5の両方に対して細胞毒性を伴わずに標的細胞の効果的な伝達を達成するための重要な因子である。したがって、AAV粒子を選択的に精製し、宿主細胞タンパク質やデブリ、ゲノムおよびバキュロウイルスDNA、および凝集および断片化ベクターなどの不純物を除去できるクロマトグラフィー工程を含めることが重要です。AAV上清をAVBセファローズカラムにロードする間、樹脂に結合することなくカラムを通過する可能性のあるAAV粒子の存在をフロースルーサンプルで確認することが重要です。その場合、(1)AAV粒子を結合するためにより長い滞留時間が必要となる低い実行速度、(2)カラムにロードされたサンプルの量を減らす必要があり、かつ/または(3)AVBセファローズの体積を増加させ、カラムの結合能力がAAV粒子の数を超えないようにする必要があります。AVBセファローズ樹脂が高い流量でAAV粒子を結合する能力と高い親和性および容量を有する、精製時間を短縮することが重要である。AVBセファロースの主な制限は、AAV血清型1、2、および5のキャプシドを結合することにある。したがって、異なるクロマトグラフィー樹脂は、他のAAV血清型18の精製のためにテストおよび使用されるべきである。本明細書に記載の下流浄化プロトコルは、HEK293細胞で製造されたAAVを精製するためにも使用することができる。
このプロトコルは、細胞のライセートからAAVを浄化することができますが、空の粒子を除去することはできません。いくつかの記事では、精製されたAAVストック19,20の中で空のAAV粒子と完全なAAV粒子を区別できる方法について説明しています。しかし、空の粒子の生成を最小限に抑えるために、AAVの生産は上流のプロセスレベルで最適化されるべきであると考えています。生産者細胞におけるAAV遺伝子導入ベクターとカプシド産生の比率が最適でない場合、より空の粒子が生成する可能性がある。
完全なAAV粒子を結合することに加えて、AVBセファローズ培地は、TFFを使用して除去することができる断片化されたAAV粒子またはキャプシドタンパク質に結合する。低分子量粒子のほとんどは、カラムクロマトグラフィーの下流のTFFステップを含めることによってAAVサンプルから除去される。また、TFFは、バッファ交換/ダイアフィルを行い、AAV10,21を濃縮するために使用されます。
塩化セシウムまたはイオジキサノール勾配を有するAAVライセートの超遠心分離は、小規模および前臨床グレードのAAV精製に好ましい方法であるが、この方法は拡張性がなく、AAV 21,22の大規模精製には適していない。
結論として、AAVの生産と精製のプロセス開発のためのこのプロトコルは、遺伝性遺伝性疾患の遺伝子治療のための組換えAAVの小規模な前臨床および大規模な製造に有用であろう。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
ロバート・M・コティン博士(NIH国立心臓・血液・肺研究所)がAAVプラスミドとダニエル・スティールとレベッカ・エルンスト(シンシナティ小児病院)に技術支援を提供してくれたことに感謝します。この作品は、シンシナティ児童研究財団からM.N.へのスタートアップ基金によって支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
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