Summary
I detta protokoll produceras AAV2 vektor genom samodling Spodoptera frugiperda (Sf9) insektsceller med baculovirus (BV)-AAV2-grönt fluorescerande protein (GFP) eller terapeutisk gen och BV-AAV2-rep-cap infekterade Sf9 celler i suspension kultur. AAV-partiklar frigörs från cellerna med tvättmedel, förtydligas, renas genom affinitetskolonnkromatografi och koncentreras genom tangentiell flödesfiltrering.
Abstract
Adeno-associerade virus (AAV) är lovande vektorer för genterapi applikationer. Här produceras AAV2 vektorn genom samkultur av Spodoptera frugiperda (Sf9) celler med Sf9 celler infekterade med baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) och BV-AAV2-rep-cap i serumfri suspension kultur. Cellerna odlas i en kolv i en orbital shaker eller Wave bioreaktor. För att frigöra AAV-partiklarna lyses producentcellerna i buffertinnehållande tvättmedel, vilket därefter förtydligas genom centrifugering och filtrering med låg hastighet. AAV-partiklar renas från cellen lysate med hjälp av AVB Sepharose kolonnkromatografi, som binder AAV-partiklar. Bundna partiklar tvättas med PBS för att avlägsna föroreningar och eliseras från hartset med natriumcitratbuffert vid pH 3.0. Det sura eluat neutraliseras med alkalisk Tris-HCl-buffert (pH 8.0), späds ut med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och koncentreras ytterligare med tangentiell flödesfiltrering (TFF). Protokollet beskriver småskalig preklinisk vektorproduktion kompatibel med uppskalning till storskalig klinisk kvalitet AAV tillverkning för mänskliga genterapi applikationer.
Introduction
Adenoassocierade virus (AAV) är icke-höljen mänskliga parvovirus som innehåller ett enda strandat DNA på 4,6 kb. AAV-vektorer har flera fördelar jämfört med andra virusvektorer för genterapiapplikationer1,2,3,4. AAV:er är naturligt replikerings inkompetenta och kräver därför ett hjälpvirus och värdmaskiner för replikering. AAV orsakar ingen sjukdom och har låg immunogenicitet i den infekterade värden3,5. AAV kan infektera både quiescent och aktivt dela celler och kan kvarstå som episome utan att integreras i genomet av värdcellerna (AAV integreras sällan i värdgenomet)1,3. Dessa funktioner har gjort AAV till ett önskvärt verktyg för genterapiapplikationer.
För att generera en AAV genöverföring vektor klonas transgenekassetten, inklusive den terapeutiska genen, mellan två interna terminalrepetitioner (ITR), som vanligtvis härrör från AAV serotyp 2. Den maximala storleken från 5' ITR till 3' ITR, inklusive transgenesekvensen, är 4,6 kb6. Olika kapsider kan ha en annan cell eller vävnad tropism. Därför bör kapsider väljas baserat på den vävnad eller celltyp som är avsedd att riktas mot AAV-vektorn7.
Rekombinanta AAV-vektorer produceras ofta i däggdjurs cellinjer såsom mänskliga embryonala njurceller, HEK293 genom övergående transfektion av AAV-genöverföringsvektorn, AAV rep-cap och helpervirusplasmider2,3. Det finns dock flera begränsningar för storskalig AAV-produktion genom transient transfektion av vidhäftande HEK293-celler. För det första behövs ett stort antal cellstackar eller rullflaskor. För det andra behövs högkvalitativt plasmid-DNA och transfektreagenser, vilket ökar tillverkningskostnaderna. Slutligen, när man använder vidhäftande HEK293-celler, behövs serumet ofta för optimal produktion, vilket komplicerar nedströmsbearbetning1,2,3. En alternativ metod för AAV-tillverkning innebär användning av insektscelllinjen, Spodoptera frugiperda (Sf9) celler och ett insektsvirus som kallas rekombinant Autographa californica multicapsid nukleär polyhedrosvirus (AcMNPV eller baculovirus)8,9,10. Sf9-celler odlas i serumfri suspensionskultur som är lätt att skala upp och är kompatibel med nuvarande god tillverkningssed (cGMP) produktion i stor skala, vilket inte kräver plasmid- eller transfektreagenser. Dessutom är kostnaden för AAV-produktionen med hjälp av Sf9-baculovirussystemet lägre än kostnaden för att använda transient transfektion av plasmider till HEK293-celler11.
Det ursprungliga rAAV-produktionssystemet med baculovirus-Sf9-celler använde tre baculovirus: ett baculovirus som innehåller genöverföringskassett, det andra baculoviruset som innehåller repgenen och det tredje baculoviruset som innehåller serotypspecifik kapsidgen12,13. Baculoviruset som innehåller rep konstruktion var dock genetiskt instabila på flera rundor av passager, vilket förhindrade förstärkning av baculovirus för storskalig AAV produktion. För att lösa detta problem utvecklades ett nytt rAAV-vektorsystem, som innehöll två baculovirus (TwoBac): ett baculovirus som innehåller AAV-genöverföringskasetten och ett annat baculovirus som innehåller AAV rep-cap gener tillsammans som är genetiskt stabilare än det ursprungliga systemet och bekvämare att producera rAAV på grund av att använda TwoBac istället för tre14, 15. OneBac-systemet använder AAV-genöverföringskassetten och rep-cap-generna i ett enda baculovirus som är bekvämare att producera rAAV på grund av att använda ett baculovirus istället för att använda TwoBac eller ThreeBac2,16,17. I vår studie användes TwoBac-systemet för optimering.
Baculovirussystemet för AAV-produktion har också begränsningar: baculoviruspartiklar är instabila för långvarig lagring i serumfritt medium11, och om baculovirustitern är låg behövs en stor volym baculovirus supernatant, vilket kan bli giftigt för tillväxten av Sf9-celler under AAV-produktion (personlig observation). Användningen av titerfria infekterade cellkonserverings- och uppskalningsceller (TIPS), eller baculovirusinfekterade insektsceller (BIIC), ger ett bra alternativ för AAV-produktion där baculovirusinfekterade Sf9-celler bereds, kryopreserveras och därefter används för infektion av färska Sf9-celler. En annan fördel är den ökade stabiliteten hos baculovirus (BV) i Sf9-celler efter kryopreservation10,11.
Två typer av TIPS-celler genereras för att möjliggöra AAV-produktion: den första genom infektion av Sf9-celler med BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen, och den andra genom infektion av Sf9-cellen med BV-AAV2-rep-cap. TIPS-celler är kryopreserverade i små och färdiga alikvoter. AAV-vektorer produceras i serumfri suspensionskultur i en kolv placerad i en orbital shaker eller Wave bioreaktor genom att samkultera TIPS-celler som producerar baculovirus och färska Sf9-celler. Sf9-celler infekteras av baculovirus som bär AAV2-GFP-vektorn och rep-cap-sekvenserna för att generera AAV. Fyra till fem dagar senare, när AAV-avkastningen är den högsta, är producentcellerna lysda med tvättmedel för att frigöra AAV-partiklarna. Cell lysate förtydligas därefter genom låg hastighet centrifugering och filtrering. AAV-partiklar renas från lysat av AVB Sepharose kolonnkromatografi. Slutligen koncentreras AAV-vektorer med TFF. Protokollet beskriver produktionen av AAV i liten skala, användbar för forskning och prekliniska studier. Metoderna är dock skalbara och kompatibla med tillverkning av kliniska AAV-vektorer för genterapiapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se bild 1 för en illustration som sammanfattar protokollet.
1. Generering av baculovirusinfekterade TIPS-celler
- Tina en flaska Sf9-celler och omedelbart så dem i 50 ml insektscellsodlingsmedium. Odla Sf9-celler i en orbital shakerinkubator vid 125 varv/min och 28 °C i rundbottenkolvar med ett löst fäst lock för utbyte av luft8,9. Sprid cellerna i en 1 L-kolv som innehåller 200 ml medium för att få tillräckligt med celler för PRODUKTION AV TIPS-celler.
- Tillsätt 50 ml Sf9-celler vid 2 x 106 celler/ml i två flaskor: infektera en kolv Sf9-celler med 0,5 ml baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) och den andra cellkolven med 0,5 ml BV-AAV2-rep-cap.
OBS: AAV vektorplasmider tillhandahölls generöst av Dr. Robert M. Kotin (NIH). Baculovirusproduktion från bacmid DNA (Bac-to-Bac System) har beskrivits tidigare8,9. Baculovirus stabilitet under passagen är ett kritiskt problem för uppskalning produktion av rAAV. Det är bättre att använda ett lägre passagenummer av baculovirus (upp till passage nummer 4). Bestäm den optimala volymen av baculovirus supernatant empiriskt genom att kontrollera baculovirusinfektionens effektivitet med hjälp av flödescytometri (figur 2) under TIPS-cellproduktion. - Övervaka baculovirusinfektionen 3-4 dagar efter infektion genom att färga baculovirus gp64 i infekterade Sf9-celler enligt följande.
- Fläcka 2 x 105 Sf9-celler (både oinfekterade och baculovirusinfekterade celler) med 0,5 μg mus anti-baculovirus gp64 antikropp (1:200) som innehåller ett fluorescerande färgämne i 100 μL blockeringsbuffert i 30 min vid omgivningstemperatur.
- Tvätta cellerna med 1 ml PBS för att avlägsna antikroppen och återanvända de färgade cellerna i 300 μL PBS innehållande 0, 5% bovint serumalbumin.
- Analysera uttrycket baculovirus gp64 på celler med flödescytometri (bild 2).
OBS: Bestäm gitterstrategin för förvärv och analys av flödescytometri empiriskt. Totalt förvärvas 10 000 levande celler. Baculovirus gp64 uttryck på Sf9 cell ytor indikerar baculovirus infektion. Efter 3-4 dagar blir de flesta av Sf9-cellerna infekterade med baculoviruset, vilket framgår av baculovirus gp64 uttryck (figur 2).
- När cellerna är 80-90% livskraftiga med en ökning av diametern (figur 3), skörda cellerna och kryopreserven 1 x 107 celler i 1 ml insektsodlingsmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 10% dimetylsulfoxid i en långsamt frysande behållare vid -80 °C. Nästa dag överför du röret som innehåller TIPS-celler till en flytande kvävefrys för långtidsförvaring.
OBS: Utför cellodling i ett biosäkerhetsskåp enligt standard aseptisk laboratorieteknik på Biosafety Level 2 (BSL-2).
2. Produktion av AAV-vektor
- Dag 1: Samkulturella Sf9-celler med de baculovirusinfekterade TIPS-cellerna
- Odla och odla naiva Sf9-celler vid 1 x 106 celler/ml vid 28 °C i flera 2 L-flaskor som innehåller 400 ml insektscellsodlingsmedium i en skakinkubator som behövs för AAV-produktion. Efter 3-4 dagar ökas celltätheten upp till 5 x 106-6 x 106 celler/ml.
OBS: CO2 och luftfuktighet är inte viktiga faktorer för tillväxten av Sf9-celler. - Så Sf9-cellerna antingen i skakkolvar eller i en bioreaktor enligt följande.
- AAV-produktion i kolvar i en orbital shakerinkubator: Använd en pipett eller en peristaltisk pump för att så 400 ml Sf9-odling vid 2 x 106 celler/ml till en 2 L-kolv aseptiskt. Ställ in orbital shaker vid 125 rpm och 28 °C.
OBS Använd en peristaltisk pump eller standardpipett beroende på AAV-produktionens omfattning. - AAV-produktion i en bioreaktor: Använd en peristaltisk pump för att så 1 L Sf9-odling vid 2 x 106 celler/ml i en 10 L bioreaktorpåse aseptiskt. Lasta påsen på Bioreaktorenheten för odling vid 28 °C. Tillsätt 40% syre till bioreaktorpåsen vid 0,1 psi. Ställ in bioreaktorenheten i 20° vinkel och skaka påsen vid 25 varv/min.
- AAV-produktion i kolvar i en orbital shakerinkubator: Använd en pipett eller en peristaltisk pump för att så 400 ml Sf9-odling vid 2 x 106 celler/ml till en 2 L-kolv aseptiskt. Ställ in orbital shaker vid 125 rpm och 28 °C.
- Tina en flaska av varje BV-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) och BV-AAV2-rep-cap TIPS celler. Späd cellerna med 20 ml insektsodlingsmedium och utför ett livskraftantal av cellerna med trypanblått. Inokulera båda TIPS-cellerna i ett förhållande av 1:10 000 i förhållande till de naiva Sf9-cellerna odlade i en shakerkolv eller bioreaktor.
OBS: ÖVERLEVNADEN av TIPS-cellerna minskar på grund av kryopreservation, och återvinningshastigheten är cirka 50% när cellens livskraft bestäms med trypan blå färgning. Utför ett pilotexperiment för att empiriskt bestämma förhållandet mellan TIPS-celler och naiva Sf9-celler före storskalig rAAV-produktion.
- Odla och odla naiva Sf9-celler vid 1 x 106 celler/ml vid 28 °C i flera 2 L-flaskor som innehåller 400 ml insektscellsodlingsmedium i en skakinkubator som behövs för AAV-produktion. Efter 3-4 dagar ökas celltätheten upp till 5 x 106-6 x 106 celler/ml.
- Dag 2: Kulturövervakning
- Skörda 1 ml Sf9-kultur aseptiskt. Fläcka med Trypan blå färgämne för att analysera cellantal, livskraft och morfologi.
- Dag 3: Kulturövervakning och utfodring
- Skörda 1 ml Sf9-kulturen och analysera cellantal, livskraft och morfologi. Kontrollera statusen för baculovirusinfektion efter färgning av Sf9-cellerna som nämns i steg 1.3.
OBS: Ökning av celldiameter och cytopatisk effekt är indikationer på baculovirusinfektion. Ökningen av diametern föregår en minskning av cellens livskraft, och dessa parametrar används för att bestämma cellskördstiden under AAV-produktionen. Bestäm den optimala tidspunkten empiriskt. - Mata Sf9-kulturen med färskt insektsodlingsmedium i ett förhållande av 1:5 aseptiskt.
- Skörda 1 ml Sf9-kulturen och analysera cellantal, livskraft och morfologi. Kontrollera statusen för baculovirusinfektion efter färgning av Sf9-cellerna som nämns i steg 1.3.
- Dag 4: Kulturövervakning
- Skörda 1 ml Sf9-kulturen och analysera cellantal, livskraft och morfologi. Koppla bort syretillförseln från bioreaktorpåsen.
- Dag 5: Kulturövervakning och skörd
- Skörda 1 ml Sf9-kulturen och analysera cellantal, livskraft och morfologi. Skörda odlingsmediet och cellerna när Sf9-cellens livskraft har minskat till cirka 50 % (figur 4).
- Snurra cellfjädringen vid 2100 x g i 15 min vid 4 °C. Samla supernatanten och cellpelleten och förvara dem vid -80 °C.
3. Lys av celler och frisättning av AAV
- Tina AAV-producentcellpelleten. Tillsätt 100 ml celllysbuffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM natriumklorid, 0,5 % Triton-X-100) till cellpelleten, blanda kraftigt och inkubera i 30 minuter vid omgivningstemperatur för att frigöra AAV-partiklarna.
- Centrifugera vid 2100 × g i 30 min vid 4 °C och överför cell lysate till en ny behållare. Blanda celllyte och cellkultur supernatant efter upptining.
- Tillsätt 20 U/mL nukleas och 10 mM MgCl2 till cellen lysate för att smälta DNA och RNA. Inkubera i 2-4 h vid 37 °C.
- Filtrera lysat genom ett dubbelfiltreringssystem på 0,8 μm och 0,2 μmpolyethersulfone med hjälp av en pump.
- Förvara den klarnade cell lysat vid 4 °C över natten eller rena AAV omedelbart.
4. Rening av AAV-vektor med hjälp av affinitetskolonnkromatografisystem
- Förbered kromatografiinstrumentet genom att sekventiellt tvätta prov- och buffertledningarna med sterilt vatten, 1 N natriumhydroxid, vatten och fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4) med en flödeshastighet på 50 ml/min.
- Montera AVB Sepharose-kolonnen (10,0 mL) i kromatografisystemet och kör 100 ml PBS med en flödeshastighet på 5 mL/min.
OBS: Använd en lägre eller högre volym av AVB Sepharose-kolonnen beroende på AAV-produktionens skala och ställ in flödeshastigheten enligt kolumn- eller hartstillverkarens förslag (se Materialförteckning). - För att samla in fraktionerna av kolonngenomströmningslösning, tvättbuffert och elutionsbuffert som innehåller AAV-partiklar, sätt in rör i fraktionsamlarspåren på kromatografiinstrumentet.
- Balansera kolonnen med PBS med en flödeshastighet på 5,0 ml/min.
- Ladda den filtrerade celllyte som innehåller AAV-partiklar på kolonnen med hjälp av kromatografimaskinen utrustad med en provpump. Kör provet med en flödeshastighet på 3,0 ml per minut.
- Kör PBS genom AVB Sepharose-kolonnen med en flödeshastighet på 3,0 mL/min tills den ultravioletta (UV) absorbanskurvan (280 nm) återgår till baslinjen och blir stabil.
- Elutera AAV-partiklarna från kolonnen med 50 mM natriumcitrat (pH 3.0) buffert med en flödeshastighet på 3,0 ml/min(figur 5).
OBS: Medan AAV-partiklarna separerar från hartset och passerar genom UV-detektorn, kan en elutiontopp av protein ses på kromatogrammet. - Späd omedelbart ut AAV-supernatanten med en femtedels volym på 500 mM Tris-HCl (pH 8,0) för att öka pH-värdet på AAV som innehåller supernatant till cirka pH 5,5 för att förhindra pH-medierad nedbrytning med sur elutionsbuffert. Späd vidare AAV-supernatanten 10-faldigt med PBS för att helt neutralisera pH- värdet.
OBS: pH-värdet är cirka 5,5 efter att rAAV-lösningen neutraliserats. Efter neutraliserande AAV späd rAAV-lösningen 10-faldigt med PBS (pH 7.4) så att AAV är i en fysiologisk buffert. - Lagra 1 ml av varje kolonn genomgående prover, tvättbuffert och 100 μL av den eliserade AAV-supernatanten för att utvärdera förekomsten av AAV genom infektion i målcellerna.
- Rengör AVB Sepharose-kolonnen med 100 ml 100 mM citronsyra (pH 2.1) och 100 ml PBS (pH7.4) med en flödeshastighet på 5,0 ml/min. Skölj kolonnen med 20% etanol med en flödeshastighet på 5,0 ml/min och förvara vid 4 °C.
- Rengör kromatografiinstrumentets rörledningar med kolonnens offlineposition enligt beskrivningen i avsnitt 4.1. Skölj slutligen kromatografisystemet med 200 ml 20% etanol med en flödeshastighet på 50,0 ml/min och förvara i 20% etanol.
5. Koncentration och diafiltrering av AAV-vektor med hjälp av tangentiell flödesfiltrering (TFF)
- Ställ in TFF-systemet utrustat med en polysulfonmembranpatron (100 kDa molekylviktsavskärning) för att koncentrera AAV.
- Ekvilibrate TFF-modul med 200 ml PBS i 10 min.
- Ladda AAV-provet genom att styra pumpens flöde tills provet reduceras till önskad volym samtidigt som ett transmembrantryck bibehålls vid 2-3 psi.
- Diafiltrate retentate med 100 ml PBS, som används i denna studie, eller empiriskt definiera alternativ buffert som stöder långsiktig stabilitet av AAV.
- När AAV-provet har koncentrerats till önskad volym samlar du upp AAV-provet, filtrerar det genom ett 0,2 μm polyetersulfonfilter, alikvot och förvarar det sedan vid -80 °C.
6. Infektion av AAV-prover i målcellerna för att utvärdera förekomsten av AAV i reningsstegen
- Inokulera 7 x 104 HT1080 celler/brunn i en 24-väl tallrik i 500 μL av Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) kompletterat med 1% L-glutamin, 1% natrium pyruvat och 10% fetala nötkreatur serum (FBS) dagen före infektion. Odla cellerna i en inkubator vid 37 °C och 5% CO2.
- Räkna cellerna före infektion. Tillsätt det utspädda oanvänt AAV-samlingsprovet före kolonnkörningen, kolonngenomgående prover, tvättbuffert och eltat renat AAV-prov.
OBS: Räkna Trypan blåfärgade celler med en hemocytometer. Bestäm utspädningsfaktorn och volymen (μL) för AAV-proverna empiriskt. Ju högre AAV-titer, desto mer utspädning behövs. Se till att baculoviruspartiklarna i det icke-använda bulkprovet innan kolonnen körs, kolonnutringsprover, tvättbufferten värmeaktiveras vid 50 °C i 50 minuter innan målcellerna infekteras för att bestämma infektiösa titrar av AAV. - Två dagar efter infektion, analysera proteinuttrycket (t.ex. GFP eller terapeutisk gen) i cellerna med hjälp av en flödescytometer.
- Beräkna infektiösa titrar av AAV med hjälp av antalet celler vid tidpunkten för infektion, utspädningsfaktor och procentandel av GFP+ celler med formeln: (Totalt antal celler x Procent GFP + celler x utspädningsfaktor) / Volym av AAV i milliliter.
OBS: Till exempel är antalet celler 1 x 105, andelen GFP + celler är 3,4%, utspädningsfaktorn är 100 och volymen av AAV tillsatt är 2 μL. Titer av AAV är 1,7 x 108 infektiös enhet (IE)/mL. Den totala mängden renade AAV-partiklar i 25 ml av den eliserade fraktionen är 4,3 x 109 infektiösa enheter (IE)/mL(figur 6). Det totala antalet initiala ej utslåde AAV-partiklar är 1,09 x 1010 IE/ml, och rena AAV-partiklar är 4,3 x 109 IE/mL. Därför är andelen återhämtning 39,4%. Andelen GFP+-celler bör vara mellan 1%-30%, vilket motsvarar ett linjärt intervall när det används för att beräkna den infektiösa titer av AAV. Om mer koncentrerade AAV-vektorpartiklar infekteras i målcellerna; Det finns en möjlighet att flera kopior av AAV-partiklarna kan infektera en enda cell som visas som en enda kopia av vektorn. Späd därför ut AAV-vektor supernatanten för att erhålla 1%-30% vektorinfektion i målcellerna. Om AAV-vektorn inte har en reportergen, färga transgenen eller den terapeutiska genen som uttrycks av AAV-vektorn med en antikropp som innehåller ett fluorescerande färgämne som kan detekteras och mängderas med hjälp av en flödescytometer. Inte alla AAV serotyper kan effektivt infektera HT1080 celler. För att utföra infektionsanalysen för andra AAV-serotyper använder du därför olika cellinjer. Titer AAV2-GFP partiklar före rening och efter rening på HT1080 celler och mäta GFP-uttrycket efter flödescytometri. Beräkna återvinningen (%) med förhållandet mellan antalet renade AAV-partiklar och antalet AAV-partiklar före rening multiplicerat med 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visas de representativa resultaten av processutveckling för produktion och rening av AAV-vektorer med hjälp av Sf9 insektscellsystemet. Metoden inkluderar samkultur av Sf9-celler med baculovirusinfekterade TIPS-celler, utfodring av cellerna med tillväxtmedium, skörd och lys av producentcellerna för att frigöra AAV-partiklarna, förtydligande av celllyte med nukleasbehandling, centrifugering och filtrering, rening av AAV med av AVB Sepharose affinitetskromatografi och koncentration med TFF (figur 1).
TIPS celler genereras av infektion av BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen och BV-AAV2-rep-cap i Sf9 celler separat. De flesta av Sf9-cellerna blir infekterade med baculoviruset på 3-4 dagar på grund av de flera infektionsomgångarna, vilket framgår av baculovirus glykoprotein gp64 uttryck i (figur 2) och cellerna visar en ökning av diametern (figur 3). TIPS-celler skördas 3-4 dagar efter infektion och kryopreserveras. Sf9-celler samkultureras med TIPS-cellerna som utsöndrar baculoviruspartiklar i odlingsmediet som infekterar naiva Sf9-celler. Baculovirus är replikerings kompetent; Därför ökar antalet infekterade celler snabbt med flera runda infektioner med nyproducerade baculoviruspartiklar som utsöndras i odlingsmediet8,9. Cellerna visar en ökning av diameter, cytopatisk effekt, och ungefär hälften av cellerna dör i 5 dagar efter infektion, vilket är tecken på slutförande av AAV-produktionen(figur 4).
AAV-producentcellerna skördas genom centrifugering med låg hastighet, lysed med buffert som innehåller tvättmedel för att släppa ut AAV i cellens lysate. Detta behandlas sedan med nukleas för rötning av DNA och RNA för att minska viskositeten, filtreras genom ett membran på 0,8 μm och 0,2 μm och därefter renas och koncentreras. Cell lysate laddas på en AVB Sepharose kolumn med hjälp av ett kromatografisystem. AVB Sepharose harts binder AAV2 partiklar på grund av dess affinitet till kapsidproteinerna. Tvättbufferten körs genom AVB Sepharose-kolonnen för att avlägsna obundna och löst bundna material tills den ultravioletta (UV) absorbanskurvan (280 nm) blir stabil vid baslinjen. Eftersom AAV-partiklar starkt binder AVB Sepharose detekteras inget signifikant antal AAV2-partiklar under tvätten. AAV-partiklarna eliseras med sur buffert (pH 3.0), som dissocierar interaktionen mellan AAV-partiklar och AVB Sepharose-harts. För att förhindra den pH-medierade nedbrytningen av AAV med den sura lösningen neutraliseras eluantet med en alkalisk buffert (pH 8.0). En topp av protein ses vid elution med sur buffert motsvarande AAV-fraktionen (figur 5 och figur 6). Renad AAV späds 10-faldigt med PBS, koncentrerad och buffert utbytt med ett TFF-system. I det här exemplet är totala AAV-partiklar i celllynten (560 mL) 1,1 x 1014 vektorgenom (vg), efter ATT AVB Sepharose kromatografirening (25 mL) är 4,1 x 1013 vg, och efter koncentration med TFF (25 mL) är 2,4 x 1013 vg. De renade AAV-proverna visar tre distinkta kapsidproteiner, VP1, VP2 och VP3, efter SDS-PAGE och silverfärgning (figur 7)
Bild 1: Ett schematiskt diagram för produktion och rening av AAV Vector. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Flödescytometrianalys av baculovirus gp64 uttryck i Sf9 celler. Baculovirus infekterade Sf9-celler är färgade med en mus anti-baculovirus gp64 antikropp som innehåller ett fluorescerande färgämne, vilket detekteras av flödescytometri. a)Oinfekterade Sf9-celler. (B) Baculovirusinfekterade Sf9-celler visar gp64-uttryck i de flesta celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Morfologi av de baculovirusinfekterade Sf9-cellerna (TIPS). Baculovirus infekteras i Sf9-cellerna för att producera TIPS-cellerna. a)Oinfekterade Sf9-celler. (B) Baculovirusinfekterade Sf9 (TIPS) celler. Celler visas vid 200x förstoring. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Morfologi av de baculovirusinfekterade Sf9-cellerna under AAV-produktionen. TIPS-celler utsöndrar baculovirus som infekterar samkulturerade naiva Sf9-celler under AAV-produktion. a)Oinfekterade Sf9-celler. (B) Baculovirusinfekterade Sf9-celler visar en ökning av diametern. Fem dagar efter infektion dör nästan hälften av cellerna (visualiseras under ett inverterat fasmikroskop efter trypanblå färgning). Röda pilar anger levande celler och blå pilar indikerar döda celler. Celler visas vid 200x förstoring. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: AAV-rening med AVB Sepharose kolonnkromatografi. Ett kromatogram visar absorbansen av proteinprover vid 280 nm under provbelastning på kolonn, tvätt och elution. Kromatogrammet har ändrats för att passa in i figuren. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Antalet infektiösa AAV-partiklar i genomströmningen under lastning på kolonnen, tvätten och elutionen. Totalt 560 ml AAV-prover lastas på en 10 ml AVB Sepharose-kolonn. Fraktionsvolymen för kolonnbelastningen är 50 ml, kolumntvätten är 50 ml och elutionen är 25 ml. AAV-titrar mäts efter infektion av HT1080-celler med kolonngenomgående prover vid lastning på kolonn, tvätt och elution för att undersöka förekomsten av AAV vid varje steg av reningen. Den totala renade AAV-avkastningen är 4,3 x 109 infektiösa enheter. Varje diamantformad symbol representerar AAV:s infektiösa enheter (IE) i varje fraktion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7. SDS-PAGE och silverfärgning av ren AAV vektor som visar capsid proteiner. De reducerade AAV-exemplen körs på SDS-PAGE och silverfärgning utförs. Tre distinkta band av AAV-kapsidproteiner, VP1, VP2 och VP3, är synliga. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De parametrar som används i detta protokoll för processutveckling av produktion, rening och koncentration av AAV-vektorer kan tillämpas på både liten och storskalig tillverkning av AAV-vektorer för genterapiapplikationer. Hela processen uppströms och nedströms kan utföras i ett slutet system som är kompatibelt med den nuvarande goda tillverkningsseden (cGMP). De stora fördelarna med Sf9-baculovirussystemet är skalbarhet för storskalig AAV-produktion av GMP-klass till en överkomlig kostnad. Systemet behöver inte dyra plasmider och transfektreagenser, som behövs för produktion av AAV med hjälp av HEK293-celler. Det har rapporterats att både HEK293-celler och Sf9-celler ger liknande AAV-vektorer av liknande kvalitet (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Abstract #100). Den stora utmaningen är att detta system kräver generering av baculovirus och TIPS-celler som behöver en betydande tid och ansträngning.
I detta protokoll användes två typer av TIPS-celler (TwoBac-systemet): en TIPS-cell som innehåller baculovirus med AAV-genöverföringskassett och en annan TIPS-cell som innehåller AAV-rep-cap. OneBac-systemet2,16,17 kan generera TIPS-celler som innehåller både AAV-genöverföringskassett och rep-cap gener i ett enda baculovirus. OneBac-systemet tillhandahåller en alternativ metod för att producera rAAV med endast en uppsättning TIPS-celler i stället för två som beskrivs i TwoBac-systemet, vilket ytterligare skulle förenkla protokollet.
Det här protokollet beskriver AAV-produktion i Sf9-celler. Det är viktigt att optimera förhållandet mellan de baculovirusinfekterade TIPS-cellerna till producentnaiva Sf9-celler för att få ett bra AAV-utbyte. Om detta förhållande är suboptimalt kommer avkastningen av AAV att minskas11. Om till exempel mer AAV ITR som innehåller genöverföringsvektorer genereras än kapsiderna i producentcellerna på grund av det suboptimala förhållandet mellan TIPS och producentceller, kommer alla tillgängliga genöverföringsvektorer inte att få tillräckligt med kapsider för att producera fulla AAV-partiklar. Å andra sidan, om fler kapsider genereras än AAV-genöverföringsvektorerna i producentcellerna, kommer alla kapsider inte att få AAV ITR som innehåller genöverföringsvektorer som resulterar i tomma AAV-partiklar.
När cellerna multipliceras blir näringsämnena i odlingsmediet uttömda och metaboliska avfallsprodukter ackumuleras. Därför, tillskott av 20% färsk tillväxt medium i cellkulturen 2 dagar efter samkultur av TIPS celler och Sf9 celler kan öka AAV titers betydligt (Amine A. Kamen, National Research Council Kanada, personlig kommunikation).
Renheten hos AAV-partiklar är en kritisk faktor för att uppnå effektiv transduktion av målceller utan cytotoxicitet för både in vitro- och in vivo-studier 3,5. Därför är det viktigt att inkludera ett kromatografisteg som selektivt kan rena AAV-partiklar och eliminera föroreningar som värdcellproteiner och skräp, genomiskt och bakuloviralt DNA och aggregerade och fragmenterade vektorer. När AAV-supernatanten laddas på en AVB Sepharose-kolonn är det viktigt att kontrollera genomströmningsproverna för förekomst av AAV-partiklar som kan passera genom kolonnen utan att binda till hartset. Om så är fallet,1) en lägre körhastighet som resulterar i en längre uppehållstid kommer att vara nödvändig för att binda AAV-partiklarna, 2) mängden laddat prov på kolonnen bör minskas och/eller (3) volymen av AVB Sepharose bör ökas, så att kolonnens bindningskapacitet aldrig överstiger antalet AAV-partiklar. AVB Sepharose-hartsets förmåga att binda AAV-partiklar med hög flödeshastighet och med hög affinitet och kapacitet är viktigt för att minska reningstiden. Den största begränsningen av AVB Sepharose är att den binder kapsejsiden av AAV serotyper 1, 2 och 5. Därför bör olika kromatografihartser testas och användas för rening av andra AAV-serotyper18. Nedströmsreningsprotokollet som beskrivs häri kan också användas för att rena AAV som produceras i HEK 293-celler.
Detta protokoll kan rena AAV från cell lysate men kan inte ta bort tomma partiklar. Några artiklar har beskrivit metoder som kan skilja tomma kontra fulla AAV-partiklar i renade AAV-lager19,20. Vi anser dock att AAV-produktionen bör optimeras på uppströmsprocessnivå för att minimera genereringen av tomma partiklar. Om förhållandet mellan AAV-genöverföringsvektor och kapsidproduktion i producentceller inte är optimalt, kan fler tomma partiklar generera.
Förutom att binda fulla AAV-partiklar binder AVB Sepharose medium fragmenterade AAV-partiklar eller kapsidproteiner som kan avlägsnas med hjälp av TFF. De flesta av de låga molekylviktspartiklarna elimineras från AAV-prover genom att inkludera TFF-steget nedströms kolonnkromatografin. Dessutom används TFF för att utföra ett buffertutbyte/diafiltrering och för att koncentrera AAV10,21.
Även om ultracentrifugation av AAV-lysat med cesiumklorid eller iodixanolgradient är den föredragna metoden för småskalig och preklinisk AAV-rening, är denna metod inte skalbar och mindre lämplig för storskalig rening av AAV21,22.
Sammanfattningsvis kommer detta protokoll för processutveckling av produktion och rening av AAV att vara användbart för småskalig preklinisk och storskalig tillverkning av rekombinant AAV för genterapi av ärvda genetiska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) för att generöst ge oss AAV-plasmiderna och Danielle Steele och Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) för deras tekniska hjälp. Detta arbete stöds av startfonden från Cincinnati Children's Research Foundation till M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
References
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
- Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
- Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
- Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
- Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
- Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
- Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M.
- Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
- Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
- Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
- Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
- Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).
