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Biology

बाकुलोवायरस-कीट सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी) 2 वेक्टर के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए प्रक्रिया विकास

Published: January 13, 2022 doi: 10.3791/62829
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2,3, 1
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

Summary

इस प्रोटोकॉल में, AAV2 वेक्टर को सह-संस्कृति स्पोडोप्टेरा मितव्ययीperda (Sf9) कीट कोशिकाओं द्वारा बाकुलोवायरस (बीवी)-AAV2-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या चिकित्सीय जीन और BV-AAV2-rep-टोपी संक्रमित Sf9 कोशिकाओं के साथ निलंबन संस्कृति में उत्पादित Sf9 कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किया जाता है । एएवी कणों को डिटर्जेंट का उपयोग करके कोशिकाओं से छोड़ा जाता है, स्पष्ट किया जाता है, आत्मीयता कॉलम क्रोमेटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया जाता है, और स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन द्वारा केंद्रित किया जाता है।

Abstract

Adeno से जुड़े वायरस (AAV) जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए वैक्टर का वादा कर रहे हैं । यहां, AAV2 वेक्टर Sf9 कोशिकाओं के साथ Sf9 कोशिकाओं के साथ Sf9 कोशिकाओं की सह संस्कृति द्वारा उत्पादित है baculovirus (BV-AAV2-GFP (या चिकित्सीय जीन) और बीवी-AAV2-rep-टोपी सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में । कोशिकाओं को एक कक्षीय शेखर या वेव बायोरिएक्टर में एक फ्लास्क में सुसंस्कृत किया जाता है। एएवी कणों को छोड़ने के लिए, उत्पादक कोशिकाओं को बफर युक्त डिटर्जेंट में lysed किया जाता है, जिसे बाद में कम गति वाले अपकेंद्री और निस्पंदन द्वारा स्पष्ट किया जाता है । एएवी कणों को एवीबी सेफ्रॉस कॉलम क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके कोशिका से शुद्ध किया जाता है, जो एएवी कणों को बांधता है। बाध्य कणों को पीबीएस से धोया जाता है ताकि संदूषकों को हटाया जा सके और पीएच 3.0 पर सोडियम साइट्रेट बफर का उपयोग करके राल से एल्यूट किया जा सके। अम्लीय एल्यूएट को क्षारीय ट्रिस-एचसीएल बफर (पीएच 8.0) के साथ निष्प्रभावी किया जाता है, जो फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ पतला होता है, और आगे स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन (टीएफएफ) के साथ केंद्रित होता है। प्रोटोकॉल मानव जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर नैदानिक ग्रेड एएवी विनिर्माण के लिए पैमाने के साथ संगत छोटे पैमाने पर पूर्व नैदानिक वेक्टर उत्पादन का वर्णन करता है ।

Introduction

एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) गैर-छांग मानव पर्वोवायरस हैं जिनमें 4.6 केबी का एक-फंसे डीएनए होता है। एएवी वैक्टर जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए अन्य वायरल वैक्टर 1 ,2,3,4के लिए कई फायदे हैं। AAVs स्वाभाविक रूप से प्रतिकृति-अक्षम हैं, जिससे प्रतिकृति के लिए एक सहायक वायरस और मेजबान मशीनरी की आवश्यकता होती है। एएवी से कोई बीमारी नहीं होती है और संक्रमित मेजबान3,5में इम्यूनोजेनिसिटी कम होती है . एएवी शांत और सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं दोनों को संक्रमित कर सकता है और मेजबान कोशिकाओं के जीनोम में एकीकृत किए बिना एपिसोम के रूप में बना रह सकता है (एएवी शायद ही कभी मेजबान जीनोम में एकीकृत होता है)1,3। इन सुविधाओं ने एएवी को जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए एक वांछनीय उपकरण बना दिया है।

एएवी जीन ट्रांसफर वेक्टर उत्पन्न करने के लिए, चिकित्सीय जीन सहित ट्रांसजीन कैसेट को दो आंतरिक टर्मिनल रिपीट्स (आईटीआर) के बीच क्लोन किया जाता है, जो आमतौर पर एएवी सेरोटाइप 2 से प्राप्त होता है। ट्रांसजीन सीक्वेंस सहित 5 ' आईटीआर से 3 ' आईटीआर का अधिकतम आकार ४.६ केबी6है । अलग-अलग कैप्सिड में एक अलग सेल या टिश्यू ट्रॉपिज्म हो सकता है। इसलिए, कैप्सिड को एएवी वेक्टर7के साथ लक्षित करने के उद्देश्य से ऊतक या सेल प्रकार के आधार पर चुना जाना चाहिए।

Recombinant AAV वैक्टर आमतौर पर मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं के रूप में स्तनधारी कोशिका लाइनों में उत्पादित कर रहे हैं, HEK293 एएवी जीन हस्तांतरण वेक्टर, एएवी प्रतिनिधि टोपी, और सहायक वायरस प्लाज्मिड्स2,3के क्षणिक ट्रांसफेक्शन द्वारा । हालांकि, अनुयायी HEK293 कोशिकाओं के क्षणिक ट्रांसफैक्शन द्वारा बड़े पैमाने पर एएवी उत्पादन के लिए कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, बड़ी संख्या में सेल स्टैक या रोलर बोतलों की आवश्यकता होती है। दूसरा, उच्च गुणवत्ता वाले प्लाज्मिड डीएनए और ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स की जरूरत होती है, जिससे मैन्युफैक्चरिंग की लागत बढ़ जाती है । अंत में, अनुयायी HEK293 कोशिकाओं का उपयोग करते समय, सीरम को इष्टतम उत्पादन के लिए अक्सर आवश्यक होता है, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण1,2, 3को जटिल बना दियाजाताहै। एएवी विनिर्माण की एक वैकल्पिक विधि में कीट कोशिका रेखा, स्पोडोप्टेरा फ्रुगिपेरा (एसएफ 9) कोशिकाओं का उपयोग करना शामिल है, और एक कीट वायरस जिसे रीकॉम्बिनेंट ऑटोग्राफा कैलिफोर्निका मल्टीकैप्सिड न्यूक्लियर पॉलीहेड वायरस (एसीएमएनपीवी या बाकुलोवायरस)8,9,10कहा जाता है। Sf9 कोशिकाओं सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में बड़े हो रहे है कि बड़े पैमाने पर आसान है और एक बड़े पैमाने पर वर्तमान अच्छा विनिर्माण अभ्यास (सीजीएमपी) उत्पादन के साथ संगत है, जो प्लाज्मिड या ट्रांसफैक्शन अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, Sf9-baculovirus प्रणाली का उपयोग कर एएवी उत्पादन की लागत HEK293 कोशिकाओं11में प्लाज्मिड के क्षणिक ट्रांसफेक्शन का उपयोग करने की लागत से कम है ।

बाकुलोवायरस-एसएफ 9 कोशिकाओं का उपयोग करके मूल आरएवी उत्पादन प्रणाली में तीन बाकुलोवायरस का उपयोग किया गया: एक बाकुलोवायरस जिसमें जीन ट्रांसफर कैसेट होता है, दूसरा बाकुलोवायरस जिसमें प्रतिनिधि जीन होता है, और तीसरा बाकुलोवायरस जिसमें सेरोटाइप-विशिष्ट कैप्सिड जीन12,13होता है। हालांकि, प्रतिनिधि निर्माण युक्त बाकुलोवायरस मार्ग के कई दौर पर आनुवंशिक रूप से अस्थिर था, जिसने बड़े पैमाने पर एएवी उत्पादन के लिए बाकुलोवायरस के प्रवर्धन को रोका। इस मुद्दे को हल करने के लिए, एक उपन्यास आरएवी वेक्टर प्रणाली विकसित की गई थी, जिसमें दो बाकुलोवायरस (टूबाक) शामिल थे: एक बाकुलोवायरस जिसमें एएवी जीन ट्रांसफर कैसेट और एक अन्य बाकुलोवायरस होता है जिसमें एवीवी प्रतिनिधि-कैप जीन एक साथ होते हैं जो मूल प्रणाली की तुलना में आनुवंशिक रूप से अधिक स्थिर होते हैं और तीन14के बजाय टूबाक का उपयोग करने के कारण rAAV का उत्पादन करने के लिए अधिक सुविधाजनक होतेहैं। 15. वनबाक प्रणाली एएवी जीन ट्रांसफर कैसेट और एक ही बाकुलोवायरस में निरसित-कैप जीन का उपयोग करती है जो दोबाक या थ्रीबाक2 ,16,17का उपयोग करने के बजाय एक बाकुलोवायरस का उपयोग करने के कारण आरएवी का उत्पादन करने में अधिक सुविधाजनक है। हमारे अध्ययन में, टूबाक सिस्टम का उपयोग अनुकूलन के लिए किया गया था।

एएवी उत्पादन के लिए बाकुलोवायरस प्रणाली की भी सीमाएं हैं: बालुलोवायरस कण सीरम-मुक्त माध्यम11में दीर्घकालिक भंडारण के लिए अस्थिर हैं, और यदि बाकुलोवायरस टाइटर कम है, तो बाकुलोवायरस सुपरनेट की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, जो एएवी उत्पादन (व्यक्तिगत अवलोकन) के दौरान एसएफ 9 कोशिकाओं के विकास के लिए विषाक्त हो सकती है। टाइटर-कम संक्रमित-कोशिका संरक्षण और स्केल-अप (टिप्स) कोशिकाओं, या बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं (बीआईआईसी) का उपयोग, एएवी उत्पादन के लिए एक अच्छा विकल्प प्रदान करता है जिसमें बाकुलोवायरस-संक्रमित एसएफ9 कोशिकाएं तैयार की जाती हैं, क्रायोप्रेयर्ड, और बाद में ताजा Sf9 कोशिकाओं के संक्रमण के लिए उपयोग किया जाता है। एक अन्य लाभ क्रायोप्रिजर्वेशन10, 11के बाद एसएफ 9 कोशिकाओं में बाकुलोवायरस (बीवी) की बढ़ी हुईस्थिरताहै।

एएवी उत्पादन को सक्षम करने के लिए दो प्रकार की टिप्स कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं: बीवी-एएवी 2-जीएफपी या चिकित्सीय जीन के साथ Sf9 कोशिकाओं के संक्रमण से पहला, और बीवी-एएवी2-प्रतिनिधि-कैप के साथ Sf9 सेल के संक्रमण से दूसरा। टिप्स कोशिकाओं को छोटे और तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एलिकोट्स में क्रायोप्रेयर किया जाता है। एएवी वैक्टर सीरम-मुक्त निलंबन संस्कृति में एक कक्षीय शेखर या वेव बायोरिएक्टर में रखे गए फ्लास्क में सह-संस्कृति युक्तियों कोशिकाओं द्वारा उत्पादित होते हैं जो बाकुलोवायरस और ताजा एसएफ 9 कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। Sf9 कोशिकाओं baculoviruses कि AAV2-GFP वेक्टर और प्रतिनिधि टोपी दृश्यों को ले एएवी उत्पन्न करने के लिए ले से संक्रमित हैं । चार से पांच दिन बाद जब एएवी की पैदावार सबसे ज्यादा होती है तो उत्पादक कोशिकाओं को एएवी कणों को छोड़ने के लिए डिटर्जेंट के साथ lysed किया जाता है । बाद में कम गति वाले अपकेंद्रित्र और निस्पंदन द्वारा सेल lysate को स्पष्ट किया जाता है। एएवी कणों को एवीबी सेफ्रॉस कॉलम क्रोमेटोग्राफी द्वारा लिसेट से शुद्ध किया जाता है। अंत में, एएवी वैक्टर TFF का उपयोग कर केंद्रित कर रहे हैं। प्रोटोकॉल एक छोटे पैमाने पर एएवी के उत्पादन का वर्णन करता है, अनुसंधान और पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए उपयोगी है । हालांकि, जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए नैदानिक ग्रेड एएवी वैक्टर के निर्माण के साथ विधियां स्केलेबल और संगत हैं।

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Protocol

प्रोटोकॉल का सारांश देने वाले चित्रण के लिए चित्र 1 देखें।

1. बाकुलोवायरस-संक्रमित टिप्स कोशिकाओं का उत्पादन

  1. एसएफ9 कोशिकाओं की एक शीशी गल और तुरंत कीट कोशिका संस्कृति माध्यम के 50 मिलील में उन्हें बीज। एसएफ9 कोशिकाओं को कक्षीय शेकर इनक्यूबेटर में 125 आरपीएम और 28 डिग्री सेल्सियस में राउंड बॉटम फ्लास्क में उगाएं , जिसमें हवा के आदान - प्रदान के लिए शिथिल संलग्न टोपी8,9. टिप्स कोशिकाओं के उत्पादन के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए माध्यम के 200 एमएल युक्त 1 एल फ्लास्क में कोशिकाओं का प्रचार करें।
  2. दो फ्लास्क में 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल पर एसएफ9 कोशिकाओं के 50 एमएल जोड़ें: एसएफ9 कोशिकाओं के एक फ्लास्क को 0.5 एमएल के साथ बाकुलोवायरस (बीवी-एवी 2-जीएफपी (या चिकित्सीय जीन) और बीवी-एएवी2-प्रतिनिधि-कैप के 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं के अन्य फ्लास्क को संक्रमित करें।
    नोट: AAV वेक्टर प्लाज्मिड्स उदारता से डॉ रॉबर्ट एम कोटिन (NIH) द्वारा प्रदान किए गए थे । बैकमिड डीएनए (बीएसी-टू-बीएसी सिस्टम) से बाकुलोवायरस उत्पादन पहले8,9वर्णित किया गया है। पारित होने के दौरान बाकुलोवायरस स्थिरता आरएवी के पैमाने पर उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण समस्या है । बाकुलोवायरस (पैसेज नंबर 4 तक) की कम पैसेज नंबर का इस्तेमाल करना बेहतर है। टिप्स सेल उत्पादन के दौरान प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 2)का उपयोग करके बाकुलोवायरस संक्रमण दक्षता की जांच करके बाकुलोवायरस सुपरनेट अनुभवजन्य की इष्टतम मात्रा निर्धारित करें।
  3. संक्रमित Sf9 कोशिकाओं में बाकुलोवायरस gp64 को धुंधला करके 3-4 दिन बाद संक्रमण के संक्रमण की निगरानी करें।
    1. दाग 2 x 105 Sf9 कोशिकाओं (दोनों असंक्रमित और बाकुलोवायरस संक्रमित कोशिकाओं) माउस एंटी-बाकुलोवायरस gp64 एंटीबॉडी (1:200) के 0.5 माइक्रोन के साथ परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए बफर अवरुद्ध के 100μL में फ्लोरोसेंट डाई युक्त।
    2. एंटीबॉडी को हटाने के लिए पीबीएस के 1 मिलीएल के साथ कोशिकाओं को धोएं और 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन वाले पीबीएस के 300 माइक्रोन में दाग कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    3. प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 2)का उपयोग करके कोशिकाओं पर बाकुलोवायरस gp64 अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें।
      नोट: प्रवाह साइटोमेट्री अधिग्रहण और विश्लेषण अनुभवजन्य के लिए गेटिंग रणनीति निर्धारित करें। कुल 10,000 सिंगल लाइव सेल हासिल किए जाते हैं। एसएफ9 सेल सतहों पर बाकुलोवायरस gp64 अभिव्यक्ति बाकुलोवायरस संक्रमण को इंगित करती है। 3-4 दिनों के बाद, अधिकांश एसएफ 9 कोशिकाएं बाकुलोवायरस से संक्रमित हो जाती हैं, जैसा कि बाकुलोवायरस जीपी64 अभिव्यक्ति(चित्रा 2)द्वारा सबूत है।
  4. जब कोशिकाएं व्यास(चित्रा 3)में वृद्धि के साथ 80%-90% व्यवहार्य होती हैं, तो कोशिकाओं और क्रायोप्रिजर्विज 1 x 107 कोशिकाओं को कीट संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 10% डिमेथाइल सल्फॉक्साइड के साथ -80 डिग्री सेल्सियस पर धीमी ठंड वाले कंटेनर में पूरक होती है। अगले दिन, टिप्स कोशिकाओं वाली ट्यूब को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन फ्रीजर में स्थानांतरित करें।
    नोट: बायोसेफ्टी स्तर 2 (बीएसएल-2) में मानक एसेप्टिक प्रयोगशाला तकनीक के बाद जैवसेफ्टी कैबिनेट में सेल संस्कृति का प्रदर्शन करें।

2. एएवी वेक्टर का उत्पादन

  1. दिन 1: बाकुलोवायरस संक्रमित टिप्स कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति Sf9 कोशिकाएं
    1. संस्कृति और 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल में 28 डिग्री सेल्सियस पर भोली Sf9 कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक शेखर इनक्यूबेटर में कीट सेल संस्कृति माध्यम के ४०० एमएल युक्त है कि AAV उत्पादन के लिए आवश्यक है । 3-4 दिनों के बाद सेल डेंसिटी 5 x 106 -6x 106 सेल्स/एमएल तक बढ़ जाती है।
      नोट: सीओ2 और आर्द्रता Sf9 कोशिकाओं के विकास के लिए महत्वपूर्ण कारक नहीं हैं।
    2. एसएफ 9 कोशिकाओं को या तो शेक फ्लास्क में या बायोरिएक्टर में इस प्रकार बीज दें।
      1. एक कक्षीय शेखर इनक्यूबेटर में फ्लास्क में AAV उत्पादन: 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल में एसएफ9 संस्कृति के बीज 400 एमएल के लिए एक पिपेट या पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करें। 125 आरपीएम और 28 डिग्री सेल्सियस पर कक्षीय शेखर स्थापित करें।
        नोट एएवी उत्पादन के पैमाने के आधार पर एक पेरिस्टाल्टिक पंप या मानक पिपेट का उपयोग करें।
      2. एक बायोरिएक्टर में एएवी उत्पादन: 2 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल में एसएफ9 संस्कृति के बीज1 एल के लिए एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करें। 28 डिग्री सेल्सियस पर खेती के लिए बायोरिएक्टर यूनिट पर बैग लोड करें। 01 साई पर बायोरिएक्टर बैग में 40% ऑक्सीजन जोड़ें। बायोरिएक्टर यूनिट को 20 डिग्री कोण पर स्थापित करें और 25 आरपीएम पर बैग को हिलाएं।
    3. प्रत्येक बीवी-AAV2-GFP (या चिकित्सीय जीन) और BV-AAV2-rep-cap TIPS कोशिकाओं की एक शीशी गल । कीट संस्कृति माध्यम के 20 एमएल के साथ कोशिकाओं को पतला करें और ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की व्यवहार्यता गणना करें। एक शेखर फ्लास्क या बायोरिएक्टर में सुसंस्कृत भोले Sf9 कोशिकाओं के सापेक्ष 1:10,000 के अनुपात में दोनों TIPS कोशिकाओं टीका।
      नोट: क्रायोप्रिजर्वेशन के कारण टिप्स कोशिकाओं का अस्तित्व कम हो जाता है, और जब सेल व्यवहार्यता ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग के साथ निर्धारित होती है तो वसूली दर लगभग 50% होती है। बड़े पैमाने पर आरएवी उत्पादन से पहले टिप्स कोशिकाओं और भोले Sf9 कोशिकाओं के अनुपात को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने के लिए एक प्रायोगिक प्रयोग करें।
  2. दूसरा दिन: संस्कृति निगरानी
    1. फसल एसएफ9 संस्कृति का 1 एमएल aseptically। सेल काउंट, व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए ट्राइपैन ब्लू डाई के साथ दाग।
  3. 3 दिन: संस्कृति की निगरानी और खिला
    1. फसल 1 एसएफ 9 संस्कृति के एमएल और सेल गिनती, व्यवहार्यता, और आकृति विज्ञान का विश्लेषण। स्टेप 1.3 में उल्लिखित एसएफ9 कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद बाकुलोवायरस संक्रमण की स्थिति की जांच करें।
      नोट: सेल व्यास में वृद्धि और साइटोपैथिक प्रभाव बाकुलोवायरस संक्रमण के संकेत हैं। व्यास में वृद्धि सेल व्यवहार्यता में कमी से पहले है, और इन मापदंडों का उपयोग एएवी उत्पादन के दौरान सेल फसल के समय को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इष्टतम समय बिंदु अनुभवजन्य निर्धारित करें।
    2. 1:5 के अनुपात में ताजा कीट संस्कृति माध्यम के साथ Sf9 संस्कृति फ़ीड ।
  4. 4 दिन: संस्कृति की निगरानी
    1. फसल 1 एसएफ 9 संस्कृति के एमएल और सेल गिनती, व्यवहार्यता, और आकृति विज्ञान का विश्लेषण। बायोरिएक्टर बैग से ऑक्सीजन की आपूर्ति डिस्कनेक्ट करें।
  5. 5 दिन: संस्कृति की निगरानी और फसल
    1. फसल 1 एसएफ 9 संस्कृति के एमएल और सेल गिनती, व्यवहार्यता, और आकृति विज्ञान का विश्लेषण। संस्कृति माध्यम और कोशिकाओं को फसल जब Sf9 सेल व्यवहार्यता के आसपास ५०%(चित्रा 4)में कमी आई है ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2100 x ग्राम पर सेल निलंबन स्पिन। सुपरनैंट और सेल पेलेट को इकट्ठा करें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. कोशिकाओं की लाइसिस और एएवी की रिहाई

  1. एएवी निर्माता सेल गोली गल। सेल लाइसिस बफर (20 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 8.0, 150 एमएम सोडियम क्लोराइड, 0.5% ट्राइटन-एक्स-100) के 100 एमएल को सेल पैलेट में डालें, तेजी से मिलाएं, और एएवी कणों को छोड़ने के लिए परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2100 × जी पर सेंट्रलाइज और सेल lysate एक नए कंटेनर में स्थानांतरित करें। विगलन के बाद सेल लिएट और सेल कल्चर सुपरनेट मिलाएं।
  3. डीएनए और आरएनए को पचाने के लिए सेल में 20 यू/एमएल न्यूक्लियीज और 10 एमएमएल एमजीसीएल2 डालें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  4. एक पंप का उपयोग कर 0.8 माइक्रोन और 0.2 μmpolyethersulfone दोहरी छानने का काम प्रणाली के माध्यम से lysate फ़िल्टर करें।
  5. स्पष्ट सेल को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या एएवी को तुरंत शुद्ध करें।

4. एएवी वेक्टर का शुद्धिकरण आत्मीयता कॉलम क्रोमेटोग्राफी प्रणाली का उपयोग करके

  1. 50 मिलीएल/मिनट की प्रवाह दर पर बाँझ पानी, 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड, पानी, और फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस, पीएच 7.4) के साथ नमूना और बफर लाइनों को क्रमिक रूप से धोकर क्रोमेटोग्राफी उपकरण तैयार करें।
  2. क्रोमेटोग्राफी सिस्टम में एवीबी सेफरोज कॉलम (10.0 एमएल) माउंट करें, और 5 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर पीबीएस के 100 एमएल को चलाएं।
    नोट: एएवी उत्पादन के पैमाने के आधार पर एवीबी सेफरोज कॉलम की कम या अधिक मात्रा का उपयोग करें और कॉलम या राल निर्माता (सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा सुझाए गए प्रवाह दर को स्थापित करें।
  3. कॉलम पास-थ्रॉलेज के अंशों को इकट्ठा करने के लिए, बफर को धोएं, और एएवी कणों वाले एल्यूशन बफर, क्रोमेटोग्राफी उपकरण के अंश कलेक्टर स्लॉट में ट्यूब डालें।
  4. 5.0 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर पीबीएस के साथ कॉलम को बराबरी दें।
  5. एक नमूना पंप से लैस क्रोमेटोग्राफी मशीन का उपयोग कर स्तंभ पर एएवी कणों युक्त फ़िल्टर सेल lysate लोड करें। प्रति मिनट 3.0 एमएल की प्रवाह दर पर नमूना चलाएं।
  6. पराबैंगनी (यूवी) अवशोषण वक्र (280 एनएम) बेसलाइन पर लौटता है और स्थिर हो जाता है जब तक 3.0 एमएल/
  7. 3.0 एमएल/मिनट(चित्रा5) की प्रवाह दर पर 50 m सोडियम साइट्रेट (पीएच 3.0) बफर के साथ कॉलम से एएवी कणों को एल्यूट करें।
    नोट: जबकि एएवी कण राल से अलग होते हैं और यूवी डिटेक्टर से गुजरते हैं, तो क्रोमेटोग्राम पर प्रोटीन का एक एल्यूशन पीक देखा जा सकता है।
  8. अम्लीय एल्यूशन बफर के साथ पीएच-मध्यस्थता को रोकने के लिए लगभग पीएच 5.5 के लिए सुपरनेट युक्त एएवी के पीएच को बढ़ाने के लिए 500 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) की पांचवीं मात्रा के साथ एएवी सुपरनेटेंट को तुरंत पतला करें। इसके अलावा, पीएच को पूरी तरह से बेअसर करने के लिए पीबीएस के साथ एएवी सुपरनेट 10 गुना को पतला करें।
    नोट: आरडब्ल्यूएवी समाधान को बेअसर करने के बाद पीएच मूल्य लगभग 5.5 है। एएवी को बेअसर करने के बाद, आरएवी समाधान को पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ 10 गुना पतला करें ताकि एएवी एक फिजियोलॉजिकल बफर में हो।
  9. लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण से एएवी की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्येक कॉलम रन-थ्रेड नमूनों, वॉश बफर और एल्यूटेड एएवी सुपरनेट के 100 माइक्रोन के 1 एमसीएल स्टोर करें।
  10. 5.0 मिलियन/मिनट की प्रवाह दर पर 100 मिलियन मीटर साइट्रिक एसिड (पीएच 2.1) और पीबीएस (पीएच 7.4) के 100 मिलियन एमएल के साथ एवीबी सेफरोज कॉलम को साफ करें। 5.0 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर 20% इथेनॉल के साथ कॉलम कुल्ला और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  11. धारा 4.1 में वर्णित कॉलम ऑफलाइन स्थिति के साथ क्रोमेटोग्राफी उपकरण की पाइपलाइनों को साफ करें। अंत में, 50.0 मिलील/न्यूनतम की प्रवाह दर पर 20% इथेनॉल के 200 मिलील के साथ क्रोमेटोग्राफी प्रणाली को कुल्ला और 20% इथेनॉल में स्टोर करें।

5. स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन (TFF) का उपयोग कर एएवी वेक्टर की एकाग्रता और डायफिर्टेशन

  1. एएवी को केंद्रित करने के लिए पॉलीसुल्फोन झिल्ली कारतूस (100 केडीए आणविक वजन कट ऑफ) से लैस टीएफएफ प्रणाली स्थापित करें।
  2. 10 मिनट के लिए पीबीएस के 200 एमएल के साथ टीएफएफ मॉड्यूल को इक्विलिब्रेट करें।
  3. 2-3 साई पर ट्रांस-झिल्ली दबाव बनाए रखते हुए पंप के प्रवाह को नियंत्रित करके एएवी नमूना लोड करें जब तक कि नमूना वांछित मात्रा तक कम न हो जाए।
  4. इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पीबीएस के 100 एमएल के साथ रीटलेट को डायलेट करें, या अनुभवजन्य रूप से वैकल्पिक बफर को परिभाषित करें जो एएवी की दीर्घकालिक स्थिरता का समर्थन करता है।
  5. एएवी नमूने को वांछित मात्रा में केंद्रित करने के बाद, एएवी नमूने को एकत्र करें, इसे 0.2 माइक्रोन पॉलीएथर्सल्फोफेफ्टर, एलिकोट के माध्यम से फ़िल्टर करें, और फिर इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. शुद्धिकरण चरणों में एएवी की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं में एएवी नमूनों का संक्रमण

  1. टीका 7 x 104 HT1080 कोशिकाओं/अच्छी तरह से Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) के ५०० माइक्रोन में एक 24 अच्छी तरह से थाली में 1% एल ग्लूटामाइन, 1% सोडियम pyruvate, और 10% भ्रूण बोजातीय सीरम (FBS) संक्रमण से पहले दिन के साथ पूरक । 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं संस्कृति ।
  2. संक्रमण से पहले कोशिकाओं की गणना करें। कॉलम चलाने से पहले पतला अप्रीकृत एएवी थोक नमूना जोड़ें, कॉलम रन-थ्री सैंपल, वॉश बफर, और शुद्ध शुद्ध एएवी नमूना।
    नोट: एक हीमोसाइटोमीटर के साथ ट्राइपैन नीले दाग कोशिकाओं की गणना करें। एएवी नमूनों के कमजोर पड़ने वाले कारक और मात्रा (μL) को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करें। एएवी टाइटर्स जितना अधिक होगा, उतना ही कमजोर पड़ने की जरूरत है। सुनिश्चित करें कि कॉलम चलाने से पहले अशुद्ध थोक नमूने के बाकुलोवायरस कण, कॉलम रन-थ्यिंग-थ्राइड सैंपल, वॉश बफर को एएवी के संक्रामक टाइटर्स निर्धारित करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करने से पहले 50 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी-निष्क्रिय किया जाता है।
  3. संक्रमण के दो दिन बाद, प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति (जैसे, जीएफपी या चिकित्सीय जीन) का विश्लेषण करें।
  4. संक्रमण, कमजोर पड़ने कारक, और सूत्र के साथ जीएफपी + कोशिकाओं के प्रतिशत के समय कोशिकाओं की संख्या का उपयोग करके एएवी के संक्रामक टाइटर्स की गणना करें: (कोशिकाओं की कुल संख्या एक्स प्रतिशत जीएफपी + कोशिकाओं एक्स कमजोर पड़ने का कारक)/मिलीलीटर में एएवी की मात्रा।
    नोट: उदाहरण के लिए, कोशिकाओं की संख्या 1 x 105है, जीएफपी + कोशिकाओं का प्रतिशत 3.4% है, कमजोर पड़ने का कारक 100 है, और एएवी जोड़े की मात्रा 2 माइक्रोल है। एएवी का टाइटर 1.7 x 108 संक्रामक इकाई (आईयू) /एमएल है। eluted अंश के 25 एमएल में शुद्ध एएवी कणों की कुल मात्रा ४.३ x 109 संक्रामक इकाइयों (आईयू) /एमएल(चित्रा 6)है । प्रारंभिक अशुद्ध एएवी कणों की कुल संख्या 1.09 x 1010 आईयू/एमएल है, और शुद्ध एएवी कण 4.3 x 109 आईयू/एमएल हैं। इसलिए वसूली का प्रतिशत 39.4% है। जीएफपी + कोशिकाओं का प्रतिशत 1%-30% के बीच होना चाहिए, जो एएवी के संक्रामक टाइटर की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने पर रैखिक सीमा से मेल खाता है। यदि अधिक केंद्रित एएवी वेक्टर कण लक्ष्य कोशिकाओं में संक्रमित होते हैं; एक संभावना है कि एएवी कणों की कई प्रतियां एक एकल कोशिका को संक्रमित कर सकती हैं जो वेक्टर की एक प्रति के रूप में दिखाई देगी। इसलिए, लक्ष्य कोशिकाओं में 1%-30% वेक्टर संक्रमण प्राप्त करने के लिए एएवी वेक्टर सुपरनेटेंट को पतला करें। यदि एएवी वेक्टर में रिपोर्टर जीन नहीं है, तो एएवी वेक्टर द्वारा व्यक्त किए गए ट्रांसजीन या चिकित्सीय जीन को एक फ्लोरोसेंट डाई युक्त एंटीबॉडी के साथ दाग दें जिसका पता लगाया जा सकता है और प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके क्वांटेट किया जा सकता है। सभी एएवी सेरोटाइप HT1080 कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक संक्रमित नहीं कर सकते हैं। इसलिए, अन्य एएवी सेरोटाइप के लिए संक्रमित परख करने के लिए, विभिन्न सेल लाइनों का उपयोग करें। शुद्धिकरण से पहले और HT1080 कोशिकाओं पर शुद्धि के बाद AAV2-GFP कणों टाइटर और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा GFP अभिव्यक्ति को मापने । शुद्ध एएवी कणों की संख्या और शुद्धिकरण से पहले एएवी कणों की संख्या १०० से गुणा के अनुपात से वसूली (%) की गणना करें ।

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Representative Results

यहां, एसएफ 9 कीट कोशिका प्रणाली का उपयोग करके एएवी वैक्टर के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए प्रक्रिया विकास के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं। इस विधि में बाकुलोवायरस-संक्रमित टिप्स कोशिकाओं के साथ Sf9 कोशिकाओं की सह-संस्कृति, विकास माध्यम के साथ कोशिकाओं को खिलाना, एएवी कणों को छोड़ने के लिए उत्पादक कोशिकाओं की कटाई और लाइसिस, नाभिक उपचार के साथ कोशिका को lysate का स्पष्टीकरण, अपकेंद्री और निस्पंदन, एवीबी सेफ्रेरोज आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके AAV की शुद्धि, और TFF(चित्रा 1)के साथ एकाग्रता शामिल है ।

टिप्स कोशिकाएं बीवी-एएवी2-जीएफपी या चिकित्सीय जीन और बीवी-एएवी2-प्रतिनिधि-कैप के संक्रमण से अलग से Sf9 कोशिकाओं में उत्पन्न होती हैं । अधिकांश एसएफ 9 कोशिकाएं संक्रमण के कई दौरों के कारण 3-4 दिनों में बाकुलोवायरस से संक्रमित हो जाती हैं, जिसका सबूत बाकुलोवायरस ग्लाइकोप्रोटीन gp64 अभिव्यक्ति में(चित्रा 2)और कोशिकाएं व्यास(चित्र 3)में वृद्धि दिखाती हैं। टिप्स कोशिकाओं को संक्रमण के बाद 3-4 दिन काटा जाता है और क्रायोप्रेरेवित किया जाता है। Sf9 कोशिकाओं को टिप्स कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी किया जाता है जो संस्कृति माध्यम में बाकुलोवायरस कणों को स्रावित करते हैं जो भोले Sf9 कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं। बाकुलोवायरस प्रतिकृति-सक्षम है; इसलिए, संक्रमित कोशिकाओं की संख्या तेजी से नए उत्पादित बाकुलोवायरस कणों कि संस्कृति माध्यम8,9में स्रावित कर रहे है के साथ कई गोल संक्रमण से बढ़ जाती है . कोशिकाएं व्यास, साइटोपैथिक प्रभाव में वृद्धि दिखाती हैं, और लगभग आधी कोशिकाएं संक्रमण के बाद 5 दिनों में मर जाती हैं, जो एएवी उत्पादन(चित्र 4)के पूरा होने के संकेत हैं।

एएवी उत्पादक कोशिकाओं को कम गति वाले अपकेंद्रीकरण द्वारा काटा जाता है, जो एएवी को सेल lysate में जारी करने के लिए डिटर्जेंट युक्त बफर के साथ काटा जाता है। इसके बाद डीएनए और आरएनए के पाचन के लिए नाभिक के साथ इलाज किया जाता है ताकि चिपचिपाहट को कम किया जा सके, 0.8 माइक्रोन और 0.2 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया गया, और बाद में शुद्ध और केंद्रित किया जाता है। कोशिका lysate एक क्रोमेटोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर एक एवीबी Sepharose कॉलम पर लोड किया जाता है । एवीबी सेफरोज राल कैप्सिड प्रोटीन के प्रति अपनी आत्मीयता के कारण AAV2 कणों को बांधता है । वॉश बफर को एवीबी सेफेरोज कॉलम के माध्यम से चलाया जाता है ताकि पराबैंगनी (यूवी) अवशोषण वक्र (280 एनएम) बेसलाइन पर स्थिर न हो जाए। चूंकि एएवी कण एवीबी सेफरोज को दृढ़ता से बांधते हैं, इसलिए धोने के दौरान AAV2 कणों की कोई महत्वपूर्ण संख्या का पता नहीं चला है। एएवी कणों को अम्लीय बफर (पीएच 3.0) के साथ अलग किया जाता है, जो एएवी कणों और एवीबी सेफरोज राल के बीच बातचीत को अलग करता है। अम्लीय समाधान द्वारा एएवी के पीएच-मध्यस्थता क्षरण को रोकने के लिए, एलूंट को क्षारीय बफर (पीएच 8.0) के साथ निष्प्रभावी कर दिया जाता है। प्रोटीन की एक चोटी को एवी अंश(चित्रा 5 और चित्रा 6) के अनुरूप अम्लीय बफर के साथ कम होने के दौरान देखा जाता है। शुद्ध एएवी को पीबीएस के साथ 10 गुना पतला किया जाता है, जो टीएफएफ सिस्टम के साथ केंद्रित और बफर का आदान-प्रदान होता है। इस उदाहरण में, सेल लिसेट (560 एमएल) में कुल एएवी कण 1.1 x 1014 वेक्टर जीनोम (वीजी) हैं, एवीबी सेफ्रोज क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण (25 एमएल) के बाद 4.1 x 1013 वीजी हैं, और टीएफएफ (25 एमएलए) के साथ एकाग्रता के बाद 2.4 x10 13 वीजी हैं। शुद्ध एएवी नमूने एसडीएस-पेज और सिल्वर स्टेनिंग(चित्रा 7)के बाद तीन अलग-अलग कैप्सिड प्रोटीन, वीपी1, वीपी2 और वीपी 3 दिखाते हैं

Figure 1
चित्रा 1:एएवी वेक्टर के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए एक योजनाबद्ध आरेख । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:एसएफ 9 कोशिकाओं में बाकुलोवायरस जीपी64 अभिव्यक्ति का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। बाकुलोवायरस संक्रमित Sf9 कोशिकाओं को एक माउस एंटी-बकुलोवायरस gp64 एंटीबॉडी से सना हुआ है जिसमें फ्लोरोसेंट डाई होती है, जिसका पता फ्लो साइटोमेट्री द्वारा लगाया जाता है । (A)असंक्रमित Sf9 कोशिकाएं। (ख)बाकुलोवायरस संक्रमित Sf9 कोशिकाओं के अधिकांश कोशिकाओं में gp64 अभिव्यक्ति दिखा रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:बाकुलोवायरस-संक्रमित Sf9 (TIPS) कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। बाकुलोवायरस टिप्स कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए Sf9 कोशिकाओं में संक्रमित है। (A)असंक्रमित Sf9 कोशिकाएं। (ख)बाकुलोवायरस संक्रमित Sf9 (TIPS) कोशिकाएं । कोशिकाओं को 200x आवर्धन पर दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एएवी उत्पादन के दौरान बाकुलोवायरस संक्रमित Sf9 कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। टिप्स कोशिकाएं बाकुलोवायरस को स्रावित करती हैं जो एएवी उत्पादन के दौरान सह-संस्कारी भोली एसएफ9 कोशिकाओं को संक्रमित करती हैं। (A)असंक्रमित Sf9 कोशिकाएं। (ख)बाकुलोवायरस संक्रमित Sf9 कोशिकाओं व्यास में वृद्धि दिखाते हैं । संक्रमण के पांच दिन बाद, लगभग आधी कोशिकाएं मर जाती हैं (ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग के बाद एक उल्टे चरण माइक्रोस्कोप के नीचे कल्पना)। लाल तीर जीवित कोशिकाओं को इंगित करते हैं, और नीले तीर मृत कोशिकाओं को इंगित करते हैं। कोशिकाओं को 200x आवर्धन पर दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:एवीबी सेफरोज कॉलम क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके एएवी शुद्धि। एक क्रोमेटोग्राम कॉलम, धोने और एल्यूशन पर नमूना लोडिंग के दौरान 280 एनएम पर प्रोटीन नमूनों के अवशोषण को दर्शाता है। फिगर में फिट होने के लिए क्रोमेटोग्राम को संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:कॉलम, धोने और एल्यूशन पर लोड करने के दौरान प्रवाह के माध्यम से संक्रामक एएवी कणों की संख्या। 10 एमएल एवीबी सेफरोज कॉलम पर कुल 560 एमएल एएवी नमूने भरे जाते हैं। कॉलम लोड के लिए अंश की मात्रा 50 एमएल है, कॉलम वॉश 50 एमएल है, और एल्यूशन 25 एमएल है। एएवी टाइटर्स को कॉलम पर लोड करते समय कॉलम, धुलाई और शुद्धि के प्रत्येक चरण में एएवी की उपस्थिति की जांच करने के लिए उन्मूलन के माध्यम से कॉलम रन-थ्रेड नमूनों के साथ HT1080 कोशिकाओं के संक्रमण के बाद मापा जाता है। कुल शुद्ध एएवी उपज 4.3 x 109 संक्रामक इकाइयां हैं। प्रत्येक हीरे के आकार का प्रतीक प्रत्येक अंश में एएवी की संक्रामक इकाइयों (आईयू) का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7। एसडीएस-पेज और शुद्ध एएवी वेक्टर के चांदी धुंधला कैप्सिड प्रोटीन दिखा । कम AAV नमूने एसडीएस-पेज पर चलाए जाते हैं, और चांदी धुंधला किया जाता है । एएवी कैप्सिड प्रोटीन, वीपी1, वीपी2 और वीपी 3 के तीन अलग-अलग बैंड दिखाई दे रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

उत्पादन, शुद्धिकरण, और एएवी वैक्टर की एकाग्रता की प्रक्रिया के विकास के लिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल मापदंडों जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए AAV वैक्टर के दोनों छोटे और बड़े पैमाने पर विनिर्माण के लिए लागू किया जा सकता है । पूरी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्रक्रिया को वर्तमान अच्छी विनिर्माण प्रथाओं (सीजीएमपी) के साथ संगत बंद प्रणाली में किया जा सकता है। Sf9-baculovirus प्रणाली के प्रमुख फायदे एक किफायती लागत पर बड़े पैमाने पर जीएमपी ग्रेड एएवी उत्पादन के लिए स्केलेबिलिटी हैं। सिस्टम को महंगे प्लाज्मिड और ट्रांसफैक्शन रिएजेंट्स की आवश्यकता नहीं है, जो HEK293 कोशिकाओं का उपयोग करके एएवी के उत्पादन के लिए आवश्यक हैं। यह बताया गया है कि दोनों HEK293 कोशिकाओं और Sf9 कोशिकाओं समान गुणवत्ता AAV वैक्टर (एरिक डी Horowitz, ASGCT २०१८, सार #100) उपज । बड़ी चुनौती यह है कि इस प्रणाली के लिए बाकुलोवायरस और टिप्स कोशिकाओं की पीढ़ी की आवश्यकता होती है जिन्हें एक महत्वपूर्ण समय और प्रयास की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल में, दो प्रकार की टिप्स कोशिकाओं (टूबेक सिस्टम) का उपयोग किया गया था: एक टिप्स सेल जिसमें एवीवी-जीन ट्रांसफर कैसेट के साथ बाकुलोवायरस होता है और एक अन्य टिप्स सेल जिसमें एवीवी-प्रतिनिधि-कैप होता है। वनबाक सिस्टम2,16,17 एक ही बाकुलोवायरस में एवीवी जीन ट्रांसफर कैसेट और रिप-कैप जीन दोनों युक्त टिप्स कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकता है। OneBac प्रणाली दो के बजाय दो के बजाय टिप्स कोशिकाओं के केवल एक सेट का उपयोग कर RAAV का उत्पादन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो आगे प्रोटोकॉल को सरल बनाएगा ।

यह प्रोटोकॉल Sf9 कोशिकाओं में एएवी उत्पादन का वर्णन करता है। एक अच्छा एएवी उपज प्राप्त करने के लिए भोली Sf9 कोशिकाओं के निर्माता के लिए बाकुलोवायरस संक्रमित टिप्स कोशिकाओं के अनुपात को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। यदि यह अनुपात उप-इष्टतम है, तो एएवी की उपज11कम हो जाएगी। उदाहरण के लिए, यदि टिप्स और उत्पादक कोशिकाओं के उप-इष्टतम अनुपात के कारण उत्पादक कोशिकाओं में कैप्सिड की तुलना में जीन ट्रांसफर वैक्टर युक्त अधिक एएवी आईटीआर उत्पन्न होते हैं, तो सभी उपलब्ध जीन ट्रांसफर वैक्टर को पूर्ण एएवी कणों का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त कैप्सिड नहीं मिलेंगे । दूसरी ओर, यदि उत्पादक कोशिकाओं में एएवी जीन ट्रांसफर वैक्टर की तुलना में अधिक कैप्सिड उत्पन्न होते हैं, तो सभी कैप्सिड्स को एवीवी आईटीआर नहीं मिलेगा जिसमें जीन ट्रांसफर वैक्टर होते हैं जिसके परिणामस्वरूप खाली एएवी कण होते हैं ।

जैसे-जैसे कोशिकाएं गुणा करती हैं, संस्कृति माध्यम के पोषक तत्व समाप्त हो जाते हैं, और मेटाबोलिक अपशिष्ट उत्पाद जमा होते हैं। इसलिए, कोशिका संस्कृति में 20% ताजा विकास माध्यम की पूरकता 2 दिन के बाद सह टिप्स कोशिकाओं और Sf9 कोशिकाओं की संस्कृति AAV titers काफी वृद्धि कर सकते है (Amine ए Kamen, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद कनाडा, व्यक्तिगत संचार) ।

आईएवी कणों की शुद्धता इन विट्रो और वीवो अध्ययन3,5दोनों के लिए बिना किसी साइटोटॉक्सिकिटी के लक्षित कोशिकाओं के प्रभावी लेनदेन को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । इसलिए, एक क्रोमेटोग्राफी चरण शामिल करना महत्वपूर्ण है जो चुनिंदा एएवी कणों को शुद्ध कर सकता है और मेजबान सेल प्रोटीन और मलबे, जीनोमिक और बाकुलोवायरल डीएनए, और एकत्रित और खंडित वैक्टर जैसी अशुद्धियों को खत्म कर सकता है। एवीबी सेफरोज कॉलम पर एएवी सुपरनेट लोड करते समय, एएवी कणों की उपस्थिति के लिए प्रवाह-माध्यम के नमूनों की जांच करना महत्वपूर्ण है जो राल के लिए बाध्यकारी बिना कॉलम से गुजर सकते हैं। यदि ऐसा है, (1) एक कम चलाने की गति है कि एक लंबे समय तक निवास समय में परिणाम AAV कणों बाध्यकारी के लिए आवश्यक हो जाएगा, (2) कॉलम पर लोड नमूने की मात्रा को कम किया जाना चाहिए, और/या (3) AVB Sepharose की मात्रा में वृद्धि की जानी चाहिए, ताकि स्तंभ की बाध्यकारी क्षमता AAV कणों की संख्या से अधिक कभी नहीं । उच्च प्रवाह दर पर एवीवी सेफरोज राल की क्षमता और उच्च आत्मीयता और क्षमता के साथ एएवी कणों को बांधने की क्षमता शुद्धिकरण समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। एवीबी सेफरोज की प्रमुख सीमा यह है कि यह एएवी सेरोटाइप्स 1, 2 और 5 की कैप्सिड को बांधता है। इसलिए, विभिन्न क्रोमेटोग्राफी रेजिन का परीक्षण किया जाना चाहिए और अन्य एएवी सीरोटाइप18के शुद्धिकरण के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। यहां वर्णित डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का उपयोग एचईके 293 कोशिकाओं में उत्पादित एएवी को शुद्ध करने के लिए भी किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल एएवी को सेल लैस से शुद्ध कर सकता है लेकिन खाली कणों को नहीं हटा सकता। कुछ लेखों में ऐसे तरीकों का वर्णन किया गया है जो शुद्ध एएवी स्टॉक19,20में खाली बनाम पूर्ण एएवी कणों को अलग कर सकते हैं । हालांकि, हमारा मानना है कि खाली कणों की पीढ़ी को कम करने के लिए अपस्ट्रीम प्रक्रिया स्तर पर एएवी उत्पादन को अनुकूलित किया जाना चाहिए । यदि उत्पादक कोशिकाओं में एएवी जीन ट्रांसफर वेक्टर और कैप्सिड उत्पादन का अनुपात इष्टतम नहीं है, तो अधिक खाली कण उत्पन्न हो सकते हैं।

पूर्ण एएवी कणों को बाध्यकारी करने के अलावा, एवीबी सेफेरोज मध्यम खंडित एएवी कणों या कैप्सिड प्रोटीन को बांधता है जिसे टीएफएफ का उपयोग करके हटाया जा सकता है। कम आणविक वजन कणों के अधिकांश कॉलम क्रोमेटोग्राफी के TFF कदम नीचे शामिल करके एएवी नमूनों से समाप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, TFF का उपयोग बफर एक्सचेंज/डायफिल्ट्रेशन करने और एएवी10, 21को केंद्रित करने के लिए कियाजाताहै।

यद्यपि एएवी लिसिट का अतिकेंद्रितीकरण सीज़ियम क्लोराइड या इओडेक्सानॉल ग्रेडिएंट के साथ छोटे पैमाने पर और पूर्व-नैदानिक ग्रेड एएवी शुद्धिकरण के लिए पसंदीदा तरीका है, यह विधि एएवी21, 22के बड़े पैमाने पर शुद्धिकरण के लिए स्केलेबल और कम उपयुक्त नहीं है।

अंत में, उत्पादन और एएवी के शुद्धिकरण की प्रक्रिया के विकास के लिए यह प्रोटोकॉल विरासत में मिली आनुवंशिक बीमारियों के जीन थेरेपी के लिए पुनर्संयोजन एएवी के छोटे पैमाने पर पूर्व-नैदानिक और बड़े पैमाने पर विनिर्माण के लिए उपयोगी होगा ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम डॉ रॉबर्ट एम कोटिन (राष्ट्रीय हृदय, रक्त और फेफड़े संस्थान, NIH) उदारता से हमें AAV प्लाज्मिड्स और डेनिएल Steele और रेबेका अर्नेस्ट (सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल) उनकी तकनीकी सहायता के लिए प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । यह काम सिनसिनाटी चिल्ड्रन रिसर्च फाउंडेशन से एमएन तक स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
2 L flasks ThermoFisher Scientific 431281 Flask for suspension culture
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of supernatants
24-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Adherent cell culture plate
250 mL flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn Software Cytiva 28976337 Chromatography system
AVB Sepharose High Performance Cytiva 28411210 Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFP In-house non-catalog AAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-cap In-house non-catalog AAV packaging vector
Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking buffer Santa Cruz Biotechnologies 516214 Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis buffer In-house Non-catalog item 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 L Cytiva 28937662 Bioreactor bag
Cleaning buffer In-house Non-catalog item 100 mM citric acid (pH 2.1) 
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For cryopreservation
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Elution buffer In-house Non-catalog item 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit  Pall Corporation 12941 Membrane filter
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture media Cytiva SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic Pump Pall Corporation Non-catalog item TFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
Microscope Nikon Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody Santa Cruz Biotechnologies 65498 PE Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tank Praxair Non-catalog item 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBS ThermoFisher Scientific 20012027 Wash buffer
Silver Staining kit ThermoFisher Scientific LC6100 Staining AAV capsid proteins
Sf9 cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Steile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge Pall Corporation OA100C12 TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0 ThermoFisher 15568025 Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50 Cytiva 28-9378-00 Bioreactor

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जीव विज्ञान अंक 179 एएवी बाकुलोवायरस एसएफ 9 कोशिकाएं बायोरिएक्टर क्रोमेटोग्राफी शुद्धि स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन
बाकुलोवायरस-कीट सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी) 2 वेक्टर के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए प्रक्रिया विकास
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Nasimuzzaman, M., Villaveces, S.,… More

Nasimuzzaman, M., Villaveces, S., van der Loo, J. C. M., Alla, S. Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System. J. Vis. Exp. (179), e62829, doi:10.3791/62829 (2022).

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