Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Разработка процесса производства и очистки переносчика аденоассоциированного вируса (AAV)2 с использованием системы культивирования клеток бакуловирус-насекомое

Published: January 13, 2022 doi: 10.3791/62829
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2,3, 1
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

Summary

В этом протоколе вектор AAV2 продуцируется путем совместного культивирования клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf9) с бакуловирусом (BV)-AAV2-зеленым флуоресцентным белком (GFP) или терапевтическим геном и инфицированными BV-AAV2-rep-cap клетками Sf9 в культуре суспензии. Частицы AAV высвобождаются из клеток с помощью моющего средства, осветляются, очищаются с помощью аффинной колоночной хроматографии и концентрируются методом тангенциальной фильтрации потока.

Abstract

Аденоассоциированные вирусы (AAV) являются перспективными векторами для применения генной терапии. Здесь вектор AAV2 продуцируется совместной культурой клеток Spodoptera frugiperda (Sf9) с клетками Sf9, инфицированными бакуловирусом (BV)-AAV2-GFP (или терапевтическим геном) и BV-AAV2-rep-cap в культуре суспензии без сыворотки. Клетки культивируются в колбе в орбитальном шейкере или волновом биореакторе. Для высвобождения частиц AAV клетки-продуценты лизируют в буфере, содержащем моющее средство, которое впоследствии осветляется низкоскоростным центрифугированием и фильтрацией. Частицы AAV очищают из лизата клеток с помощью колоночной хроматографии AVB Sepharose, которая связывает частицы AAV. Связанные частицы промывают PBS для удаления загрязняющих веществ и элюируют из смолы с использованием буфера цитрата натрия при рН 3,0. Кислый элюат нейтрализуют щелочным буфером Tris-HCl (pH 8,0), разбавляют фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS) и дополнительно концентрируют тангенциальной фильтрацией потока (TFF). Протокол описывает мелкомасштабное доклиническое производство векторов, совместимое с масштабированием до крупномасштабного клинического производства AAV для применения генной терапии человека.

Introduction

Аденоассоциированные вирусы (AAV) представляют собой парвовирусы человека без оболочки, содержащие одноцепочечную ДНК размером 4,6 кб. Векторы AAV имеют ряд преимуществ перед другими вирусными векторами для применения генной терапии1,2,3,4. AAV, естественно, некомпетентны к репликации, поэтому требуются вирус-помощник и хост-механизм для репликации. ААВС не вызывают никаких заболеваний и обладают низкой иммуногенностью у инфицированного хозяина3,5. AAV может инфицировать как покоящиеся, так и активно делящиеся клетки и может сохраняться в виде эписомы без интеграции в геном клеток-хозяев (AAV редко интегрируются в геном хозяина)1,3. Эти особенности сделали AAV желательным инструментом для применения в генной терапии.

Для генерации вектора переноса генов AAV трансгенная кассета, включая терапевтический ген, клонируется между двумя внутренними концевыми повторами (ITR), которые обычно получены из серотипа AAV 2. Максимальный размер от 5' ITR до 3' ITR, включая трансгенную последовательность, составляет 4,6 кб6. Разные капсиды могут иметь разный клеточный или тканевый тропизм. Поэтому капсиды следует выбирать на основе типа ткани или клетки, предназначенной для нацеливания с помощью вектора AAV7.

Рекомбинантные векторы AAV обычно продуцируются в клеточных линиях млекопитающих, таких как эмбриональные клетки почек человека, HEK293 путем транзиторной трансфекции вектора переноса генов AAV, AAV rep-cap и плазмид вируса-хелпера2,3. Тем не менее, существует несколько ограничений для крупномасштабного производства AAV путем переходной трансфекции адгезивных клеток HEK293. Во-первых, необходимо большое количество ячеек или роликовых бутылок. Во-вторых, необходимы высококачественные плазмидные ДНК и трансфекционные реагенты, что увеличивает стоимость изготовления. Наконец, при использовании адгезивных клеток HEK293 сыворотка часто необходима для оптимального производства, что усложняет последующую обработку1,2,3. Альтернативный метод производства AAV включает в себя использование клеточной линии насекомых, клеток Spodoptera frugiperda (Sf9) и вируса насекомых, называемого рекомбинантным Autographa californica multicapsid ядерным полигедрозом (AcMNPV или бакуловирус)8,9,10. Клетки Sf9 выращиваются в культуре суспензии без сыворотки, которая легко масштабируется и совместима с текущей надлежащей производственной практикой (cGMP) производства в больших масштабах, которая не требует плазмидных или трансфекционных реагентов. Более того, стоимость производства AAV с использованием системы Sf9-бакуловируса ниже, чем стоимость использования транзиторной трансфекции плазмид в клетки HEK29311.

Оригинальная система производства rAAV с использованием клеток бакуловируса-Sf9 использовала три бакуловируса: один бакуловирус, содержащий кассету переноса генов, второй бакуловирус, содержащий ген реп, и третий бакуловирус, содержащий серотип-специфический капсидный ген12,13. Тем не менее, структура бакуловируса, содержащая реп, была генетически нестабильной при множественных раундах проходов, что предотвращало усиление бакуловируса для крупномасштабного производства AAV. Чтобы решить эту проблему, была разработана новая векторная система rAAV, которая содержала два бакуловируса (TwoBac): один бакуловирус, содержащий кассету переноса генов AAV, и другой бакуловирус, содержащий гены AAV rep-cap вместе, которые генетически более стабильны, чем исходная система, и более удобны для производства rAAV из-за использования TwoBac вместо трех14, 15г. Система OneBac использует кассету переноса генов AAV и гены rep-cap в одном бакуловирусе, который более удобен для производства rAAV из-за использования одного бакуловируса вместо использования TwoBac или ThreeBac2,16,17. В нашем исследовании для оптимизации использовалась система TwoBac.

Система бакуловируса для производства AAV также имеет ограничения: частицы бакуловируса нестабильны для длительного хранения в безсыворочной среде11,а если титр бакуловируса низкий, необходим большой объем супернатанта бакуловируса, который может стать токсичным для роста клеток Sf9 во время производства AAV (личное наблюдение). Использование клеток сохранения и масштабирования инфицированных клеток без титров (TIPS) или инфицированных бакуловирусом насекомых (BIIC) обеспечивает хороший вариант для производства AAV, в котором клетки Sf9, инфицированные бакуловирусом, подготавливаются, криоконсервируются и впоследствии используются для заражения свежих клеток Sf9. Еще одним преимуществом является повышенная стабильность бакуловируса (БВ) в клетках Sf9 после криоконсервации10,11.

Для обеспечения производства AAV генерируются два типа клеток TIPS: первый путем заражения клеток Sf9 BV-AAV2-GFP или терапевтическим геном, а второй - путем заражения клетки Sf9 BV-AAV2-rep-cap. Клетки TIPS криоконсервируются в небольших и готовых к использованию аликвотах. Векторы AAV получают в культуре суспензии без сыворотки в колбе, помещенной в орбитальный шейкер или волновой биореактор путем совместного культивирования клеток TIPS, которые продуцируют бакуловирусы и свежие клетки Sf9. Клетки Sf9 инфицированы бакуловирусами, которые несут вектор AAV2-GFP и последовательности rep-cap для генерации AAV. Четыре-пять дней спустя, когда выход AAV самый высокий, клетки-продуценты лизируются моющим средством для высвобождения частиц AAV. Клеточный лизат впоследствии осветляют низкоскоростным центрифугированием и фильтрацией. Частицы AAV очищаются из лизата с помощью колоночной хроматографии AVB Sepharose. Наконец, векторы AAV концентрируются с использованием TFF. Протокол описывает производство AAV в небольших масштабах, полезных для исследований и доклинических исследований. Тем не менее, методы являются масштабируемыми и совместимыми с производством клинических векторов AAV для применения генной терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

См. рисунок 1 для иллюстрации, обобщающей протокол.

1. Генерация инфицированных бакуловирусом клеток TIPS

  1. Разморозьте один флакон клеток Sf9 и немедленно засейте их в 50 мл культуральной среды клеток насекомых. Выращивают клетки Sf9 в орбитальном шейкерном инкубаторе при 125 об/мин и 28 °C в колбах с круглым дном со слабо прикрепленным колпачком для обмена воздухом8,9. Размножайте клетки в колбе объемом 1 л, содержащей 200 мл среды, чтобы получить достаточное количество клеток для производства клеток TIPS.
  2. Добавьте 50 мл клеток Sf9 при 2 x 106 клетках/мл в двух колбах: заразите одну колбу клеток Sf9 0,5 мл бакуловируса (BV)-AAV2-GFP (или терапевтического гена), а другую колбу клеток 0,5 мл BV-AAV2-rep-cap.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Векторные плазмиды AAV были щедро предоставлены доктором Робертом М. Котином (NIH). Производство бакуловируса из ДНК бакмида (система Bac-to-Bac) было описаноранее 8,9. Стабильность бакуловируса во время прохождения является критической проблемой для масштабирования производства rAAV. Лучше использовать меньшее количество проходов бакуловируса (вплоть до прохода No 4). Определить оптимальный объем супернатанта бакуловируса эмпирически путем проверки эффективности бакуловирусной инфекции с помощью проточной цитометрии(рисунок 2)во время производства клеток TIPS.
  3. Контролировать бакуловирусную инфекцию через 3-4 дня после заражения путем окрашивания бакуловируса gp64 в инфицированные клетки Sf9 следующим образом.
    1. Окрашивать 2 х 105 клеток Sf9 (как неинфицированных, так и бакуловирус-инфицированных клеток) 0,5 мкг мышиного антитела против бакуловируса gp64 (1:200), содержащего флуоресцентный краситель в 100 мкл блокирующего буфера в течение 30 мин при температуре окружающей среды.
    2. Промыть клетки 1 мл PBS для удаления антитела и повторно суспендировать окрашенные клетки в 300 мкл PBS, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина.
    3. Анализ экспрессии бакуловируса gp64 на клетках с помощью проточной цитометрии(рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите стратегию сбора и анализа проточной цитометрии эмпирически. В общей сложности приобретается 10 000 одиночных живых клеток. Экспрессия бакуловируса gp64 на клеточных поверхностях Sf9 указывает на бакуловирусную инфекцию. Через 3-4 дня большинство клеток Sf9 заражаются бакуловирусом, о чем свидетельствует экспрессия бакуловируса gp64(рисунок 2).
  4. Когда клетки становятся жизнеспособными на 80%-90% с увеличениемдиаметра (фиг.3),собирают клетки и криоконсервируют 1 х 107 клеток в 1 мл питательной среды насекомых, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 10% диметилсульфоксидом в медленно замерзающем контейнере при -80 °C. На следующий день переложите трубку, содержащую ячейки TIPS, в морозильную камеру с жидким азотом для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите культивирование клеток в шкафу биобезопасности в соответствии со стандартным асептическим лабораторным методом на уровне биобезопасности 2 (BSL-2).

2. Производство вектора AAV

  1. День 1: Совместная культивирование клеток Sf9 с инфицированными бакуловирусом клетками TIPS
    1. Культивируйте и выращивайте наивные клетки Sf9 при 1х 10 6 клетках/мл при 28 °C в нескольких колбах по 2 л, содержащих 400 мл питательной среды для клеток насекомых, в шейкерном инкубаторе, который необходим для производства AAV. Через 3-4 дня плотность клеток увеличивают до 5 х 106-6 х 106 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CO2 и влажность не являются важными факторами для роста клеток Sf9.
    2. Засевайте клетки Sf9 либо в колбы для коктейлей, либо в биореактор следующим образом.
      1. Производство AAV в колбах в орбитальном шейкерном инкубаторе: Используйте пипетку или перистальтический насос для асептического семенного материала 400 мл культуры Sf9 при 2x 10 6 клетках/мл в колбу объемом 2 л. Установите орбитальный шейкер при 125 об/мин и 28 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ Используйте перистальтический насос или стандартную пипетку в зависимости от масштаба производства AAV.
      2. Производство AAV в биореакторе: Используйте перистальтический насос для посева 1 л культуры Sf9 при 2 х 106 клетках / мл в мешок биореактора объемом 10 л. Загрузите мешок на установку биореактора для культивирования при температуре 28 °C. Добавьте 40% кислорода в мешок биореактора при 0,1 фунта на кв. дюйм. Установите блок биореактора под углом 20° и встряхните мешок при 25 оборотах в минуту.
    3. Разморозьте один флакон каждой клетки BV-AAV2-GFP (или терапевтического гена) и BV-AAV2-rep-cap TIPS. Разбавьте клетки 20 мл питательной среды насекомых и проведите подсчет жизнеспособности клеток с помощью трипан-синего цвета. Инокулируют обе клетки TIPS в соотношении 1:10 000 относительно наивных клеток Sf9, культивируемых в шейкерной колбе или биореакторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выживаемость клеток TIPS снижается из-за криоконсервации, а скорость восстановления составляет примерно 50%, когда жизнеспособность клеток определяется с помощью окрашивания трипана синим цветом. Проведите пилотный эксперимент, чтобы эмпирически определить соотношение клеток TIPS и наивных клеток Sf9 перед крупномасштабным производством rAAV.
  2. День 2: Мониторинг культуры
    1. Собирают 1 мл культуры Sf9 асептически. Окрашивание синим красителем Трипан для анализа количества клеток, жизнеспособности и морфологии.
  3. День 3: Мониторинг культуры и кормление
    1. Соберите 1 мл культуры Sf9 и проанализируйте количество клеток, жизнеспособность и морфологию. Проверьте состояние бакуловирусной инфекции после окрашивания клеток Sf9, как указано в шаге 1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение диаметра клеток и цитопатический эффект являются признаками бакуловирусной инфекции. Увеличение диаметра предшествует снижению жизнеспособности клеток, и эти параметры используются для определения времени сбора клеток во время производства AAV. Определите оптимальную точку времени эмпирически.
    2. Подкармливайте культуру Sf9 свежей питательной средой насекомых в соотношении 1:5 в асептически.
  4. День 4: Мониторинг культуры
    1. Соберите 1 мл культуры Sf9 и проанализируйте количество клеток, жизнеспособность и морфологию. Отключите подачу кислорода из мешка биореактора.
  5. День 5: Мониторинг культуры и сбор урожая
    1. Соберите 1 мл культуры Sf9 и проанализируйте количество клеток, жизнеспособность и морфологию. Соберите культуральную среду и клетки, когда жизнеспособность клеток Sf9 снизилась примерно до 50%(рисунок 4).
    2. Открутите клеточную суспензию при 2100 х г в течение 15 мин при 4 °C. Соберите супернатант и ячейку гранулы и храните их при -80 °C.

3. Лизис клеток и высвобождение AAV

  1. Разморозьте гранулы ячейки-производителя AAV. Добавьте 100 мл буфера лизиса клеток (20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ хлорида натрия, 0,5 % Triton-X-100) в гранулу клетки, энергично перемешайте и инкубируйте в течение 30 мин при температуре окружающей среды для высвобождения частиц AAV.
  2. Центрифуга при 2100 × г в течение 30 мин при 4 °С и переносят лизат ячейки в новый контейнер. Смешайте лизат клеток и супернатант клеточной культуры после размораживания.
  3. Добавьте 20 Ед/мл нуклеазы и 10мМ MgCl2 в клеточный лизат для переваривания ДНК и РНК. Инкубировать в течение 2-4 ч при 37 °С.
  4. Фильтруйте лизат через систему двойной фильтрации 0,8 мкм и 0,2 мкмполиэтерсульфона с помощью насоса.
  5. Храните осветленный клеточный лизат при 4 °C в течение ночи или немедленно очистите AAV.

4. Очистка вектора AAV с помощью системы аффинной колоночной хроматографии

  1. Подготовьте хроматографический прибор путем последовательного промывания образца и буферных линий стерильной водой, 1 Н гидроксида натрия, водой и фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, pH 7,4) со скоростью потока 50 мл/мин.
  2. Установите колонну AVB Sepharose (10,0 мл) в систему хроматографии и запустите 100 мл PBS со скоростью потока 5 мл / мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте меньший или больший объем колонны AVB Sepharose в зависимости от масштаба производства AAV и установите скорость потока, предложенную производителем колонны или смолы (см. Таблицу материалов).
  3. Для сбора фракций столбчатого сквозного раствора, промывочного буфера и элюционного буфера, содержащего частицы AAV, вставьте трубки в щели фракционного коллектора прибора хроматографии.
  4. Уравновешивайте колонну с PBS со скоростью потока 5,0 мл/мин.
  5. Загрузите фильтрованный клеточный лизат, содержащий частицы AAV, на колонну с помощью хроматографической машины, оснащенной насосом для образцов. Запустите образец со скоростью потока 3,0 мл в минуту.
  6. Запускайте PBS через столбец AVB Sepharose со скоростью потока 3,0 мл/мин до тех пор, пока кривая поглощения ультрафиолета (УФ) (280 нм) не вернется к исходному уровню и не станет стабильной.
  7. Элюируют частицы AAV из колонны буфером 50 мМ цитрата натрия (рН 3,0) со скоростью потока 3,0 мл/мин(рисунок 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как частицы AAV диссоциируют от смолы и проходят через УФ-детектор, пик элюирования белка можно увидеть на хроматограмме.
  8. Немедленно разбавить супернатант AAV с одной пятой объема 500 мМ Tris-HCl (pH 8,0), чтобы увеличить pH AAV-содержащего супернатанта примерно до pH 5,5 для предотвращения pH-опосредованной деградации с помощью кислотного буфера элюирования. Кроме того, разбавьте супернатант AAV в 10 раз PBS, чтобы полностью нейтрализовать pH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение pH составляет приблизительно 5,5 после нейтрализации раствора rAAV. После нейтрализации AAV разбавляют раствор rAAV в 10 раз PBS (pH 7,4) так, чтобы AAV находился в физиологическом буфере.
  9. Храните 1 мл каждой колонны проходимых образцов, промывочный буфер и 100 мкл элюированного супернатанта AAV для оценки присутствия AAV путем инфицирования клеток-мишеней.
  10. Очистите колонну AVB Sepharose со 100 мл лимонной кислоты 100 мМ (рН 2,1) и 100 мл PBS (рН7,4) со скоростью потока 5,0 мл/мин. Промыть колонну 20% этанолом со скоростью потока 5,0 мл/мин и хранить при 4 °C.
  11. Очистите трубопроводы хроматографического прибора с помощью автономного положения колонки, как описано в разделе 4.1. Наконец, промыть систему хроматографии 200 мл 20% этанола со скоростью потока 50,0 мл /мин и хранить в 20% этаноле.

5. Концентрация и диафильтрация вектора AAV с помощью тангенциальной фильтрации потока (TFF)

  1. Настройте систему TFF, оснащенную полисульфоновой мембранным картриджем (100 кДа Molecular Weight Cut Off) для концентрирования AAV.
  2. Уравновешивайте модуль TFF с 200 мл PBS в течение 10 мин.
  3. Загрузите образец AAV, контролируя поток насоса до тех пор, пока образец не уменьшится до желаемого объема, сохраняя при этом трансмембранное давление на уровне 2-3 фунтов на квадратный дюйм.
  4. Диафильтрат ретентата со 100 мл PBS, как используется в этом исследовании, или эмпирически определить альтернативный буфер, который поддерживает долгосрочную стабильность AAV.
  5. После концентрации образца AAV до нужного объема, соберите образец AAV, отфильтруйте его через полиэфирсульфонфильтр 0,2 мкм, аликвоту, а затем храните его при -80 °C.

6. Инфицирование образцов AAV в клетки-мишени для оценки присутствия AAV на этапах очистки

  1. Инокулируйте 7 x 104 HT1080 клеток / лунку в 24-луночную пластину в 500 мкл модифицированной среды орла Dulbecco (DMEM), дополненной 1% L-глутамином, 1% пируватом натрия и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) за день до заражения. Культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
  2. Подсчитайте клетки до заражения. Добавьте разбавленный неочищенный объемный образец AAV перед прогоном колонны, пробами через колонну, буфером промывки и элюированным очищенным образцом AAV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте клетки, окрашенные в синий цвет Трипана, с помощью гемоцитометра. Определите коэффициент разрежения и объем (мкл) образцов AAV эмпирически. Чем выше титры AAV, тем большее разбавление необходимо. Убедитесь, что частицы бакуловируса неочищенного объемного образца перед прогоном колонны, прогоном колонны образцами, промывочным буфером инактивируются теплом при 50 °C в течение 50 мин перед заражением клеток-мишеней для определения инфекционных титров AAV.
  3. Через два дня после заражения проанализируйте экспрессию белка (например, GFP или терапевтического гена) в клетках с помощью проточного цитометра.
  4. Рассчитайте инфекционные титры AAV, используя количество клеток на момент заражения, коэффициент разбавления и процент клеток GFP+ по формуле: (Общее количество клеток x Процентное содержание GFP+ клеток x Коэффициент разбавления) / Объем AAV в миллилитрах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, количество ячеек составляет 1 х 105,процент клеток GFP+ составляет 3,4%, коэффициент разбавления составляет 100, а объем добавленного AAV составляет 2 мкл. Титр ААВ составляет 1,7 х 108 инфекционных единиц (МЕ)/мл. Общее количество очищенных частиц AAV в 25 мл элюированной фракции составляет 4,3 х 109 инфекционных единиц (МЕ)/мл(рис. 6). Общее количество исходных неочищенных частиц AAV составляет 1,09 x 1010 МЕ/мл, а очищенных частиц AAV - 4,3 x 109 МЕ/мл. Таким образом, процент восстановления составляет 39,4%. Процент клеток GFP+ должен составлять от 1% до 30%, что соответствует линейному диапазону при использовании для расчета инфекционного титра AAV. Если в клетки-мишени заражаются более концентрированные векторные частицы AAV; существует вероятность того, что несколько копий частиц AAV могут заразить одну клетку, которая будет отображаться как одна копия вектора. Поэтому разбавляют супернатант вектора AAV для получения 1%-30% векторной инфекции в клетках-мишенях. Если вектор AAV не имеет репортерного гена, окрасьте трансген или терапевтический ген, экспрессируемый вектором AAV, антителом, содержащим флуоресцентный краситель, который можно обнаружить и количественно определить с помощью проточного цитометра. Не все серотипы AAV могут эффективно инфицировать клетки HT1080. Поэтому для выполнения анализа инфекционности для других серотипов AAV используют разные клеточные линии. Титруйте частицы AAV2-GFP до очистки и после очистки на клетках HT1080 и измеряйте экспрессию GFP с помощью проточной цитометрии. Рассчитайте восстановление (%) по соотношению количества очищенных частиц AAV и количества частиц AAV до очистки, умноженного на 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь показаны репрезентативные результаты разработки процесса производства и очистки переносчиков AAV с использованием клеточной системы насекомых Sf9. Способ включает кокультуру клеток Sf9 с бакуловирус-инфицированными клетками TIPS, кормление клеток питательной средой, сбор и лизис клеток-продуцентов для высвобождения частиц AAV, осветление лизата клеток с помощью нуклеазной обработки, центрифугирование и фильтрацию, очистку AAV с использованием AVB Sepharose аффинной хроматографии и концентрацию с TFF(фиг.1).

Клетки TIPS генерируются инфекцией BV-AAV2-GFP или терапевтического гена и BV-AAV2-rep-cap в клетки Sf9 отдельно. Большинство клеток Sf9 заражаются бакуловирусом через 3-4 дня из-за множественных раундов инфекции, о чем свидетельствует экспрессия бакуловирусного гликопротеина gp64 в(Рисунок 2)и клетки показывают увеличениедиаметра (Рисунок 3). Клетки TIPS собирают через 3-4 дня после заражения и криоконсервируют. Клетки Sf9 культивируются совместно с клетками TIPS, которые секретируют частицы бакуловируса в питательной среде, которые заражают наивные клетки Sf9. Бакуловирус компетентен к репликации; Поэтому количество инфицированных клеток быстро увеличивается при множественных круглых инфекциях с вновь продуцируемыми частицами бакуловируса, которые секретируются вкультуральную среду 8,9. Клетки показывают увеличение диаметра, цитопатический эффект, и около половины клеток умирают через 5 дней после заражения, что является признаком завершения производства AAV(рисунок 4).

Клетки-продуценты AAV собираются путем низкоскоростного центрифугирования, лизирующего буфером, содержащим моющее средство, для высвобождения AAV в лизат клеток. Затем его обрабатывают нуклеазой для переваривания ДНК и РНК для снижения вязкости, фильтруют через мембрану 0,8 мкм и 0,2 мкм, а затем очищают и концентрируют. Клеточный лизат загружается в колонку AVB Sepharose с помощью системы хроматографии. AvB Sepharose смола связывает частицы AAV2 из-за ее сродства к белкам капсида. Буфер промывки проходит через колонну AVB Sepharose для удаления несвязанных и слабо связанных материалов до тех пор, пока кривая поглощения ультрафиолета (УФ) (280 нм) не станет стабильной на исходном уровне. Поскольку частицы AAV сильно связывают AVB Sepharose, во время стирки не обнаруживается значительное количество частиц AAV2. Частицы AAV элюируются кислотным буфером (pH 3,0), который диссоциирует взаимодействие между частицами AAV и AVB сефарозной смолой. Для предотвращения pH-опосредованной деградации AAV кислотным раствором элюант нейтрализуют щелочным буфером (pH 8,0). Пик белка наблюдается при элюировании кислотным буфером, соответствующим фракции AAV(Фиг.5 и Фиг.6). Очищенный AAV разбавляется в 10 раз PBS, концентрируется и буфер заменяется системой TFF. В этом примере суммарные частицы AAV в клеточном лизате (560 мл) составляют 1,1 х 1014 векторного генома (vg), после очистки хроматографии AVB Sepharose (25 мл) составляют 4,1 х 1013 вг, а после концентрации с TFF (25 мл) - 2,4 х 1013 вг. Очищенные образцы AAV показывают три различных капсидных белка, VP1, VP2 и VP3, после окрашивания SDS-PAGE и серебра(рисунок 7)

Figure 1
Рисунок 1:Принципиальная схема производства и очистки AAV Vector. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Анализ проточной цитометрии экспрессии бакуловируса gp64 в клетках Sf9. Инфицированные бакуловирусом клетки Sf9 окрашивают мышиным антибакуловирусным антителом gp64, содержащим флуоресцентный краситель, который обнаруживается методом проточной цитометрии. (A) Неинфицированные клетки Sf9. (B) Инфицированные бакуловирусом клетки Sf9 показывают экспрессию gp64 в большинстве клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Морфология бакуловирус-инфицированных клеток Sf9 (TIPS). Бакуловирус заражается клетками Sf9 для производства клеток TIPS. (A) Неинфицированные клетки Sf9. (B) Бакуловирус инфицированные Sf9 (TIPS) клетки. Ячейки показаны при 200-кратном увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Морфология инфицированных бакуловирусом клеток Sf9 во время производства AAV. Клетки TIPS секретируют бакуловирусы, которые заражают совместно культивируемые наивные клетки Sf9 во время производства AAV. (A) Неинфицированные клетки Sf9. (B)Инфицированные бакуловирусом клетки Sf9 показывают увеличение диаметра. Через пять дней после заражения почти половина клеток умирает (визуализируется под инвертированным фазовым микроскопом после окрашивания в синий цвет трипана). Красные стрелки указывают на живые ячейки, а синие стрелки — на мертвые клетки. Ячейки показаны при 200-кратном увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Очистка AAV с использованием колоночной хроматографии AVB Sepharose. Хроматограмма показывает поглощение белковых образцов при 280 нм при нагрузке образца на колонну, промывке и элюировании. Хроматограмма была модифицирована, чтобы соответствовать рисунку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6:Количество инфекционных частиц AAV в протекании при погрузке на колонну, промывке и элюировании. В общей сложности 560 мл образцов AAV загружаются на колонну AVB Sepharose объемом 10 мл. Объем фракции для нагрузки на колонну составляет 50 мл, промывки колонны - 50 мл, а элюирования - 25 мл. Титры AAV измеряются после заражения клеток HT1080 пробами колонны при загрузке на колонну, промывке и элюировании для исследования присутствия AAV на каждом этапе очистки. Общий выход очищенного AAV составляет 4,3 х 109 инфекционных единиц. Каждый ромбовидный символ представляет инфекционные единицы (МЕ) AAV в каждой фракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7. SDS-PAGE и серебряное окрашивание чистого вектора AAV, показывающего белки капсида. Уменьшенные образцы AAV запускаются на SDS-PAGE, и выполняется окрашивание серебром. Видны три различные полосы капсидных белков AAV, VP1, VP2 и VP3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Параметры, используемые в этом протоколе для разработки процесса производства, очистки и концентрации векторов AAV, могут быть применены как к мелкому, так и к крупномасштабному производству векторов AAV для применения в генной терапии. Весь процесс добычи и переработки может быть выполнен в закрытой системе, совместимой с текущей надлежащей производственной практикой (cGMP). Основными преимуществами системы Sf9-бакуловируса являются масштабируемость для крупномасштабного производства AAV GMP-класса по доступной цене. Система не нуждается в дорогостоящих плазмидах и трансфекционных реагентах, которые необходимы для производства AAV с использованием клеток HEK293. Сообщалось, что как клетки HEK293, так и клетки Sf9 дают векторы AAV одинакового качества (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Abstract #100). Основная проблема заключается в том, что эта система требует генерации бакуловирусов и клеток TIPS, которые требуют значительного времени и усилий.

В этом протоколе использовались два типа клеток TIPS (система TwoBac): одна клетка TIPS, содержащая бакуловирус с кассетой переноса генов AAV, и другая клетка TIPS, содержащая AAV-rep-cap. Система OneBac2,16,17 может генерировать клетки TIPS, содержащие как кассету переноса генов AAV, так и гены rep-cap в одном бакуловирусе. Система OneBac обеспечивает альтернативный подход к созданию rAAV с использованием только одного набора ячеек TIPS, а не двух, как описано в системе TwoBac, что еще больше упростит протокол.

Этот протокол описывает производство AAV в ячейках Sf9. Важно оптимизировать соотношение инфицированных бакуловирусом клеток TIPS к продуценции наивных клеток Sf9 для получения хорошего выхода AAV. Если это соотношение будет неоптимальным, выход AAV будет уменьшенна 11. Например, если генерируется больше AAV ITR, содержащих векторы переноса генов, чем капсидов в клетках-продуцентах из-за неоптимального соотношения TIPS и клеток-продуцентов, все доступные векторы переноса генов не получат достаточно капсидов для производства полных частиц AAV. С другой стороны, если генерируется больше капсидов, чем векторов переноса генов AAV в клетках-продуцентах, все капсиды не получат AAV ITR, содержащие векторы переноса генов, которые приводят к пустым частицам AAV.

По мере размножения клеток питательные вещества питательной среды истощаются, а продукты метаболизма накапливаются. Таким образом, добавление 20% свежей питательной среды в клеточную культуру через 2 дня после совместной культивирования клеток TIPS и клеток Sf9 может значительно увеличить титры AAV (Amine A. Kamen, National Research Council Canada, personal communication).

Чистота частиц AAV является критическим фактором для достижения эффективной трансдукции клеток-мишеней без какой-либо цитотоксичности как для исследований in vitro, так и in vivo 3,5. Поэтому важно включить этап хроматографии, который может избирательно очищать частицы AAV и устранять примеси, такие как белки и мусор клеток-хозяев, геномная и бакуловирусная ДНК, а также агрегированные и фрагментированные векторы. При загрузке супернатанта AAV на колонну AVB Sepharose крайне важно проверить проточные образцы на наличие частиц AAV, которые могут проходить через колонну без привязки к смоле. Если это так, то (1) для связывания частиц AAV потребуется более низкая скорость пробега, которая приводит к более длительному времени пребывания, (2) количество загруженного образца на колонку должно быть уменьшено и/или (3) объем AVB Sepharose должен быть увеличен, так что связующая способность колонки никогда не превышает количество частиц AAV. Способность смолы AVB Sepharose связывать частицы AAV с высокой скоростью потока и с высоким сродством и емкостью важна для сокращения времени очистки. Основным ограничением AVB Sepharose является то, что он связывает капсид серотипов AAV 1, 2 и 5. Поэтому различные хроматографические смолы должны быть протестированы и использованы для очистки других серотипов AAV18. Протокол последующей очистки, описанный в настоящем описании, также может быть использован для очистки AAV, продуцируемого в клетках HEK 293.

Этот протокол может очищать AAV от лизата клеток, но не может удалять пустые частицы. В нескольких статьях описаны методы, которые могут различать пустые и полные частицы AAV в очищенных запасах AAV19,20. Тем не менее, мы считаем, что производство AAV должно быть оптимизировано на уровне вышестоящего процесса, чтобы свести к минимуму образование пустых частиц. Если соотношение переноса гена AAV и производства капсида в клетках-продуцентах не является оптимальным, может образоваться больше пустых частиц.

В дополнение к связыванию полных частиц AAV, среда AVB Sepharose связывает фрагментированные частицы AAV или белки капсида, которые могут быть удалены с помощью TFF. Большинство низкомолекулярных частиц удаляются из образцов AAV путем включения шага TFF после колоночной хроматографии. Кроме того, TFF используется для выполнения буферного обмена/диафильтрации и для концентрирования AAV10,21.

Хотя ультрацентрифугирование лизата AAV хлоридом цезия или градиентом йодиксанола является предпочтительным методом для мелкомасштабной и доклинической очистки AAV, этот метод не является масштабируемым и менее подходящим для крупномасштабной очистки AAV21,22.

В заключение, данный протокол для разработки процесса производства и очистки ААВ будет полезен для мелкомасштабного доклинического и крупномасштабного производства рекомбинантных ААВ для генной терапии наследственных генетических заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить доктора Роберта М. Котина (Национальный институт сердца, крови и легких, NIH) за щедрое предоставление нам плазмид AAV и Даниэль Стил и Ребекки Эрнст (Детская больница Цинциннати) за их техническую помощь. Эта работа поддерживается фондом Start-Up от Cincinnati Children's Research Foundation до M.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
2 L flasks ThermoFisher Scientific 431281 Flask for suspension culture
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of supernatants
24-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Adherent cell culture plate
250 mL flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn Software Cytiva 28976337 Chromatography system
AVB Sepharose High Performance Cytiva 28411210 Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFP In-house non-catalog AAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-cap In-house non-catalog AAV packaging vector
Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking buffer Santa Cruz Biotechnologies 516214 Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis buffer In-house Non-catalog item 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 L Cytiva 28937662 Bioreactor bag
Cleaning buffer In-house Non-catalog item 100 mM citric acid (pH 2.1) 
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For cryopreservation
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Elution buffer In-house Non-catalog item 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit  Pall Corporation 12941 Membrane filter
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture media Cytiva SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic Pump Pall Corporation Non-catalog item TFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
Microscope Nikon Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody Santa Cruz Biotechnologies 65498 PE Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tank Praxair Non-catalog item 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBS ThermoFisher Scientific 20012027 Wash buffer
Silver Staining kit ThermoFisher Scientific LC6100 Staining AAV capsid proteins
Sf9 cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Steile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge Pall Corporation OA100C12 TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0 ThermoFisher 15568025 Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50 Cytiva 28-9378-00 Bioreactor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  3. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  4. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  5. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
  6. Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
  7. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  8. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
  9. Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
  10. Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
  11. Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
  12. Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
  13. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  14. Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
  15. Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
  16. Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
  17. Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
  18. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  19. Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
  20. Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
  21. Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
  22. Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).

Tags

Биология выпуск 179 AAV бакуловирус клетки Sf9 биореактор хроматография очистка тангенциальная фильтрация потока
Разработка процесса производства и очистки переносчика аденоассоциированного вируса (AAV)2 с использованием системы культивирования клеток бакуловирус-насекомое
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nasimuzzaman, M., Villaveces, S.,… More

Nasimuzzaman, M., Villaveces, S., van der Loo, J. C. M., Alla, S. Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System. J. Vis. Exp. (179), e62829, doi:10.3791/62829 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter