Summary
Neste protocolo, o vetor AAV2 é produzido por células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) com baculovírus (BV)-AAV2-green fluorescente protein (GFP) ou gene terapêutico e células Sf9 infectadas por BV-AAV2-rep-cap na cultura de suspensão. As partículas de AAV são liberadas das células usando detergente, clarificadas, purificadas pela cromatografia da coluna de afinidade, e concentradas pela filtragem de fluxo tangencial.
Abstract
Os vírus associados à Adeno (AAV) são vetores promissores para aplicações de terapia genética. Aqui, o vetor AAV2 é produzido pela co-cultura de células Spodoptera frugiperda (Sf9) com células Sf9 infectadas com baculovírus (BV)-AAV2-GFP (ou gene terapêutico) e BV-AAV2-rep-cap na cultura de suspensão livre de soro. As células são cultivadas em um frasco em um agitador orbital ou bioreator de ondas. Para liberar as partículas AAV, as células produtoras são diluídas em tampão contendo detergente, que é posteriormente esclarecido por centrifugação e filtração de baixa velocidade. As partículas de AAV são purificadas do liseto celular usando cromatografia da coluna AVB Sepharose, que liga partículas AAV. As partículas ligadas são lavadas com PBS para remover contaminantes e elucidadas da resina usando tampão de citrato de sódio no pH 3.0. O eluato ácido é neutralizado com tampão alcalino Tris-HCl (pH 8.0), diluído com soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS), e ainda concentrado com filtragem de fluxo tangencial (TFF). O protocolo descreve a produção de vetores pré-clínicos em pequena escala compatíveis com a escala até a fabricação de AAV de grau clínico em larga escala para aplicações de terapia genética humana.
Introduction
Os vírus associados ao Adeno (AAV) são parvovírus humanos não envoltos contendo um DNA de 4,6 kb. Os vetores AAV têm várias vantagens sobre outros vetores virais para aplicações de terapia genética1,2,3,4. Os AAVs são naturalmente incompetentes de replicação, portanto, requerem um vírus auxiliar e máquinas host para replicação. Os AAVs não causam nenhuma doença e têm baixa imunogenicidade no hospedeiro infectado3,5. O AAV pode infectar células quiescentes e ativamente divididas e pode persistir como episome sem se integrar ao genoma das células hospedeiras (AAV raramente se integram ao genoma hospedeiro)1,3. Esses recursos tornaram o AAV uma ferramenta desejável para aplicações de terapia genética.
Para gerar um vetor de transferência genética AAV, o transgene, incluindo o gene terapêutico, é clonado entre duas repetições de terminais internos (ITRs), que são tipicamente derivadas do sorotipo AAV 2. O tamanho máximo de ITR de 5' a 3'', incluindo a sequência transgene, é de 4,6 kb6. Capsídeos diferentes podem ter uma célula ou tropismo de tecido diferente. Portanto, os capsídeos devem ser escolhidos com base no tipo de tecido ou célula destinado a ser direcionado com o vetor AAV7.
Vetores AAV recombinantes são comumente produzidos em linhas celulares de mamíferos, como células renais embrionárias humanas, HEK293 por transfecção transitória do vetor de transferência de genes AAV, rep-cap AAV e plasmídeos do vírus auxiliar2,3. No entanto, existem várias limitações para a produção de AAV em larga escala por transfecção transitória de células HEK293 aderentes. Primeiro, um grande número de pilhas de células ou garrafas de rolo são necessárias. Em segundo lugar, são necessários reagentes de DNA plasmídeo de alta qualidade e transfecção, o que aumenta o custo de fabricação. Finalmente, ao utilizar células HEK293 aderentes, o soro é frequentemente necessário para uma produção ideal, complicando o processamento a jusante1,2,3. Um método alternativo de fabricação de AAV envolve o uso da linha celular inseto, células Spodoptera frugiperda (Sf9) e um vírus inseto chamado recombinante Vírus de poliedrose nuclear multicapsid (AcMNPV ou baculovírus)8,9,10. As células Sf9 são cultivadas em cultura de suspensão livre de soro que é fácil de escalar e é compatível com a produção atual de boas práticas de fabricação (cGMP) em larga escala, o que não requer reagentes plasmídeos ou transfeccionados. Além disso, o custo da produção de AAV utilizando o sistema Sf9-baculovirus é menor do que o custo de uso de transfecção transitória de plasmídeos em células HEK29311.
O sistema de produção original rAAV usando células baculovírus-Sf9 utilizou três baculovírus: um baculovírus contendo de transferência genética, o segundo baculovírus contendo gene rep, e o terceiro baculovírus contendo gene capsídeo específico do sorotipo12,13. No entanto, o baculovírus contendo a construção de representantes era geneticamente instável em várias rodadas de passagens, o que impediu a amplificação do baculovírus para a produção de AAV em larga escala. Para resolver esse problema, foi desenvolvido um novo sistema vetorial rAAV, que continha dois baculovírus (TwoBac): um baculovírus contendo o de transferência de genes AAV e outro baculovírus contendo os genes de recape do AAV juntos que são geneticamente mais estáveis do que o sistema original e mais convenientes para produzir rAAV por causa do uso do TwoBac em vez de três14, 15. O sistema OneBac usa o de transferência de genes AAV e os genes de recapina em um único baculovírus que é mais conveniente para produzir o rAAV por causa do uso de um baculovírus em vez de usar TwoBac ou ThreeBac2,16,17. Em nosso estudo, o sistema TwoBac foi utilizado para otimização.
O sistema de baculovírus para produção de AAV também tem limitações: partículas de baculovírus são instáveis para armazenamento a longo prazo no meio11sem soro , e se o título de baculovírus for baixo, um grande volume de supernanato de baculovírus é necessário, o que pode se tornar tóxico para o crescimento de células Sf9 durante a produção de AAV (observação pessoal). O uso de células infectadas sem titulação e escala (TIPS), ou células de insetos infectadas por baculovírus (BIIC), fornece uma boa opção para a produção de AAV na qual as células Sf9 infectadas pelo baculovírus são preparadas, criopreservadas e posteriormente usadas para infecção de células Sf9 frescas. Outra vantagem é o aumento da estabilidade do baculovírus (BV) em células Sf9 após criopreservação10,11.
Dois tipos de células TIPS são geradas para permitir a produção de AAV: a primeira por infecção de células Sf9 com o gene BV-AAV2-GFP ou terapêutico, e a segunda por infecção de célulaS Sf9 com BV-AAV2-rep-cap. As células TIPS são criopreservadas em alíquotas pequenas e prontas para uso. Os vetores AAV são produzidos na cultura de suspensão sem soro em um frasco colocado em um shaker orbital ou bioreator de ondas por células TIPS co-culminando que produzem baculovírus e células Sf9 frescas. As células Sf9 são infectadas por baculovírus que carregam o vetor AAV2-GFP e as sequências de recapina para gerar AAV. Quatro a cinco dias depois, quando os rendimentos do AAV são os mais altos, as células produtoras são lísculas com detergente para liberar as partículas AAV. O liseto celular é posteriormente esclarecido por centrifugação e filtração de baixa velocidade. As partículas de AAV são purificadas do lysate pela cromatografia da coluna AVB Sepharose. Finalmente, os vetores AAV estão concentrados usando TFF. O protocolo descreve a produção de AAV em pequena escala, útil para pesquisas e estudos pré-clínicos. No entanto, os métodos são escaláveis e compatíveis com a fabricação de vetores AAV de grau clínico para aplicações de terapia genética.
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Protocol
Consulte a Figura 1 para obter uma ilustração resumindo o protocolo.
1. Geração de células TIPS infectadas por baculovírus
- Descongele um frasco de células Sf9 e semee-as imediatamente em 50 mL de meio de cultura celular de insetos. Cultivar células Sf9 em uma incubadora de shaker orbital a 125 rpm e 28 °C em frascos traseiros redondos com uma tampa frouxamente anexada para troca de ar8,9. Prop propagar as células em um frasco de 1 L contendo 200 mL de médio para obter células suficientes para a produção de células TIPS.
- Adicione 50 mL de células Sf9 a 2 x 106 células/mL em dois frascos: infecte um frasco de células Sf9 com 0,5 mL de baculovírus (BV)-AAV2-GFP (ou gene terapêutico) e o outro frasco de células com 0,5 mL de BV-AAV2-rep-cap.
NOTA: Os plasmídeos vetores AAV foram generosamente fornecidos pelo Dr. Robert M. Kotin (NIH). A produção de baculovírus a partir do DNA bacmídeo (Sistema Bac-to-Bac) foi descrita anteriormente8,9. A estabilidade do baculovírus durante a passagem é um problema crítico para a produção de escala do rAAV. É melhor usar um número de passagem menor de baculovírus (até a passagem número 4). Determine o volume ideal do supernatário baculovírus empiricamente, verificando a eficiência da infecção por baculovírus usando citometria de fluxo (Figura 2) durante a produção celular TIPS. - Monitore a infecção por baculovírus de 3 a 4 dias após a infecção, manchando o baculovírus gp64 em células Sf9 infectadas da seguinte forma.
- Mancha 2 x 105 células Sf9 (células não infectadas e infectadas pelo baculovírus) com 0,5 μg de anticorpo anti-baculovírus do camundongo gp64 (1:200) contendo um corante fluorescente em 100 μL de tampão de bloqueio por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Lave as células com 1 mL de PBS para remover o anticorpo e resuspensar as células manchadas em 300 μL de PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino.
- Analise a expressão baculovírus gp64 nas células usando citometria de fluxo(Figura 2).
NOTA: Determine a estratégia de gating para aquisição e análise de citometria de fluxo empiricamente. Um total de 10.000 células vivas individuais são adquiridas. A expressão baculovírus gp64 nas superfícies celulares Sf9 indica infecção por baculovírus. Após 3-4 dias, a maioria das células Sf9 são infectadas pelo baculovírus, como evidenciado pela expressão baculovírus gp64(Figura 2).
- Quando as células são 80%-90% viáveis com um aumento no diâmetro(Figura 3),colhem as células e criopreservam 1 x 107 células em 1 mL de cultura inseto complementada com soro bovino fetal de 10% e 10% de sulfóxido de dimetil em um recipiente de congelamento lento a -80 °C. No dia seguinte, transfira o tubo contendo células TIPS para um congelador de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
NOTA: Realize a cultura celular em um armário de biossegurança seguindo a técnica de laboratório asséptica padrão no Nível 2 de Biossegurança (BSL-2).
2. Produção de vetor AAV
- Dia 1: Co-cultura células Sf9 com as células TIPS infectadas pelo baculovírus
- Cultura e cultivar células Sf9 ingênuas a 1 x 106 células/mL a 28 °C em vários frascos de 2 L contendo 400 mL de meio de cultura celular de inseto em uma incubadora shaker que é necessária para a produção de AAV. Após 3-4 dias, a densidade celular é aumentada até 5 x 106-6 x 106 células/mL.
NOTA: CO2 e umidade não são fatores importantes para o crescimento das células Sf9. - Sementes as células Sf9 em frascos de shake ou em um bioreator da seguinte forma.
- Produção de AAV em frascos em uma incubadora de shaker orbital: Use uma pipeta ou uma bomba peristáltica para semear 400 mL de cultura Sf9 a 2 x 106 células/mL em um frasco de 2 L asepticamente. Configure o agitador orbital a 125 rpm e 28 °C.
NOTA Utilize uma bomba peristáltica ou pipeta padrão dependendo da escala da produção de AAV. - Produção de AAV em um bioreator: Use uma bomba peristáltica para semear 1 L de cultura Sf9 a 2 x 106 células/mL em um saco bioreator de 10 L asepticamente. Coloque o saco na unidade bioreator para a colheita a 28 °C. Adicione 40% de oxigênio ao saco bioreator a 0,1 psi. Configure a unidade bioreatorial em um ângulo de 20° e agite o saco a 25 rpm.
- Produção de AAV em frascos em uma incubadora de shaker orbital: Use uma pipeta ou uma bomba peristáltica para semear 400 mL de cultura Sf9 a 2 x 106 células/mL em um frasco de 2 L asepticamente. Configure o agitador orbital a 125 rpm e 28 °C.
- Descongele um frasco de cada célula BV-AAV2-GFP (ou gene terapêutico) e BV-AAV2-rep-cap TIPS. Diluir as células com 20 mL de meio de cultura de insetos e realizar uma contagem de viabilidade das células usando azul tripano. Inocular ambas as células TIPS a uma proporção de 1:10.000 em relação às células ingênuas Sf9 cultivadas em um frasco de shaker ou bioreator.
NOTA: A sobrevivência das células TIPS é reduzida devido à criopreservação, e a taxa de recuperação é de aproximadamente 50% quando a viabilidade celular é determinada com a coloração azul trypan. Realize um experimento piloto para determinar empiricamente a proporção de células TIPS e células Sf9 ingênuas antes da produção de rAAV em larga escala.
- Cultura e cultivar células Sf9 ingênuas a 1 x 106 células/mL a 28 °C em vários frascos de 2 L contendo 400 mL de meio de cultura celular de inseto em uma incubadora shaker que é necessária para a produção de AAV. Após 3-4 dias, a densidade celular é aumentada até 5 x 106-6 x 106 células/mL.
- Dia 2: Monitoramento da cultura
- Colher 1 mL de cultura Sf9 asepticamente. Mancha com o corante azul Trypan para analisar a contagem de células, viabilidade e morfologia.
- Dia 3: Monitoramento e alimentação da cultura
- Colher 1 mL de cultura Sf9 e analisar a contagem celular, viabilidade e morfologia. Verifique o estado da infecção por baculovírus após a coloração das células Sf9, conforme mencionado na etapa 1.3.
NOTA: Aumento do diâmetro celular e efeito citopático são indicações de infecção por baculovírus. O aumento do diâmetro precede uma diminuição da viabilidade celular, e esses parâmetros são usados para determinar o tempo de colheita celular durante a produção de AAV. Determine o ponto de tempo ideal empiricamente. - Alimente a cultura Sf9 com meio de cultura de insetos frescos em uma proporção de 1:5 asepticamente.
- Colher 1 mL de cultura Sf9 e analisar a contagem celular, viabilidade e morfologia. Verifique o estado da infecção por baculovírus após a coloração das células Sf9, conforme mencionado na etapa 1.3.
- Dia 4: Monitoramento da cultura
- Colher 1 mL de cultura Sf9 e analisar a contagem celular, viabilidade e morfologia. Desconecte o suprimento de oxigênio do saco bioreator.
- Dia 5: Monitoramento e colheita da cultura
- Colher 1 mL de cultura Sf9 e analisar a contagem celular, viabilidade e morfologia. Colher o meio de cultura e as células quando a viabilidade celular Sf9 diminuiu para cerca de 50% (Figura 4).
- Gire a suspensão da célula a 2100 x g por 15 min a 4 °C. Pegue o supernatante e a pelota da célula, e armazene-os a -80 °C.
3. Lise das células e liberação de AAV
- Descongele a pelota de célula do produtor AAV. Adicione 100 mL de tampão de lise celular (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM cloreto de sódio, 0,5 % Triton-X-100) à pelota celular, misture vigorosamente e incubar por 30 minutos a temperatura ambiente para liberar as partículas AAV.
- Centrifugar a 2100 × g por 30 min a 4 °C e transferir o lysato celular para um novo recipiente. Misture o liseto celular e a cultura celular sobrenatante após o descongelamento.
- Adicione 20 nuclease u/mL e 10 mM MgCl2 ao liseto celular para digerir o DNA e o RNA. Incubar por 2-4 h a 37 °C.
- Filtre o lise através de um sistema de filtragem dupla de 0,8 μm e 0,2 μmpolyethersulfone usando uma bomba.
- Armazene a célula clarificada a 4 °C durante a noite ou purifique o AAV imediatamente.
4. Purificação do vetor AAV utilizando sistema de cromatografia de coluna de afinidade
- Prepare o instrumento de cromatografia lavando seqüentemente as linhas de amostra e tampão com água estéril, hidróxido de sódio de 1 N, água e soro fisco tamponado de fosfato (PBS, pH 7.4) a uma vazão de 50 mL/min.
- Monte a coluna AVB Sepharose (10,0 mL) no sistema de cromatografia e execute 100 mL de PBS a uma vazão de 5 mL/min.
NOTA: Utilize um volume menor ou maior da coluna AVB Sepharose dependendo da escala da produção de AAV e configure a taxa de fluxo conforme sugerido pelo fabricante da coluna ou resina (ver Tabela de Materiais). - Para coletar as frações da solução de passagem da coluna, tampão de lavagem e tampão de eluição contendo partículas AAV, insira tubos nas ranhuras coletoras de fração do instrumento de cromatografia.
- Equilibre a coluna com PBS a uma vazão de 5,0 mL/min.
- Carregue o liseto celular filtrado contendo partículas AAV na coluna usando a máquina de cromatografia equipada com uma bomba de amostra. Execute a amostra a uma taxa de fluxo de 3,0 mL por minuto.
- Execute PBS através da coluna AVB Sepharose a uma vazão de 3,0 mL/min até que a curva de absorção ultravioleta (UV) retorne à linha de base e se torne estável.
- Elute as partículas AAV da coluna com 50 mM de citrato de sódio (pH 3.0) tampão a uma taxa de fluxo de 3,0 mL/min(Figura 5).
NOTA: Enquanto as partículas AAV se dissociam da resina e passam pelo detector UV, um pico de eluição de proteína pode ser visto no cromatógrama. - Diluir imediatamente o supernaente AAV com um volume de um quinto de 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) para aumentar o pH do AAV contendo supernanato para aproximadamente pH 5,5 para evitar a degradação mediada por pH com tampão de eluição ácida. Além disso, diluir o supernatante AAV 10 vezes com PBS para neutralizar totalmente o pH.
NOTA: O valor do pH é de aproximadamente 5,5 após neutralizar a solução rAAV. Depois de neutralizar o AAV, diluir a solução rAAV 10 vezes com PBS (pH 7.4) para que o AAV esteja em um buffer fisiológico. - Armazene 1 mL de cada amostra run-through da coluna, tampão de lavagem e 100 μL do supernanato AAV elucido para avaliar a presença de AAV por infecção das células-alvo.
- Limpe a coluna AVB Sepharose com 100 mL de ácido cítrico de 100 mM (pH 2,1) e 100 mL de PBS (pH7.4) a uma vazão de 5,0 mL/min. Enxágüe a coluna com 20% de etanol a uma vazão de 5,0 mL/min e armazene a 4 °C.
- Limpe as tubulações do instrumento de cromatografia com a posição offline da coluna, conforme descrito na seção 4.1. Por fim, enxágue o sistema de cromatografia com 200 mL de 20% de etanol a uma vazão de 50,0 mL/min e armazene em 20% de etanol.
5. Concentração e diafiltração do vetor AAV utilizando filtragem de fluxo tangencial (TFF)
- Configure o sistema TFF equipado com um cartucho de membrana de polisulfone (100 kDa Molecular Weight Cut Off) para concentrar o AAV.
- Módulo TFF equilibrate com 200 mL de PBS por 10 min.
- Carregue a amostra de AAV controlando o fluxo da bomba até que a amostra seja reduzida ao volume desejado, mantendo uma pressão trans-membrana a 2-3 psi.
- Diafiltrar o retentato com 100 mL de PBS, como usado neste estudo, ou definir empiricamente buffer alternativo que suporte a estabilidade a longo prazo do AAV.
- Depois de concentrar a amostra AAV no volume desejado, colete a amostra AAV, filtre-a através de um poliésterulfonefilter, aliquot e, em seguida, armazene-a a -80 °C.
6. Infecção de amostras de AAV nas células-alvo para avaliar a presença de AAV nas etapas de purificação
- Inoculação 7 x 104 células HT1080/bem em uma placa de 24 poços em 500 μL do Médio Modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco suplementado com 1% de L-glutamina, 1% piruvato de sódio e 10% de soro bovino fetal (FBS) no dia anterior à infecção. Cultura as células em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2.
- Conte as células antes da infecção. Adicione a amostra a granel AAV não purificada diluída antes da execução da coluna, amostras de run-through da coluna, tampão de lavagem e amostra de AAV purificada.
NOTA: Conte as células manchadas de azul trypan com um hemótmetro. Determine o fator de diluição e o volume (μL) das amostras de AAV empiricamente. Quanto maiores os títulos AAV, mais diluição é necessária. Certifique-se de que as partículas de baculovírus da amostra em massa não purificada antes da coluna funcionar, amostras de run-through da coluna, tampão de lavagem são inativadas a calor a 50 °C por 50 minutos antes de infectar as células-alvo para determinar os títulos infecciosos de AAV. - Dois dias após a infecção, analise a expressão proteica (por exemplo, GFP ou gene terapêutico) nas células usando um citômetro de fluxo.
- Calcular títulos infecciosos de AAV utilizando o número de células no momento da infecção, fator de diluição e porcentagem de células GFP+ com a fórmula: (Número total de células x Percentagens GFP+ células x Fator de Diluição) / Volume de AAV em mililitros.
NOTA: Por exemplo, o número de células é de 1 x 105, a porcentagem de células GFP+ é de 3,4%, o fator de diluição é de 100, e o volume de AAV adicionado é de 2 μL. O título de AAV é 1,7 x 108 unidade infecciosa (UI)/mL. A quantidade total de partículas purificadas de AAV em 25 mL da fração elucida é de 4,3 x 109 unidades infecciosas (UI)/mL(Figura 6). O número total de partículas AAV não purificadas iniciais é de 1,09 x 1010 UI/mL, e as partículas AAV purificadas são 4,3 x 109 UI/mL. Portanto, o percentual de recuperação é de 39,4%. A porcentagem de células GFP+ deve ser entre 1%-30%, o que corresponde a uma faixa linear quando usada para calcular o título infeccioso de AAV. Se partículas vetoras AAV mais concentradas forem infectadas nas células-alvo; há a possibilidade de que várias cópias das partículas AAV possam infectar uma única célula que será exibida como uma única cópia do vetor. Portanto, dilui o supernanato vetorial AAV para obter infecção vetorial de 1%-30% nas células-alvo. Se o vetor AAV não tiver um gene repórter, manche o transgene ou o gene terapêutico expresso pelo vetor AAV com um anticorpo contendo um corante fluorescente que pode ser detectado e quantitado usando um citómetro de fluxo. Nem todos os sorotipos AAV podem infectar eficientemente células HT1080. Portanto, para realizar o ensaio de infectividade para outros sorotipos AAV, use diferentes linhas celulares. Titer as partículas AAV2-GFP antes da purificação e após a purificação em células HT1080 e medir a expressão GFP por citometria de fluxo. Calcule a recuperação (%) pela razão do número de partículas AAV purificadas e o número de partículas de AAV antes da purificação multiplicadas por 100.
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Representative Results
Aqui, são mostrados os resultados representativos do desenvolvimento de processos para a produção e purificação de vetores AAV utilizando o sistema de células de insetos Sf9. O método inclui a cocultura de células Sf9 com células TIPS infectadas pelo baculovírus, alimentação das células com meio de crescimento, colheita e lise das células produtoras para liberação das partículas AAV, esclarecimento do linsato celular com tratamento de nuclease, centrifugação e filtração, purificação do AAV utilizando cromatografia de afinidade de sepharose AVB, e concentração com TFF (Figura 1).
As células TIPS são geradas pela infecção do BV-AAV2-GFP ou gene terapêutico e bv-AAV2-rep-cap em células Sf9 separadamente. A maioria das células Sf9 são infectadas pelo baculovírus em 3-4 dias devido às múltiplas rodadas de infecção, evidenciadas pela expressão de baculovírus glicoproteína gp64 em(Figura 2) e as células apresentam um aumento no diâmetro(Figura 3). As células TIPS são colhidas de 3 a 4 dias após a infecção e criopreservadas. As células Sf9 são co-cultivadas com as células TIPS que secretam partículas de baculovírus no meio de cultura que infectam células ingenuas Sf9. O baculovírus é competente para replicação; portanto, o número de células infectadas aumenta rapidamente por múltiplas infecções redondas com partículas baculovírus recém-produzidas que são secretadas no meio da cultura8,9. As células apresentam um aumento no diâmetro, efeito citopático, e cerca de metade das células morrem em 5 dias após a infecção, que são os sinais de conclusão da produção de AAV(Figura 4).
As células produtoras de AAV são colhidas por centrifugação de baixa velocidade, lísmicamente com tampão contendo detergente para liberar o AAV no lisecelular. Trata-se então de nuclease para digestão de DNA e RNA para reduzir a viscosidade, filtrada através de uma membrana de 0,8 μm e 0,2 μm, e posteriormente purificada e concentrada. O liseto celular é carregado em uma coluna AVB Sepharose usando um sistema de cromatografia. A resina AVB Sepharose liga partículas AAV2 devido à sua afinidade com as proteínas capsíides. O tampão de lavagem é executado através da coluna AVB Sepharose para remover materiais desvinculados e frouxamente amarrados até que a curva de absorção ultravioleta (UV) (280 nm) se torne estável na linha de base. Uma vez que as partículas AAV ligam fortemente AVB Sepharose, nenhum número significativo de partículas AAV2 é detectado durante a lavagem. As partículas AAV são eluculadas com tampão ácido (pH 3.0), que dissocia a interação entre partículas AAV e resina DE SEpharose AVB. Para evitar a degradação mediada pelo PH do AAV pela solução ácida, o eluante é neutralizado com um tampão alcalino (pH 8.0). Um pico de proteína é visto enquanto a elução com tampão ácido correspondente à fração AAV(Figura 5 e Figura 6). O AAV purificado é diluído 10 vezes com PBS, concentrado e tampão trocado com um sistema TFF. Neste exemplo, as partículas totais de AAV no lisato celular (560 mL) são 1,1 x 1014 genoma vetorial (vg), após a purificação da cromatografia DE SEpharose AVB (25 mL) são 4,1 x 1013 vg, e após concentração com TFF (25 mL) são 2,4 x 1013 vg. As amostras purificadas de AAV mostram três proteínas capsidas distintas, VP1, VP2 e VP3, após sds-PAGE e coloração de prata(Figura 7)
Figura 1: Um diagrama esquemático para a produção e purificação do Vetor AAV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise da citometria de fluxo da expressão baculovírus gp64 em células Sf9. As células Sf9 infectadas pelo baculovírus são manchadas com um anticorpo anti-baculovírus gp64 contendo um corante fluorescente, que é detectado por citometria de fluxo. (A) Células Sf9 não infectadas. (B) As células Sf9 infectadas pelo baculovírus estão mostrando a expressão gp64 na maioria das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Morfologia das células Sf9 infectadas pelo baculovírus (TIPS). O baculovírus é infectado nas células Sf9 para produzir as células TIPS. (A) Células Sf9 não infectadas. (B) Células Sf9 infectadas por baculovírus (TIPS). As células são mostradas na ampliação de 200x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Morfologia das células Sf9 infectadas pelo baculovírus durante a produção de AAV. As células TIPS secretam baculovírus que infectam células Sf9 ingênuas co-cultivadas durante a produção de AAV. (A) Células Sf9 não infectadas. (B) As células Sf9 infectadas pelo baculovírus apresentam um aumento no diâmetro. Cinco dias após a infecção, quase metade das células morrem (visualizadas sob um microscópio de fase invertida após a coloração azul trypan). Setas vermelhas indicam células vivas, e setas azuis indicam células mortas. As células são mostradas na ampliação de 200x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Purificação AAV utilizando cromatografia da coluna AVB Sepharose. Um cromatógrama mostra a absorção de amostras de proteínas a 280 nm durante o carregamento da amostra na coluna, lavagem e elução. O cromatógrafo foi modificado para caber na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: O número de partículas infecciosas de AAV no fluxo durante o carregamento na coluna, lavagem e eluição. Um total de 560 mL de amostras de AAV são carregados em uma coluna de 10 mL AVB Sepharose. O volume de fração para a carga da coluna é de 50 mL, a lavagem da coluna é de 50 mL e a eluição é de 25 mL. Os títulos de AAV são medidos após a infecção de células HT1080 com as amostras de run-through da coluna enquanto carregam na coluna, lavagem e elução para investigar a presença de AAV em cada etapa da purificação. O rendimento total purificado de AAV é de 4,3 x 109 unidades infecciosas. Cada símbolo em forma de diamante representa as unidades infecciosas (UI) de AAV em cada fração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. SDS-PAGE e coloração de prata de vetor AAV puro mostrando proteínas capsid. As amostras AAV reduzidas são executadas em SDS-PAGE, e a coloração de prata é realizada. Três bandas distintas de proteínas capsid AAV, VP1, VP2 e VP3, são visíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os parâmetros utilizados neste protocolo para o desenvolvimento de processos de produção, purificação e concentração de vetores AAV podem ser aplicados tanto na fabricação de pequenos e em larga escala de vetores AAV para aplicações de terapia genética. Todo o processo upstream e downstream pode ser realizado em um sistema fechado compatível com as práticas atuais de boa fabricação (cGMP). As principais vantagens do sistema Sf9-baculovirus são a escalabilidade para a produção de AAV de série GMP em larga escala a um custo acessível. O sistema não precisa de plasmídeos caros e reagentes de transfecção, que são necessários para a produção de AAV usando células HEK293. Foi relatado que ambas as células HEK293 e células Sf9 produzem vetores AAV de qualidade semelhante (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Abstract #100). O grande desafio é que esse sistema requer a geração de baculovírus e células TIPS que precisam de um tempo e esforço significativos.
Neste protocolo, foram utilizados dois tipos de células TIPS (sistema TwoBac): uma célula TIPS contendo baculovírus com de transferência de genes AAV e outra célula TIPS contendo AAV-rep-cap. O sistema OneBac2,16,17 pode gerar células TIPS contendo tanto de transferência genética AAV quanto genes de recapina em um único baculovírus. O sistema OneBac fornece uma abordagem alternativa para produzir o rAAV usando apenas um conjunto de células TIPS em vez de duas, como descrito no sistema TwoBac, o que simplificaria ainda mais o protocolo.
Este protocolo descreve a produção de AAV em células Sf9. É importante otimizar a proporção das células TIPS infectadas pelo baculovírus para produtor de células Sf9 ingênuas para obter um bom rendimento de AAV. Se essa relação for sub-ideal, o rendimento do AAV será reduzidoem 11. Por exemplo, se mais AAV ITR contendo vetores de transferência de genes forem gerados do que os capsídeos nas células produtoras devido à proporção sub-ideal de TIPS e células produtoras, todos os vetores de transferência de genes disponíveis não receberão capsídeos suficientes para produzir partículas AAV completas. Por outro lado, se mais capsídeos forem gerados do que os vetores de transferência de genes AAV nas células produtoras, todos os capsídeos não receberão O AAV ITR contendo vetores de transferência genética que resultam em partículas AAV vazias.
À medida que as células se multiplicam, os nutrientes do meio cultural se esgotam, e os resíduos metabólicos se acumulam. Portanto, a suplementação de 20% de um meio de crescimento fresco na cultura celular 2 dias após a co-cultura de células TIPS e células Sf9 pode aumentar significativamente os títulos AAV (Amine A. Kamen, National Research Council Canada, comunicação pessoal).
A pureza das partículas AAV é um fator crítico para alcançar a transdução efetiva de células-alvo sem qualquer citotoxicidade para estudos in vitro e in vivo 3,5. Por isso, é importante incluir uma etapa de cromatografia que possa purificar seletivamente partículas de AAV e eliminar impurezas como proteínas e detritos de células hospedeiras, DNA genômico e baculoviral, e vetores agregados e fragmentados. Ao carregar o supernante AAV em uma coluna AVB Sepharose, é fundamental verificar as amostras de fluxo para a presença de partículas AAV que podem passar pela coluna sem se ligar à resina. Se esse for o caso, (1) uma velocidade de execução mais baixa que resulte em um tempo de residência mais longo será necessária para a vinculação das partículas AAV, (2) a quantidade de amostra carregada na coluna deve ser reduzida, e/ou (3) o volume do SEpharose AVB deve ser aumentado, de modo que a capacidade de ligação da coluna nunca exceda o número de partículas AAV. A capacidade da resina AVB Sepharose de ligar partículas AAV a uma alta vazão e com alta afinidade e capacidade é importante para reduzir o tempo de purificação. A maior limitação do AVB Sepharose é que ele liga o capsídeo dos sorotipos AAV 1, 2 e 5. Portanto, diferentes resinas cromatografias devem ser testadas e utilizadas para a purificação de outros sorotipos AAV18. O protocolo de purificação a jusante descrito aqui também pode ser usado para purificar a AAV produzida em células HEK 293.
Este protocolo pode purificar a AAV do lisecelular, mas não pode remover partículas vazias. Alguns artigos descreveram métodos que podem distinguir partículas AAV vazias vs. completas em estoques purificados de AAV19,20. No entanto, acreditamos que a produção de AAV deve ser otimizada no nível do processo upstream para minimizar a geração de partículas vazias. Se a razão entre o vetor de transferência genética AAV e a produção de capsídeos nas células produtoras não forem ótimas, mais partículas vazias podem gerar.
Além de vincular partículas AAV completas, o meio AVB Sepharose liga partículas AAV fragmentadas ou proteínas capsíides que podem ser removidas usando TFF. A maioria das partículas de baixo peso molecular são eliminadas das amostras de AAV, incluindo o passo TFF rio abaixo da cromatografia da coluna. Além disso, o TFF é usado para realizar uma troca de buffer/diafiltração e concentrar o AAV10,21.
Embora a ultracentrifugação do aav com cloreto de césio ou gradiente iodixanol seja o método preferido para purificação de AAV de grau pré-clínico e de pequena escala, este método não é escalável e menos adequado para purificação em larga escala do AAV21,22.
Em conclusão, este protocolo para o desenvolvimento do processo de produção e purificação de AAV será útil para a fabricação pré-clínica e em larga escala de AAV recombinante para a terapia genética de doenças genéticas hereditárias.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) por nos fornecer generosamente os plasmídeos AAV e Danielle Steele e Rebecca Ernst (Hospital Infantil de Cincinnati) por sua assistência técnica. Este trabalho é apoiado pelo fundo Start-Up da Cincinnati Children's Research Foundation para o M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
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