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Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte

Published: January 13, 2022 doi: 10.3791/62829
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2,3, 1
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

Summary

Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.

Abstract

Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs prometteurs pour les applications de thérapie génique. Ici, le vecteur AAV2 est produit par co-culture de cellules Spodoptera frugiperda (Sf9) avec des cellules Sf9 infectées par le baculovirus (BV)-AAV2-GFP (ou gène thérapeutique) et BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension sans sérum. Les cellules sont cultivées dans une fiole dans un agitateur orbital ou un bioréacteur Wave. Pour libérer les particules d’AAV, les cellules productrices sont lysées dans un tampon contenant du détergent, qui est ensuite clarifié par centrifugation et filtration à basse vitesse. Les particules d’AAV sont purifiées du lysat cellulaire à l’aide de la chromatographie sur colonne AVB Sepharose, qui lie les particules d’AAV. Les particules liées sont lavées avec du PBS pour éliminer les contaminants et éluées de la résine à l’aide d’un tampon de citrate de sodium à pH 3,0. L’éluat acide est neutralisé avec un tampon alcalin Tris-HCl (pH 8,0), dilué avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et concentré par filtration à flux tangentiel (TFF). Le protocole décrit la production de vecteurs précliniques à petite échelle compatible avec la fabrication d’AAV de qualité clinique à grande échelle pour les applications de thérapie génique humaine.

Introduction

Les virus adéno-associés (AAV) sont des parvovirus humains non enveloppés contenant un ADN simple brin de 4,6 kb. Les vecteurs AAV présentent plusieurs avantages par rapport aux autres vecteurs viraux pour les applications de thérapiegénique 1,2,3,4. Les AAV sont naturellement incompétents en matière de réplication, ce qui nécessite un virus auxiliaire et des machines hôtes pour la réplication. Les AAV ne causent aucune maladie et ont une faible immunogénicité chez l’hôte infecté3,5. L’AAV peut infecter à la fois les cellules quiescentes et les cellules en division active et peut persister sous forme d’épisome sans s’intégrer dans le génome des cellules hôtes (l’AAV s’intègre rarement dans le génome de l’hôte)1,3. Ces caractéristiques ont fait de l’AAV un outil souhaitable pour les applications de thérapie génique.

Pour générer un vecteur de transfert de gène AAV, la cassette transgénique, y compris le gène thérapeutique, est clonée entre deux répétitions terminales internes (ITR), qui sont généralement dérivées du sérotype 2 de l’AAV. La taille maximale de 5' ITR à 3' ITR, y compris la séquence transgénique, est de 4,6 kb6. Différentes capsides peuvent avoir un tropisme cellulaire ou tissulaire différent. Par conséquent, les capsides doivent être choisies en fonction du type de tissu ou de cellule destiné à être ciblé avec le vecteur AAV7.

Les vecteurs AAV recombinants sont couramment produits dans des lignées cellulaires de mammifères telles que les cellules rénales embryonnaires humaines, HEK293 par transfection transitoire du vecteur de transfert de gène AAV, AAV rep-cap, et les plasmides du virus auxiliaire2,3. Cependant, il existe plusieurs limitations pour la production d’AAV à grande échelle par transfection transitoire de cellules HEK293 adhérentes. Tout d’abord, un grand nombre de piles de cellules ou de bouteilles à rouleaux sont nécessaires. Deuxièmement, de l’ADN plasmidique de haute qualité et des réactifs de transfection sont nécessaires, ce qui augmente le coût de fabrication. Enfin, lors de l’utilisation de cellules HEK293 adhérentes, le sérum est fréquemment nécessaire pour une production optimale, ce qui complique le traitement en aval1,2,3. Une méthode alternative de fabrication de l’AAV consiste à utiliser la lignée cellulaire d’insectes, les cellules de Spodoptera frugiperda (Sf9) et un virus d’insecte appelé virus de la polyédrose nucléaire multicapside autographa californica recombinant (AcMNPV ou baculovirus)8,9,10. Les cellules Sf9 sont cultivées dans une culture en suspension sans sérum, facile à mettre à l’échelle et compatible avec la production actuelle de bonnes pratiques de fabrication (GMPc) à grande échelle, qui ne nécessite pas de réactifs plasmidiques ou de transfection. De plus, le coût de production de l’AAV à l’aide du système Sf9-baculovirus est inférieur au coût de l’utilisation de la transfection transitoire des plasmides dans les cellules HEK29311.

Le système original de production de rAAV utilisant des cellules baculovirus-Sf9 utilisait trois baculovirus: un baculovirus contenant une cassette de transfert de gènes, le deuxième baculovirus contenant le gène rep et le troisième baculovirus contenant le gène de capside spécifique au sérotype12,13. Cependant, la construction de rep contenant le baculovirus était génétiquement instable sur plusieurs cycles de passages, ce qui a empêché l’amplification du baculovirus pour la production à grande échelle d’AAV. Pour résoudre ce problème, un nouveau système de vecteurs rAAV a été développé, qui contenait deux baculovirus (TwoBac): un baculovirus contenant la cassette de transfert de gène AAV et un autre baculovirus contenant les gènes AAV rep-cap ensemble qui sont génétiquement plus stables que le système original et plus pratiques pour produire rAAV en raison de l’utilisation de TwoBac au lieu de trois14, 15. Le système OneBac utilise la cassette de transfert de gènes AAV et les gènes rep-cap dans un seul baculovirus, ce qui est plus pratique pour produire le rAAV en raison de l’utilisation d’un baculovirus au lieu d’utiliser TwoBac ou ThreeBac2,16,17. Dans notre étude, le système TwoBac a été utilisé pour l’optimisation.

Le système de baculovirus pour la production d’AAV a également des limites: les particules de baculovirus sont instables pour un stockage à long terme dans un milieu sans sérum11, et si le titre de baculovirus est faible, un grand volume de surnageant de baculovirus est nécessaire, ce qui peut devenir toxique pour la croissance des cellules Sf9 pendant la production d’AAV (observation personnelle). L’utilisation de cellules de préservation et de mise à l’échelle des cellules infectées sans titre (TIPS), ou de cellules d’insectes infectées par un baculovirus (BIIC), constitue une bonne option pour la production d’AAV dans laquelle les cellules Sf9 infectées par le baculovirus sont préparées, cryoconservées et ensuite utilisées pour l’infection de cellules Sf9 fraîches. Un autre avantage est la stabilité accrue du baculovirus (BV) dans les cellules Sf9 après cryoconservation10,11.

Deux types de cellules TIPS sont générés pour permettre la production d’AAV: le premier par infection des cellules Sf9 par le gène BV-AAV2-GFP ou thérapeutique, et le second par infection de la cellule Sf9 par BV-AAV2-rep-cap. Les cellules TIPS sont cryoconservées dans de petites aliquotes prêtes à l’emploi. Les vecteurs AAV sont produits en culture en suspension sans sérum dans une fiole placée dans un agitateur orbital ou un bioréacteur Wave en co-cultivant des cellules TIPS qui produisent des baculovirus et des cellules Sf9 fraîches. Les cellules Sf9 sont infectées par des baculovirus porteurs du vecteur AAV2-GFP et des séquences rep-cap pour générer l’AAV. Quatre à cinq jours plus tard, lorsque les rendements en AAV sont les plus élevés, les cellules productrices sont lysées avec du détergent pour libérer les particules d’AAV. Le lysat cellulaire est ensuite clarifié par centrifugation et filtration à basse vitesse. Les particules d’AAV sont purifiées du lysat par chromatographie sur colonne AVB Sepharose. Enfin, les vecteurs AAV sont concentrés à l’aide de TFF. Le protocole décrit la production d’AAV à petite échelle, utile pour la recherche et les études précliniques. Cependant, les méthodes sont évolutives et compatibles avec la fabrication de vecteurs AAV de qualité clinique pour les applications de thérapie génique.

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Protocol

Voir la figure 1 pour une illustration résumant le protocole.

1. Génération de cellules TIPS infectées par le baculovirus

  1. Décongeler un flacon de cellules Sf9 et les ensemencer immédiatement dans 50 mL de milieu de culture de cellules d’insectes. Cultiver des cellules Sf9 dans un incubateur à agitateur orbital à 125 tr/min et 28 °C dans des flacons à fond rond avec un bouchon lâchement attaché pour l’échange d’air8,9. Propager les cellules dans une fiole de 1 L contenant 200 mL de milieu pour obtenir suffisamment de cellules pour la production de cellules TIPS.
  2. Ajouter 50 mL de cellules Sf9 à 2 x 106 cellules/mL dans deux flacons : infecter une fiole de cellules Sf9 avec 0,5 mL de baculovirus (BV)-AAV2-GFP (ou gène thérapeutique) et l’autre fiole de cellules avec 0,5 mL de BV-AAV2-rep-cap.
    REMARQUE: Les plasmides vectoriels AAV ont été généreusement fournis par le Dr Robert M. Kotin (NIH). La production de baculovirus à partir de l’ADN bacmid (système Bac-to-Bac) a été décrite précédemment8,9. La stabilité du baculovirus pendant le passage est un problème critique pour la production à grande échelle de rAAV. Il est préférable d’utiliser un nombre de passage inférieur de baculovirus (jusqu’au passage numéro 4). Déterminer empiriquement le volume optimal du surnageant à baculovirus en vérifiant l’efficacité de l’infection à baculovirus à l’aide de la cytométrie en flux(Figure 2)pendant la production des cellules TIPS.
  3. Surveillez l’infection à baculovirus 3 à 4 jours après l’infection en colorant le baculovirus gp64 dans les cellules Sf9 infectées comme suit.
    1. Colorez 2 x 105 cellules Sf9 (cellules non infectées et infectées par le baculovirus) avec 0,5 μg d’anticorps anti-baculovirus gp64 de souris (1:200) contenant un colorant fluorescent dans 100 μL de tampon bloquant pendant 30 min à température ambiante.
    2. Laver les cellules avec 1 mL de PBS pour retirer l’anticorps et remettre en suspension les cellules colorées dans 300 μL de PBS contenant 0,5% d’albumine sérique bovine.
    3. Analyser l’expression du baculovirus gp64 sur les cellules à l’aide de la cytométrie en flux (Figure 2).
      REMARQUE: Déterminer empiriquement la stratégie de contrôle pour l’acquisition et l’analyse de cytométrie en flux. Au total, 10 000 cellules vivantes uniques sont acquises. L’expression du baculovirus gp64 sur les surfaces des cellules Sf9 indique une infection à baculovirus. Après 3-4 jours, la plupart des cellules Sf9 sont infectées par le baculovirus, comme en témoigne l’expression du baculovirus gp64 (Figure 2).
  4. Lorsque les cellules sont viables à 80% à 90% avec une augmentation du diamètre (Figure 3), récoltez les cellules et cryoconservez 1 x 107 cellules dans 1 mL de milieu de culture d’insectes complété par 10% de sérum fœtal bovin et 10% de diméthylsulfoxyde dans un récipient à congélation lente à -80 °C. Le lendemain, transférez le tube contenant des cellules TIPS dans un congélateur à azote liquide pour un stockage à long terme.
    REMARQUE: Effectuer une culture cellulaire dans une armoire de biosécurité en suivant la technique de laboratoire aseptique standard au niveau de biosécurité 2 (BSL-2).

2. Production du vecteur AAV

  1. Jour 1 : Co-culture de cellules Sf9 avec les cellules TIPS infectées par le baculovirus
    1. Cultiver et cultiver des cellules Sf9 naïves à 1 x 106 cellules/mL à 28 °C dans plusieurs flacons de 2 L contenant 400 mL de milieu de culture de cellules d’insectes dans un incubateur agitateur nécessaire à la production d’AAV. Après 3-4 jours, la densité cellulaire est augmentée jusqu’à 5 x 106-6 x 106 cellules / mL.
      REMARQUE: Le CO2 et l’humidité ne sont pas des facteurs importants pour la croissance des cellules Sf9.
    2. Ensemencez les cellules Sf9 soit dans des flacons agités, soit dans un bioréacteur comme suit.
      1. Production d’AAV dans des flacons dans un incubateur à agitateur orbital : Utilisez une pipette ou une pompe péristaltique pour ensemencer 400 mL de culture Sf9 à 2 x10 6 cellules/mL dans une fiole de 2 L de manière aseptique. Installez le secoueur orbital à 125 tr/min et 28 °C.
        NOTE Utilisez une pompe péristaltique ou une pipette standard en fonction de l’échelle de production de l’AAV.
      2. Production d’AAV dans un bioréacteur : Utilisez une pompe péristaltique pour ensemencer 1 L de culture Sf9 à 2 x 106 cellules/mL dans un sac de bioréacteur de 10 L de manière aseptique. Chargez le sac sur l’unité Bioreactor pour une culture à 28 °C. Ajouter 40% d’oxygène dans le sac du bioréacteur à 0,1 psi. Installez l’unité de bioréacteur à un angle de 20° et secouez le sac à 25 tr / min.
    3. Décongeler un flacon de chaque cellule TIPS BV-AAV2-GFP (ou gène thérapeutique) et BV-AAV2-rep-capuchon. Diluer les cellules avec 20 mL de milieu de culture d’insectes et effectuer un comptage de viabilité des cellules en utilisant du bleu de trypan. Inoculez les deux cellules TIPS dans un rapport de 1:10 000 par rapport aux cellules Sf9 naïves cultivées dans une fiole agitatrice ou un bioréacteur.
      REMARQUE: La survie des cellules TIPS est réduite en raison de la cryoconservation, et le taux de récupération est d’environ 50% lorsque la viabilité cellulaire est déterminée avec la coloration bleu trypan. Effectuer une expérience pilote pour déterminer empiriquement le rapport entre les cellules TIPS et les cellules Sf9 naïves avant la production de rAAV à grande échelle.
  2. Jour 2 : Suivi de la culture
    1. Récolter 1 mL de culture Sf9 de manière aseptique. Coloration avec le colorant bleu Trypan pour analyser le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie.
  3. Jour 3 : Surveillance de la culture et alimentation
    1. Récoltez 1 mL de culture Sf9 et analysez le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie. Vérifiez l’état de l’infection à baculovirus après avoir coloré les cellules Sf9 comme mentionné à l’étape 1.3.
      REMARQUE: L’augmentation du diamètre cellulaire et l’effet cytopathique sont des indications d’infection à baculovirus. L’augmentation du diamètre précède une diminution de la viabilité cellulaire, et ces paramètres sont utilisés pour déterminer le temps de récolte cellulaire pendant la production d’AAV. Déterminez empiriquement le point temporel optimal.
    2. Nourrissez la culture Sf9 avec un milieu de culture d’insectes frais dans un rapport de 1:5 de manière aseptique.
  4. Jour 4 : Suivi de la culture
    1. Récoltez 1 mL de culture Sf9 et analysez le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie. Débranchez l’alimentation en oxygène du sac du bioréacteur.
  5. Jour 5 : Suivi de la culture et récolte
    1. Récoltez 1 mL de culture Sf9 et analysez le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie. Récoltez le milieu de culture et les cellules lorsque la viabilité des cellules Sf9 a diminué à environ 50 %(Figure 4).
    2. Faire tourner la suspension de la cellule à 2100 x g pendant 15 min à 4 °C. Recueillir le surnageant et la pastille cellulaire et les stocker à -80 °C.

3. Lyse des cellules et libération d’AAV

  1. Décongeler la pastille de cellule de production DVA. Ajouter 100 mL de tampon de lyse cellulaire (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de chlorure de sodium, 0,5 % Triton-X-100) à la pastille cellulaire, mélanger vigoureusement et incuber pendant 30 min à température ambiante pour libérer les particules AAV.
  2. Centrifuger à 2100 × g pendant 30 min à 4 °C et transférer le lysat de cellule dans un nouveau récipient. Mélanger le lysat cellulaire et le surnageant de culture cellulaire après décongélation.
  3. Ajouter 20 U/mL nucléase et 10 mM MgCl2 au lysat cellulaire pour digérer l’ADN et l’ARN. Incuber pendant 2-4 h à 37 °C.
  4. Filtrer le lysat à travers un système de double filtration de 0,8 μm et 0,2 μmpolyéthersulfone à l’aide d’une pompe.
  5. Conservez le lysat de cellules clarifié à 4 °C pendant la nuit ou purifiez immédiatement l’AAV.

4. Purification du vecteur AAV à l’aide d’un système de chromatographie sur colonne d’affinité

  1. Préparer l’instrument de chromatographie en lavant séquentiellement l’échantillon et les lignes tampons avec de l’eau stérile, de l’hydroxyde de sodium 1 N, de l’eau et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) à un débit de 50 mL/min.
  2. Montez la colonne AVB Sepharose (10,0 mL) dans le système de chromatographie et faites fonctionner 100 mL de PBS à un débit de 5 mL/min.
    REMARQUE: Utilisez un volume inférieur ou supérieur de colonne AVB Sepharose en fonction de l’échelle de production d’AAV et configurez le débit comme suggéré par le fabricant de la colonne ou de la résine (voir Tableau des matériaux).
  3. Pour collecter les fractions de la solution de passage de colonne, du tampon de lavage et du tampon d’élution contenant des particules AAV, insérez des tubes dans les fentes du collecteur de fractions de l’instrument de chromatographie.
  4. Équilibrez la colonne avec pbS à un débit de 5,0 mL/min.
  5. Chargez le lysat de cellule filtré contenant des particules AAV sur la colonne à l’aide de la machine de chromatographie équipée d’une pompe à échantillon. Exécutez l’échantillon à un débit de 3,0 mL par minute.
  6. Faites passer le PBS à travers la colonne AVB Sepharose à un débit de 3,0 mL/min jusqu’à ce que la courbe d’absorbance ultraviolette (UV) (280 nm) revienne à la ligne de base et devienne stable.
  7. Éluez les particules d’AAV de la colonne avec un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 3,0) à un débit de 3,0 mL/min(Figure 5).
    REMARQUE: Alors que les particules AAV se dissocient de la résine et traversent le détecteur UV, un pic d’élution de protéine peut être vu sur le chromatogramme.
  8. Diluer immédiatement le surnageant AAV avec un volume d’un cinquième de Tris-HCl de 500 mM (pH 8,0) pour augmenter le pH du surnageant contenant de l’AAV à environ pH 5,5 afin d’empêcher la dégradation médiée par le pH avec un tampon d’élution acide. De plus, diluez le surnageant AAV 10 fois avec du PBS pour neutraliser complètement le pH.
    REMARQUE: La valeur du pH est d’environ 5,5 après neutralisation de la solution de rAV. Après avoir neutralisé l’AAV, diluer la solution de rAV 10 fois avec du PBS (pH 7,4) afin que l’AAV soit dans un tampon physiologique.
  9. Stocker 1 mL d’échantillons traversants de colonne, un tampon de lavage et 100 μL du surnageant AAV élué pour évaluer la présence d’AAV par infection des cellules cibles.
  10. Nettoyez la colonne AVB Sepharose avec 100 mL d’acide citrique 100 mM (pH 2,1) et 100 mL de PBS (pH7,4) à un débit de 5,0 mL/min. Rincer la colonne avec de l’éthanol à 20 % à un débit de 5,0 mL/min et conserver à 4 °C.
  11. Nettoyez les canalisations de l’instrument de chromatographie avec la position hors ligne de la colonne comme décrit à la section 4.1. Enfin, rincez le système de chromatographie avec 200 mL d’éthanol à 20 % à un débit de 50,0 mL/min et conservez-le dans de l’éthanol à 20 %.

5. Concentration et diafiltration du vecteur AAV à l’aide de la filtration à flux tangentiel (TFF)

  1. Configurez le système TFF équipé d’une cartouche à membrane de polysulfone (100 kDa Molecular Weight Cut Off) pour concentrer l’AAV.
  2. Équilibrer le module TFF avec 200 mL de PBS pendant 10 min.
  3. Chargez l’échantillon AAV en contrôlant le débit de la pompe jusqu’à ce que l’échantillon soit réduit au volume souhaité tout en maintenant une pression transmembranaire à 2-3 psi.
  4. Diafiltrer le rétentat avec 100 mL de PBS, tel qu’utilisé dans cette étude, ou définir empiriquement un tampon alternatif qui soutient la stabilité à long terme de l’AAV.
  5. Après avoir concentré l’échantillon d’AAV au volume souhaité, prélever l’échantillon d’AAV, le filtrer à travers un filtre en polyéthersulfone de 0,2 μm, aliquote, puis le stocker à -80 °C.

6. Infection des échantillons d’AAV dans les cellules cibles pour évaluer la présence d’AAV dans les étapes de purification

  1. Inoculer 7 x 104 cellules HT1080/puits dans une plaque de 24 puits dans 500 μL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 1 % de L-glutamine, 1 % de pyruvate de sodium et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) la veille de l’infection. Cultiver les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
  2. Comptez les cellules avant l’infection. Ajoutez l’échantillon en vrac AAV non purifié dilué avant l’exécution de la colonne, les échantillons de passage de colonne, le tampon de lavage et l’échantillon AAV purifié élué.
    REMARQUE: Comptez les cellules colorées en bleu trypan avec un hémocytomètre. Déterminer empiriquement le facteur de dilution et le volume (μL) des échantillons de VAA. Plus les titres AAV sont élevés, plus la dilution est nécessaire. S’assurer que les particules de baculovirus de l’échantillon en vrac non purifié avant l’écoulement de la colonne, les échantillons de passage de la colonne, le tampon de lavage sont inactivés à la chaleur à 50 °C pendant 50 min avant d’infecter les cellules cibles pour déterminer les titres infectieux de LAV.
  3. Deux jours après l’infection, analysez l’expression des protéines (p. ex. GFP ou gène thérapeutique) dans les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.
  4. Calculer les titres infectieux de l’AAV en utilisant le nombre de cellules au moment de l’infection, le facteur de dilution et le pourcentage de cellules GFP+ avec la formule: (Nombre total de cellules x Pourcentages de cellules GFP+ x Facteur de dilution) / Volume d’AAV en millilitres.
    REMARQUE: Par exemple, le nombre de cellules est de 1 x 105, le pourcentage de cellules GFP + est de 3,4%, le facteur de dilution est de 100 et le volume d’AAV ajouté est de 2 μL. Le titre de l’AAV est de 1,7 x 108 unités infectieuses (UI) / mL. La quantité totale de particules d’AAV purifiées dans 25 mL de la fraction éluée est de 4,3 x 109 unités infectieuses (UI)/mL(Figure 6). Le nombre total de particules initiales d’AAV non purifiées est de 1,09 x10 10 UI/mL, et les particules d’AAV purifiées sont de 4,3 x10 9 UI/mL. Par conséquent, le pourcentage de récupération est de 39,4%. Le pourcentage de cellules GFP+ doit être compris entre 1% et 30%, ce qui correspond à une plage linéaire lorsqu’il est utilisé pour calculer le titre infectieux de l’AAV. Si des particules vectorielles AAV plus concentrées sont infectées dans les cellules cibles; il est possible que plusieurs copies des particules AAV infectent une seule cellule qui apparaîtra comme une seule copie du vecteur. Par conséquent, diluer le surnageant du vecteur AAV pour obtenir une infection vectorielle de 1% à 30% dans les cellules cibles. Si le vecteur AAV n’a pas de gène rapporteur, colorez le transgène ou le gène thérapeutique exprimé par le vecteur AAV avec un anticorps contenant un colorant fluorescent qui peut être détecté et quantifié à l’aide d’un cytomètre en flux. Tous les sérotypes AAV ne peuvent pas infecter efficacement les cellules HT1080. Par conséquent, pour effectuer le test d’infectiosité pour d’autres sérotypes AAV, utilisez différentes lignées cellulaires. Titrer les particules AAV2-GFP avant et après purification sur les cellules HT1080 et mesurer l’expression GFP par cytométrie en flux. Calculer la récupération (%) par le rapport entre le nombre de particules AAV purifiées et le nombre de particules AAV avant purification multiplié par 100.

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Representative Results

Ici, les résultats représentatifs du développement de processus pour la production et la purification de vecteurs AAV à l’aide du système de cellules d’insectes Sf9 sont présentés. La méthode comprend la co-culture de cellules Sf9 avec des cellules TIPS infectées par le baculovirus, l’alimentation des cellules avec un milieu de croissance, la récolte et la lyse des cellules productrices pour libérer les particules aAV, la clarification du lysat cellulaire avec un traitement nucléase, la centrifugation et la filtration, la purification de l’AAV par chromatographie d’affinité AVB Sepharose et la concentration avec TFF (Figure 1).

Les cellules TIPS sont générées par l’infection de BV-AAV2-GFP ou gène thérapeutique et BV-AAV2-rep-cap dans les cellules Sf9 séparément. La plupart des cellules Sf9 sont infectées par le baculovirus en 3-4 jours en raison des multiples cycles d’infection, mis en évidence par l’expression de la glycoprotéine gp64 du baculovirus dans (Figure 2) et les cellules montrent une augmentation du diamètre (Figure 3). Les cellules TIPS sont récoltées 3 à 4 jours après l’infection et cryoconservées. Les cellules Sf9 sont co-cultivées avec les cellules TIPS qui sécrètent des particules de baculovirus dans le milieu de culture qui infectent les cellules Sf9 naïves. Le baculovirus est capable de réplication; par conséquent, le nombre de cellules infectées augmente rapidement par de multiples infections rondes avec des particules de baculovirus nouvellement produites qui sont sécrétées dans le milieu de culture8,9. Les cellules montrent une augmentation du diamètre, un effet cytopathique, et environ la moitié des cellules meurent dans les 5 jours suivant l’infection, qui sont les signes de l’achèvement de la production d’AAV (Figure 4).

Les cellules productrices d’AAV sont récoltées par centrifugation à basse vitesse, lysées avec un tampon contenant du détergent pour libérer l’AAV dans le lysat cellulaire. Celle-ci est ensuite traitée avec une nucléase pour la digestion de l’ADN et de l’ARN afin de réduire la viscosité, filtrée à travers une membrane de 0,8 μm et 0,2 μm, puis purifiée et concentrée. Le lysat cellulaire est chargé sur une colonne AVB Sepharose à l’aide d’un système de chromatographie. La résine AVB Sepharose lie les particules AAV2 en raison de son affinité avec les protéines de la capside. Le tampon de lavage est passé à travers la colonne AVB Sepharose pour éliminer les matériaux non liés et faiblement liés jusqu’à ce que la courbe d’absorbance ultraviolette (UV) (280 nm) devienne stable à la ligne de base. Étant donné que les particules d’AAV lient fortement AVB Sepharose, aucun nombre significatif de particules D’AAV2 n’est détecté pendant le lavage. Les particules d’AAV sont éluées avec un tampon acide (pH 3,0), ce qui dissocie l’interaction entre les particules d’AAV et la résine AVB Sepharose. Pour éviter la dégradation médiée par le pH de l’AAV par la solution acide, l’éluant est neutralisé avec un tampon alcalin (pH 8,0). Un pic de protéine est observé lors de l’élution avec un tampon acide correspondant à la fraction AAV(Figure 5 et Figure 6). L’AAV purifié est dilué 10 fois avec du PBS, concentré et tampon échangé avec un système TFF. Dans cet exemple, les particules totales d’AAV dans le lysat cellulaire (560 mL) sont de 1,1 x 1014 vecteur génome (vg), après purification par chromatographie AVB Sepharose (25 mL) sont de 4,1 x 1013 vg, et après concentration avec TFF (25 mL) sont de 2,4 x 1013 vg. Les échantillons d’AAV purifiés montrent trois protéines de capside distinctes, VP1, VP2 et VP3, après SDS-PAGE et coloration à l’argent(Figure 7)

Figure 1
Figure 1: Schéma pour la production et la purification du vecteur AAV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Analyse par cytométrie en flux de l’expression du baculovirus gp64 dans les cellules Sf9. Les cellules Sf9 infectées par le baculovirus sont colorées avec un anticorps anti-baculovirus gp64 de souris contenant un colorant fluorescent, qui est détecté par cytométrie en flux. (A) Cellules Sf9 non infectées. (B) Les cellules Sf9 infectées par le baculovirus montrent une expression de gp64 dans la plupart des cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Morphologie des cellules Sf9 infectées par le baculovirus (TIPS). Le baculovirus est infecté dans les cellules Sf9 pour produire les cellules TIPS. (A) Cellules Sf9 non infectées. ( B )CellulesSf9 infectées par le baculovirus (TIPS). Les cellules sont affichées à un grossissement de 200x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Morphologie des cellules Sf9 infectées par le baculovirus pendant la production d’AAV. Les cellules TIPS sécrètent des baculovirus qui infectent les cellules Sf9 naïves co-cultivées pendant la production d’AAV. (A) Cellules Sf9 non infectées. (B) Les cellules Sf9 infectées par le baculovirus montrent une augmentation du diamètre. Cinq jours après l’infection, près de la moitié des cellules meurent (visualisées sous un microscope à phase inversée après coloration au bleu trypan). Les flèches rouges indiquent les cellules vivantes et les flèches bleues indiquent les cellules mortes. Les cellules sont affichées à un grossissement de 200x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Purification de l’AAV par chromatographie sur colonne AVB Sepharose. Un chromatogramme montre l’absorbance des échantillons de protéines à 280 nm pendant le chargement de l’échantillon sur la colonne, le lavage et l’élution. Le chromatogramme a été modifié pour s’adapter à la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Nombre de particules AAV infectieuses dans l’écoulement pendant le chargement sur la colonne, le lavage et l’élution. Au total, 560 mL d’échantillons aav sont chargés sur une colonne de sépharose AVB de 10 mL. Le volume de fraction pour la charge de la colonne est de 50 mL, le lavage de la colonne est de 50 mL et l’élution est de 25 mL. Les titres d’AAV sont mesurés après l’infection des cellules HT1080 avec les échantillons de passage de colonne lors du chargement sur la colonne, du lavage et de l’élution pour étudier la présence d’AAV à chaque étape de la purification. Le rendement total en AAV purifié est de 4,3 x 109 unités infectieuses. Chaque symbole en forme de diamant représente les unités infectieuses (UI) de l’AAV dans chaque fraction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Graphique 7. SDS-PAGE et coloration à l’argent du vecteur AAV pur montrant des protéines de capside. Les échantillons AAV réduits sont exécutés sur SDS-PAGE et une coloration à l’argent est effectuée. Trois bandes distinctes de protéines de capside AAV, VP1, VP2 et VP3, sont visibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les paramètres utilisés dans ce protocole pour le développement de processus de production, de purification et de concentration de vecteurs AAV peuvent être appliqués à la fabrication à petite et à grande échelle de vecteurs AAV pour des applications de thérapie génique. L’ensemble du processus en amont et en aval peut être effectué dans un système fermé compatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) en vigueur. Les principaux avantages du système Sf9-baculovirus sont l’évolutivité pour la production à grande échelle d’AAV de qualité GMP à un coût abordable. Le système n’a pas besoin de plasmides coûteux et de réactifs de transfection, qui sont nécessaires à la production d’AAV à l’aide de cellules HEK293. Il a été rapporté que les cellules HEK293 et les cellules Sf9 produisent des vecteurs AAV de qualité similaire (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Abstract #100). Le défi majeur est que ce système nécessite la génération de baculovirus et de cellules TIPS qui nécessitent beaucoup de temps et d’efforts.

Dans ce protocole, deux types de cellules TIPS (système TwoBac) ont été utilisés : une cellule TIPS contenant un baculovirus avec cassette de transfert de gène AAV et une autre cellule TIPS contenant AAV-rep-cap. Le système OneBac2,16,17 peut générer des cellules TIPS contenant à la fois des gènes de transfert de gènes AAV et des gènes de rep-cap dans un seul baculovirus. Le système OneBac fournit une approche alternative pour produire le rAAV en utilisant un seul ensemble de cellules TIPS plutôt que deux comme décrit dans le système TwoBac, ce qui simplifierait davantage le protocole.

Ce protocole décrit la production d’AAV dans les cellules Sf9. Il est important d’optimiser le rapport entre les cellules TIPS infectées par le baculovirus et les cellules Sf9 naïves productrices afin d’obtenir un bon rendement en AAV. Si ce rapport est sous-optimal, le rendement de l’AAV sera réduitde 11. Par exemple, si plus d’ITR AAV contenant des vecteurs de transfert de gènes sont générés que les capsides dans les cellules productrices en raison du rapport sous-optimal des TIPS et des cellules productrices, tous les vecteurs de transfert de gènes disponibles n’obtiendront pas assez de capsides pour produire des particules AAV complètes. D’autre part, si plus de capsides sont générées que les vecteurs de transfert de gènes AAV dans les cellules productrices, toutes les capsides n’obtiendront pas d’ITR AAV contenant des vecteurs de transfert de gènes qui entraînent des particules AAV vides.

Au fur et à mesure que les cellules se multiplient, les nutriments du milieu de culture s’épuisent et les déchets métaboliques s’accumulent. Par conséquent, la supplémentation de 20 % de milieu de croissance frais dans la culture cellulaire 2 jours après la co-culture des cellules TIPS et des cellules Sf9 peut augmenter considérablement les titres AAV (Amine A. Kamen, Conseil national de recherches canada, communication personnelle).

La pureté des particules d’AAV est un facteur critique pour obtenir une transduction efficace des cellules cibles sans aucune cytotoxicité pour les études in vitro et in vivo 3,5. Par conséquent, il est important d’inclure une étape de chromatographie capable de purifier sélectivement les particules d’AAV et d’éliminer les impuretés telles que les protéines et les débris de la cellule hôte, l’ADN génomique et baculoviral et les vecteurs agrégés et fragmentés. Lors du chargement d’un surnageant AAV sur une colonne AVB Sepharose, il est essentiel de vérifier la présence de particules AAV qui peuvent traverser la colonne sans se lier à la résine. Si tel est le cas, (1) une vitesse de course plus faible qui se traduit par un temps de séjour plus long sera nécessaire pour lier les particules AAV, (2) la quantité d’échantillon chargé sur la colonne devrait être réduite et/ou (3) le volume de l’AVB Sepharose devrait être augmenté, de sorte que la capacité de liaison de la colonne ne dépasse jamais le nombre de particules AAV. La capacité de la résine AVB Sepharose à lier les particules aAV à un débit élevé et avec une affinité et une capacité élevées est importante pour réduire le temps de purification. La principale limitation de l’AVB Sepharose est qu’elle lie la capside des sérotypes AAV 1, 2 et 5. Par conséquent, différentes résines de chromatographie doivent être testées et utilisées pour la purification d’autres sérotypes AAV18. Le protocole de purification en aval décrit ici peut également être utilisé pour purifier l’AAV produite dans les cellules HEK 293.

Ce protocole peut purifier l’AAV du lysat cellulaire mais ne peut pas éliminer les particules vides. Quelques articles ont décrit des méthodes qui peuvent distinguer les particules d’AAV vides des particules complètes dans les stocks d’AAVpurifiés 19,20. Cependant, nous pensons que la production d’AAV devrait être optimisée au niveau du processus en amont afin de minimiser la génération de particules vides. Si le rapport entre le vecteur de transfert de gène AAV et la production de capside dans les cellules productrices n’est pas optimal, davantage de particules vides peuvent être générées.

En plus de lier des particules aAV complètes, le milieu AVB Sepharose lie des particules d’AAV fragmentées ou des protéines de capside qui peuvent être éliminées à l’aide de TFF. La plupart des particules de faible poids moléculaire sont éliminées des échantillons AAV en incluant l’étape TFF en aval de la chromatographie sur colonne. De plus, le TFF est utilisé pour effectuer un échange tampon/diafiltration et pour concentrer l’AAV10,21.

Bien que l’ultracentrifugation du lysat d’AAV avec un gradient de chlorure de césium ou d’iodixanol soit la méthode préférée pour la purification de l’AAV à petite échelle et de qualité préclinique, cette méthode n’est pas évolutive et convient moins à la purification à grande échelle de l’AAV21,22.

En conclusion, ce protocole pour le développement de processus de production et de purification de l’AAV sera utile pour la fabrication préclinique à petite échelle et à grande échelle d’AAV recombinant pour la thérapie génique des maladies génétiques héréditaires.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le Dr Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) de nous avoir généreusement fourni les plasmides AAV et Danielle Steele et Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) pour leur assistance technique. Ce travail est soutenu par le fonds Start-Up de la Cincinnati Children’s Research Foundation à M.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
2 L flasks ThermoFisher Scientific 431281 Flask for suspension culture
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of supernatants
24-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Adherent cell culture plate
250 mL flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn Software Cytiva 28976337 Chromatography system
AVB Sepharose High Performance Cytiva 28411210 Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFP In-house non-catalog AAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-cap In-house non-catalog AAV packaging vector
Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking buffer Santa Cruz Biotechnologies 516214 Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis buffer In-house Non-catalog item 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 L Cytiva 28937662 Bioreactor bag
Cleaning buffer In-house Non-catalog item 100 mM citric acid (pH 2.1) 
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For cryopreservation
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Elution buffer In-house Non-catalog item 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit  Pall Corporation 12941 Membrane filter
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture media Cytiva SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic Pump Pall Corporation Non-catalog item TFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
Microscope Nikon Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody Santa Cruz Biotechnologies 65498 PE Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tank Praxair Non-catalog item 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBS ThermoFisher Scientific 20012027 Wash buffer
Silver Staining kit ThermoFisher Scientific LC6100 Staining AAV capsid proteins
Sf9 cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Steile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge Pall Corporation OA100C12 TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0 ThermoFisher 15568025 Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50 Cytiva 28-9378-00 Bioreactor

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References

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Biologie numéro 179 AAV baculovirus cellules Sf9 bioréacteur chromatographie purification filtration à flux tangentiel
Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte
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