Summary
Das Protokoll beschreibt die Bildung robuster und biokompatibler DNA-beladener Mikrokapseln als gemultiplexte In-vitro-Biosensoren , die in der Lage sind, mehrere Liganden zu verfolgen.
Abstract
Wir stellen ein Protokoll für die Herstellung von DNA-beladenen Seidenfibroin-Mikrokapseln über die Layer-by-Layer (LbL) Assemblierungsmethode auf sphärischen Opferkernen vor. Nach Adsorption einer Hauptschicht und DNA-Plasmiden wurde die Bildung robuster Mikrokapseln durch die Induktion von β-Blättern in der Seidensekundärstruktur während der akuten Dehydratisierung einer einzelnen Seidenschicht erleichtert. Daher erfolgte die Schichtung über mehrfache Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen. Nach der Adsorption von mehrschichtigen Hüllen können die Kern-Schale-Strukturen mit Goldnanopartikeln (AuNPs) und/oder Antikörpern (IgG) weiter funktionalisiert werden, um sie für die Fernerkundung und/oder den gezielten Transport zu verwenden. Die Einstellung mehrerer Schlüsselparameter während der sequentiellen Abscheidung von wichtigen Makromolekülen auf Siliziumdioxidkernen, wie z. B. das Vorhandensein eines Polymerprimers, die Konzentration von DNA und Seidenprotein sowie eine Reihe von adsorbierten Schichten, führte zu biokompatiblen, DNA-beladenen Mikrokapseln mit variabler Permeabilität und DNA-Beladung. Nach der Auflösung von Siliziumdioxidkernen zeigte das Protokoll die Bildung von hohlen und robusten Mikrokapseln mit DNA-Plasmiden, die an der Innenfläche der Kapselmembran immobilisiert waren. Durch die Schaffung einer selektiv permeablen biokompatiblen Membran zwischen den DNA-Plasmiden und der äußeren Umgebung blieb die DNA während der Langzeitlagerung erhalten und spielte eine wichtige Rolle bei der verbesserten Output-Antwort von räumlich begrenzten Plasmiden. Die Aktivität von DNA-Templates und ihre Zugänglichkeit wurden während in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionen (zellfreie Systeme) getestet. DNA-Plasmide, die für RNA-Light-up-Aptamere und Riboschalter kodieren, wurden erfolgreich mit entsprechenden Analyten aktiviert, wie bei der Lokalisierung von fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripten oder GFPa1-Proteinen in den Schalenmembranen sichtbar wurde.
Introduction
Das Gebiet der synthetischen Biologie bietet einzigartige Möglichkeiten, Sensorfähigkeiten zu entwickeln, indem natürliche Mechanismen genutzt werden, die von Mikroorganismen entwickelt wurden, um ihre Umwelt und potenzielle Bedrohungen zu überwachen. Wichtig ist, dass diese Sensormechanismen in der Regel mit einer Reaktion verbunden sind, die diese Mikroorganismen vor schädlicher Exposition schützt und die Genexpression reguliert, um negative Auswirkungen zu mildern oder die Aufnahme giftiger Materialien zu verhindern. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um diese Mikroorganismen so zu verändern, dass sie Ganzzellsensoren herstellen, die diese natürlichen Reaktionen nutzen, sie aber umleiten, um neue Ziele zu erkennen und/oder ein messbares Signal zu erzeugen, das zu Quantifizierungszwecken gemessen werden kann (typischerweise Fluoreszenz)1,2. Gegenwärtig deuten Bedenken hinsichtlich der Verwendung genetisch veränderter Mikroorganismen (GVO), insbesondere bei der Freisetzung in der Umwelt oder im menschlichen Körper, aufgrund des Austritts ganzer Zellen oder eines Teils ihres genetischen Materials, selbst wenn es in einer Polymermatrix eingekapselt ist, darauf hin, dass alternative Wege zur Nutzung dieser Sensoransätze erforderlich sind3.
Ein wirksamer Ansatz, um die Vorteile der mikroorganismenbasierten Sensorik zu nutzen, ohne sich Gedanken über den Einsatz von GVO machen zu müssen, ist die Verwendung von In-vitro-Transkriptions-/Translationssystemen (IVTT). Aus praktischer Sicht bestehen IVTT-Systeme aus einer Mischung, die die meisten Zellbestandteile in einem aktiven Zustand enthält, die auf unterschiedliche Weise aus den Zellen "extrahiert" wurden,z. B. durch Beschallung, Perlenschlagen oder andere 4. Das Endprodukt dieses Prozesses ist ein biochemisches Reaktionsgemisch, das bereits für die Transkription und Translation optimiert ist und zum Testen verschiedener Sensoren in einem "offenen Gefäß"-Format verwendet werden kann, ohne die Einschränkungen, die mit der Verwendung ganzer Zellen verbunden sind (Membrandiffusion, Transformationseffizienz, Zelltoxizität usw.). Wichtig ist, dass verschiedene Sensorkomponenten quantitativ hinzugefügt und ihre Wirkung durch verschiedene optische und spektrometrische Techniken untersucht werden können, wie wir gezeigt haben5. Es wurde festgestellt, dass die Leistung von IVTT-Systemen inkonsistent sein kann. Neuere Studien haben jedoch Ansätze zur Standardisierung ihrer Präparation und Charakterisierung gezeigt, was bei der Untersuchung ihrer Leistung im Sensordesign eine große Hilfe ist6. In jüngster Zeit wurden viele Beispiele für IVTT-Systeme demonstriert, die zur Herstellung papierbasierter Assays durch die Gefriertrocknung ihrer Komponenten in Papiermatrizes verwendet werden, einschließlich der Detektion von Schwermetallionen, Drogen, Quorum-Sensorelementen und anderen 7,8,9. Ein spannender Anwendungsbereich für IVTT-basierte Sensoren ist ihr Einsatz in Sensoranwendungen in verschiedenen Arten von Umgebungen, einschließlich Boden, Wasser und dem menschlichen Körper. Um diese IVTT-Systeme in diesen anspruchsvollen Umgebungen einsetzen zu können, muss ein Kapselungsansatz implementiert werden, um die IVTT-Komponenten einzudämmen und sie vor Verschlechterung zu schützen.
Die gebräuchlichsten Verkapselungsansätze für IVTT-Systeme umfassen die Verwendung von Lipidkapseln, Mizellen, Polymersomen und anderen dicht geschlossenen Mikrobehältern10,11,12. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist die Notwendigkeit, entweder passive oder aktive Mechanismen für den Transport von Materialien in und aus den Behältern zu integrieren, um die Kommunikation mit der externen Umgebung zu ermöglichen und Sensorfunktionen bereitzustellen. Um einige dieser Probleme zu überwinden, berichtet die Studie hier über eine Methode, die einen einfachen, aber effektiven Ansatz zur Verkapselung der Kodierungsmaterialien für verschiedene Sensordesigns bietet, die in IVTT-Systemen ausgedrückt werden sollen. Dieser Ansatz basiert auf der Verwendung der Layer-by-Layer (LbL)-Abscheidung eines Biopolymers in Gegenwart der interessierenden Plasmide, um hohle Mikrokapseln mit hoher Porosität herzustellen, die es dem geschützten genetischen Material ermöglichen, mit den verschiedenen Komponenten des IVTT der Wahl zu interagieren. Die Studie zeigte, dass verkapselte Plasmide die Transkription und Translation steuern können, wenn sie innerhalb dieser polymeren Matrix aktiviert werden, wie die Reaktion eines Plasmid-kodierten Aptamers und eines Riboschalters auf ihre entsprechenden Ziele zeigt. Zusätzlich schützt diese LbL-Beschichtung die Plasmide monatelang ohne besondere Lagerbedingungen.
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Protocol
1. Konstruktion des Plasmidvektors.
- Konstruieren eines Plasmidvektors (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) durch Amplifikation der kodierenden Sequenz eines Theophyllin-Riboschalters (ThyRS) gekoppelt mit GFPa1 aus pJ201:23976-RS-GFPa1-Vektor (entworfen und erzeugt von DNA2.0) und Insertion in den E . coli-Expressionsvektor pSAL13. Verwenden Sie vorwärts (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') und umgekehrt (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') Primer, um die kodierende Sequenz von ThyRS gekoppelt mit GFPa1 zu amplifizieren und eine PCR-Reaktion in 50 μl Volumen unter Verwendung der DNA-Polymerase gemäß dem Protokoll des Herstellersdurchzuführen 14.
- Bereiten Sie ein 1%iges Agarose-Gel aus 0,5 g Agarose, 50 ml TAE-Puffer (40 mM Trisacetat, 1 mM EDTA, pH 8,0) und 3 μl DNA-Färbung vor.
- Mischen Sie 5 μL aliquot des PCR-amplifizierten Produkts mit 5 μL RNase/DNase-freiem Wasser und 2 μL 6x Gelladefarbstoff und analysieren Sie es mittels Agarose-Gelelektrophorese. Laden Sie eine DNA-Leiter (0,1-10,0 kb) als Referenz. Lassen Sie das Gel bei 120 V laufen, bis die Färbelinie fast den Boden des Gels erreicht hat.
- Visualisieren Sie die DNA-Fragmente mit einem UV-Transilluminator-Bildgebungssystem, um die richtige Größe von DNA15 zu überprüfen.
- Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Aufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers16.
- Das PCR-Produkt und der pSAL-Expressionsvektor werden mit KpnI- und BlpI-Restriktionsenzymen in einer 15-μl-Reaktion aufgeschlossen, die 10 μl PCR-Produkt oder Plasmidvektor (Konzentration 20-50 ng/μl), 1,5 μl 10x Enzympuffer, 1 μl jedes Enzyms und 1,5 μl RNase/DNase-freies Wasser enthält, bei 37 °C für 2 h.
- Fügen Sie der Reaktionsmischung 3 μl 6x Gelladefarbstoff hinzu und trennen Sie die aufgeschlossenen Fragmente auf einem 1%igen Agarosegel, wie in den Schritten 1.3 bis 1.5 beschrieben.
- Reinigen Sie die DNA-Fragmente mit einem Gelextraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers16.
- Ligatieren Sie das verdaute PCR-Produkt in einen verdauten linearisierten Plasmidvektor, pSAL, unter Verwendung der T4-DNA-Ligase und des supplementierten Ligasepuffers in einer 10-μl-Reaktion, die 3-20 fmol des verdauten Vektors, 9-60 fmol des verdauten PCR-Produkts, 2 μl Ligasepuffer, 1 μl (1 Einheit) T4-DNA-Ligase und DNase/RNase-freies Wasser enthält. Inkubieren Sie die Ligationsreaktion bei 25 °C für 3 h.
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass der Gesamt-DNA-Gehalt im Reaktionsgemisch 0,01-0,1 μg beträgt. - Transformieren Sie E. coli DH5α-kompetente Zellen mit 10 ng des Ligationsreaktionsgemisches gemäß dem Protokoll des Herstellers17.
- Die transformierten Zellen werden bei 37 °C über Nacht auf LB-Agarplatten gezüchtet, die mit Ampicillin (100 μg/ml) angereichert sind.
- Nehmen Sie 3-4 Bakterienkolonien von der Platte und übertragen Sie jede von ihnen aseptisch in 5 ml LB-Medien, die mit Ampicillin (100 μg/ml) angereichert sind. Die Kulturen werden über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 225 U/min gezüchtet.
- Pelletieren Sie die Kulturen über Nacht durch Zentrifugieren bei 11 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Verwenden Sie ein Aufreinigungskit, um die Plasmide gemäß dem Protokoll des Herstellers16 zu reinigen.
- Verifizieren Sie die Sequenzen der gereinigten Plasmide durch DNA-Sequenzierung. Die Plasmidkarte und die Sequenz des resultierenden Konstrukts (pSALv-RS-GFPa1) sind in Abbildung 1 dargestellt.
2. DNA-Aufreinigung im großen Maßstab.
- Der Plasmidvektor pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (kodiert für Theophyllin-Riboswitch gekoppelt mit GFPa1-Reportergen) oder pET28c-F30-2xBroccoli (5,4 kb) (kodiert für Brokkoli-Aptamer) wird gemäß dem Protokoll des Herstellers in E. coli DH5α-kompetente Zellen transformiert17.
- Die transformierten Zellen werden bei 37 °C über Nacht auf LB-Agar-Platten gezüchtet, die mit Ampicillin (100 μg/ml) für Zellen, die mit pSALv-RS-GFPa1 transformiert wurden, oder Kanamycin (50 μg/ml) für Zellen, die mit pET28c-F30-2x Brokkoli transformiert wurden, ergänzt werden.
- Nehmen Sie 3-4 Bakterienkolonien von der Platte und übertragen Sie jede Kolonie aseptisch in 5 ml LB-Medien, die mit einem geeigneten Antibiotikum (100 μg/ml Ampicillin oder 50 μg/ml Kanamycin) ergänzt werden. Die Kulturen werden über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 225 U/min gezüchtet.
- Verwenden Sie 3 ml der Übernachtkultur, um in 150 ml LB zu inokulieren, die mit einem geeigneten Antibiotikum (100 μg/ml Ampicillin oder 50 μg/ml Kanamycin) ergänzt werden, und züchten Sie die Kulturen über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 225 U/min.
- Die Zellen werden durch Zentrifugation bei ≥3400 x g für 10 min bei 4 °C pelletiert.
- Verwenden Sie ein Aufreinigungskit, um die Plasmide gemäß dem Protokoll des Herstellers16 zu reinigen.
- Die DNA wird mit 0,5 ml reinem DNase/RNase-freiem Wasser eluiert. Messen Sie die DNA-Konzentration und bereiten Sie 1 ml DNA-Stammlösungen (100 ng/μl) vor. Lagern Sie die Röhrchen mit DNA bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
3. Extraktion von Seidenfibroin und Aufbereitung der Ausgangsmaterialien.
- Bereiten Sie eine wässrige Lösung von rekonstituiertem Seidenfibroin (SF)-Protein aus Bombyx mori-Seidenraupenkokons gemäß dem an anderer Stelle ausführlich beschriebenen Verfahren vor, das 10 % der Silk-LiBr-Lösung18 ausmacht.
- Bestimmen Sie die Endkonzentration der wässrigen SF-Lösung. Pipettieren Sie 0,5 ml Seidenlösung in eine 60-mm-Petrischale, lassen Sie sie bei 60 °C trocknen und messen Sie das Gewicht des trockenen Seidenfilms. Teilen Sie das Trockengewicht durch 0,5 ml, um den Gewichtsprozentsatz pro Volumen zu berechnen.
- Verdünnen Sie die konzentrierte Seidenlösung mit DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser, indem Sie langsam Wasser über eine serologische Pipette hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu erhalten. Lagern Sie die Lösung für die spätere Verwendung bei 4 °C.
- Fluoreszenzmarkiertes Seidenfibroin mit einem Antikörpermarkierungskit herstellen. Verwenden Sie 1 ml 2 mg/ml Seidenfibroinlösung, um die N-terminalen α-Aminogruppen des Proteins mit einem NHS-Ester-aktivierten derivativen Farbstoff gemäß dem Protokoll des Herstellers zu koppeln19.
- Bereiten Sie 50 ml wässrige Lösung aus Polyethylenimin (PEI) mit einer Konzentration von 6 mg/ml vor und stellen Sie den pH-Wert mit HCl (1 M) auf 4 ein. Filtern Sie die Lösung durch eine sterile 0,2 μm Membran. Die Lagerung ist bei Raumbedingungen über Monate möglich.
- Bereiten Sie SiO2-Kerne vor. Pipettieren Sie 300 μlSiO2-Partikel in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Mikropartikel zweimal mit 1 ml DNase/RNase-freiem Wasser durch Zentrifugieren bei 0,2 x g für 1 Minute.
4. Führen Sie eine schichtweise Abscheidung einer Hauptschicht, von DNA-Plasmiden und Seidenschichten durch.
- Um die PEI-Prime-Schicht auf den SiO2-Mikropartikeln abzuscheiden, wird 1 ml PEI-Lösung in das abgeschleuderte Pellet aus Schritt 3.6 gegeben und das Gemisch bei Umgebungsbedingungen auf einem Thermomischer bei 800 U/min 15 min lang gerührt. Waschen Sie die Partikel viermal mit 1 ml DNase/RNase-freiem deionisiertem Wasser durch Zentrifugation bei 0,2 x g für 1 min.
- Um die Abscheidung der DNA-Schicht durchzuführen, wird 1 ml der wässrigen Lösung von DNA-Plasmiden aus Schritt 2.7 zu den PEI-grundierten Mikropartikeln gegeben und das Gemisch bei 4 °C auf einem Thermomischer bei 800 U/min 15 min lang vorsichtig gerührt. Um Mikrokapseln mit unterschiedlichen DNA-Beladungen herzustellen, stellen Sie die Konzentration der DNA-Plasmide von 50-200 ng/μl mit DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser ein und verwenden Sie 1 ml dieser Lösungen, um die DNA abzuscheiden. Sammeln Sie die Mikropartikel durch Zentrifugation bei 0,2 x g für 1 min.
- Markieren Sie die Röhrchen für DNA-Plasmide, die für Theophyllin-Riboschalter kodieren, gekoppelt mit GFPa1 als ThyRS-GFPa1, und für DNA-Plasmide, die für Brokkoli-Aptamer als BrocApter kodieren.
Anmerkungen: Bewahren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit DNA auf Eis auf. - Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie die Mikropartikel viermal mit 1 ml DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser, wobei Sie den Überstand jedes Mal nach der Zentrifugation bei 0,2 x g für 1 Minute verwerfen. Führen Sie alle Experimente bei Raumtemperatur (RT) durch, sofern nicht anders angegeben.
- Um die Abscheidung der Seidenfibroinschicht durchzuführen, wird 1 ml der rekonstituierten wässrigen SF-Lösung aus Schritt 3.3 zu den DNA-adsorbierten Mikropartikeln gegeben, vorsichtig vortexiert und das Gemisch bei 10 °C auf dem Thermomischer bei 750 U/min für 15 min gerührt. Sammeln Sie die Mikropartikel durch Zentrifugieren bei 0,2 x g für 1 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie sie dann einmal mit 1 ml DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand.
Anmerkungen: Halten Sie die Seidenlösung während des Experiments auf Eis, um eine temperaturbedingte Gelierung zu vermeiden. - Behandeln Sie die Partikel nach und nach mit Methanol, um die Bildung von β-Faltblättern in der Seidenproteinstruktur zu induzieren. Fügen Sie zuerst 0,5 ml DNase/RNase-destilliertes Wasser hinzu, wirbeln Sie das Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dann 0,5 ml 100%iges Methanol hinzu. Schütteln Sie die Partikel auf dem Thermomischer bei 10 °C 5 min lang vorsichtig. Sammeln Sie die Partikel durch Zentrifugieren bei 0,2 x g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand.
- Behandeln Sie die Partikel mit Methanol, um die Bildung von β-Blättern zu fördern und eine starke physikalische Adsorption der Seidenschicht zu gewährleisten. Fügen Sie 1 ml 100%iges Methanol hinzu. Schütteln Sie die Partikel auf dem Thermomischer bei 750 U/min für 10 min bei 10 °C vorsichtig.
- Sammeln Sie die Partikel durch Zentrifugieren bei 0,2 x g für 1 min bei 4 °C und waschen Sie sie jedes Mal zweimal mit 1 ml DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser, wobei Sie den Überstand verwerfen und vor der nächsten Zentrifugation vorsichtig wirbeln.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.8 20 Mal, um mehrschichtige Kern-Schale-Strukturen aus Seide zu erhalten. Für den letzten Abscheidungsschritt verwenden Sie fluoreszenzmarkierte Seide aus Schritt 3.4 (Silk-DyLight550, 1 ml).
- Führen Sie den letzten Waschschritt durch und bewahren Sie die Mikropartikel in 1 ml DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser bei Umgebungsbedingungen auf.
Anmerkungen: Um eine Aggregation von Partikeln während der Abscheidung von Seidenschichten zu vermeiden, führen Sie eine Sichtprüfung der Partikelsuspension durch und pipettieren Sie sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf und ab, um eine homogene Partikelverteilung zu fördern. - Berechnen Sie die Anzahl der DNA-Plasmidkopien, die in jeder Mikrokapsel eingekapselt sind, N-DNA mit Gleichung 1:
(1)
Wobei N = 6,769 × 1011 - die Anzahl der SiO2-Kerne, die für die Kapselung verwendet werden. Berechnen Sie sie anhand einer Standardkurve für bekannte Konzentrationen von Siliziumdioxidpartikeln unter Verwendung von Verdünnungsreihen und Absorption A 320 bei λ =320 nm;
C- Anfangskonzentration der DNA, die für die Adsorption verwendet wird
V- das DNA-Volumen, das für die Adsorption verwendet wird
0,8- DNA-Adsorptionseffizienz auf den Kernen
Mw- Molekulargewicht des DNA-Plasmids
NA- Avogadro-Zahl (6.022 × 1023)
(1)5. Auflösung der Kerne zur Gewinnung von Seidenmikrokapseln.
- Bereiten Sie eine 8%ige Flusssäure (HF)-Lösung mit einem pH-Wert von 5,5 vor, indem Sie die Stammlösung (48%) mit destilliertem Wasser verdünnen. Besorge dir ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig 5 ml HF und fügen Sie 25 ml destilliertes Wasser hinzu, um eine 8%ige HF-Lösung zu erhalten.
VORSICHT: HF ist eine stark ätzende Säure und kann schwere Verbrennungen im Gewebe verursachen. Bei der Handhabung und Verwendung von HF für die Experimente ist äußerste Vorsicht geboten. Halten Sie sich an die Standardarbeitsanweisungen (SOP) für die ordnungsgemäße Verwendung und Handhabung von HF, die von der Organisation entwickelt wurden, um unerwünschte Unfälle durch Verschütten zu vermeiden. Verwenden Sie keine Glasbehälter, um HF-Säure zu verdünnen. Verwenden Sie die chemische Haube, um diesen Schritt des Protokolls durchzuführen. - Lösen Sie SiO-2-Kerne auf, indem Sie 1,5 ml 8%ige HF-Lösung zu pelletierten Kern-Schale-Mikropartikeln aus Schritt 4.10 hinzufügen. Sanft wirbeln und lassen Sie die Kerne über Nacht bei Umgebungsbedingungen mit leichtem Schütteln bei 450 U/min auflösen.
Anmerkungen: Um das Verschütten von HF zu vermeiden, verwenden Sie Pfropfband, um das Mikrozentrifugenröhrchen zu versiegeln. Verwenden Sie eine chemische Haube, um diesen Schritt des Protokolls durchzuführen. - Bereiten Sie einen 2-Liter-Glasbecher vor, der mit 2 l deionisiertem Wasser gefüllt ist. Übertragen Sie die Mikrokapsellösung in Dialysegeräte (50 kDa MWCO) und dialysieren Sie sie gegen deionisiertes Wasser mit einem wiederholten Wasserwechsel alle 3 Stunden für die nächsten 3 Tage.
Anmerkungen: Sammeln Sie den Überstand während der ersten drei Wasserwechsel und entsorgen Sie die Lösung gemäß dem festgelegten Protokoll für gefährliche Abfälle. - Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um die Suspension von Dialysegeräten in neue 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, um die Mikrokapseln zu sammeln.
Anmerkungen: Lagern Sie die wässrigen Lösungen von Mikrokapseln mehrere Jahre bei Raumbedingungen.
6. Bildgebung von Seidenfibroin-Mikrokapseln mit konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM).
- Führen Sie eine DNA-Färbung mit einem DNA-Farbstoff durch.
- Übertragen Sie 300 μl hohle Seidenfibroin-Mikrokapseln in ein frisches 1-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 500 μl RNase/DNase-freies destilliertes Wasser hinzu.
- 5 μL des DNA-Färbefarbstoffs zugeben, kurz vortexieren und bei RT 2 h lichtgeschützt inkubieren.
- Führen Sie vier Waschschritte durch, indem Sie bei 0,1 x g für jeweils 20 Minuten bei 4 °C zentrifugieren, wobei vorsichtig 400 μl des Überstands entfernt und mit 400 μl RNase/DNase-freiem destilliertem Wasser aufgefüllt werden.
- Führen Sie die Abbildung von Seidenkapseln auf invertierten konfokalen Systemen durch, die mit drei Hauptlasern (405 nm, 488 nm, 561 nm) ausgestattet sind, und verwenden Sie ein 100-faches Ölimmersionsobjektiv (NA 1,49). Übertragen Sie 100 μl der Kapselprobe in eine einzige Vertiefung mit 8-Well-Objektträgern, lassen Sie die Kapseln vor der Bildgebung 20-30 Minuten sedimentieren.
HINWEIS: Farbstoffe reagieren sehr empfindlich auf Photobleiche. Schützen Sie die Proben, indem Sie die Objektträger mit Alufolie abdecken.
7. Abschätzung der Permeabilität von Mikrohohlkapseln mittels Molekulargewichts-Cut-off-Methode (MWCO).
- Bereiten Sie jeweils 2 ml FITC-markierte Dextran-Fluorophorlösungen (20 μM, diH 2O) unterschiedlicher Mw (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa,250kDa, 500 kDa und 2 MDa) vor.
- Pipettieren Sie 100 μl der Kapselsuspension in eine einzelne Vertiefung eines Objektträgers aus Kammerglas. Analysieren Sie jedes Mikrokapseldesign (Konzentration von PEI, Anzahl der DNA-Plasmide, Konzentration von Seidenfibroin und Anzahl der Schichten) separat.
- Fügen Sie jeder Vertiefung 300 μl der spezifischen Fluorophorlösung hinzu, beginnend mit dem niedrigsten Mw bis zum höchsten, so dass jede Vertiefung der spezifischen Fluorophorlösung entspricht. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren und lassen Sie die Mischung 1 h bei RT inkubieren, bis die Diffusion der Fluorophorlösungen ein Gleichgewicht erreicht.
- Übertragen Sie den Objektträger in ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) und bilden Sie jede Vertiefung mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv bei Anregung λ = 488 nm ab.
- Identifizieren Sie den interessierenden Bereich, indem Sie die Fokusebene anpassen, um sicherzustellen, dass die Kapseln in Form von Kreisen mit dem größten Durchmesser erscheinen. Dies geschieht in der Regel, wenn die Proben näher am Boden des Bohrlochs betrachtet werden, wenn Kapseln aufgrund der Schwerkraft sedimentieren.
- Sammeln Sie mehrere Bilder von Mikrokapselproben, indem Sie den Objektträger in XY-Richtung bewegen. Nehmen Sie Bilder auf, um bis zu 100-150 Kapseln pro Probe zu berücksichtigen.
- Verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Permeabilität der Kapselmembran in jeder MW-Fluorophorlösung zu analysieren, indem Siedie Fluoreszenzintensitäten innerhalb und außerhalb der Kapseln vergleichen. Zeichnen Sie dazu eine Region of Interest (ROI) in Form eines Kreises, um den Umfang der Kapsel zu umreißen, und klicken Sie auf Analysieren/Messen , um die Fluoreszenzintensität im Inneren zu messen. Tabellieren Sie die Daten in einer Tabelle. Führen Sie diesen Vorgang für jede Mikrokapsel für insgesamt 200-300 Kapseln durch.
- Beurteilen Sie die äußere Fluoreszenzintensität auf die gleiche Weise, indem Sie den ROI skizzieren und die Intensität außerhalb der Kapseln messen. Führen Sie 3-5 Messungen für die statistische Analyse durch.
- Um eine statistische Analyse durchzuführen, vergleichen Sie die Fluoreszenzintensitäten innerhalb und außerhalb der Kapseln mit einem gepaarten t-Test (p < 0,05).
- Verwenden Sie die Umrechnungstabelle 2 , um die Permeabilität von Mikrokapseln basierend auf den hydrodynamischen Radien für FITC-Dextran mit der Variablen Mw abzuschätzen.
8. In-vitro-Aktivierung von synthetischem Theophyllin-Riboswitch in Seidenmikrokapseln
- Bereiten Sie 1 ml Theophyllin-Stammlösung (100 mM, DMSO) vor. Bereiten Sie das E. coli S30-Extraktsystem für zirkuläre DNA vor, indem Sie die Komponenten 40 Minuten lang auf Eis auftauen.
- Besorgen Sie sich ein 0,5-ml-DNase/RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie eine In-vitro-Transkriptions- /Translationsreaktion durch, kombinieren Sie die zellfreien Komponenten mit einer Probe von Mikrokapseln in der folgenden Reihenfolge (50 μl Gesamtvolumen): S30-Vormischung ohne Aminosäuren (20 μl); S30-Extrakt, kreisförmig (15 μL); vollständige Aminosäuremischung (5 μL); hohle Mikrokapseln mit ThyRS-GFPa1-Plasmiden aus Schritt 4.10 (9 μL); und Theophyllin, 100 mM DMSO (1 μL).
Anmerkungen: Nachdem Sie alle Komponenten hinzugefügt haben, wirbeln Sie das Röhrchen kurz vor und sammeln Sie die Probe während einer kurzen Zentrifugation bei 0,2 × g für einige Sekunden. - Inkubieren Sie das Röhrchen bei 30 °C für 4 h und überprüfen Sie die Fluoreszenz an einem Plattenleser mit Anregung bei λ = 488 nm und Emission für GFP/FITC-Filter (510 nm ± 20 nm).
- Bebilden Sie die Kapseln auf einem beliebigen LCSM-System mit 488-nm- und 561-nm-Lasern. Erzielen Sie Bilder in bester Qualität mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv und 8-Well-Objektträgern.
9. In-vitro-Aktivierung von Brokkoli-Aptamer in Seiden-Mikrokapseln
- Bereiten Sie 1 ml Stammlösung des Farbstoffs DFHBI-1T (30 μM, diH2O) vor. Bereiten Sie das zellfreie Systemreaktionskit PURE (Proteinsynthese mit rekombinanten Elementen) vor, indem Sie die Komponenten 40 Minuten lang auf Eis auftauen.
- Besorgen Sie sich ein 0,5-ml-DNase/RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen. Durchführung einer In-vitro-Transkriptionsreaktion durch Kombination zellfreier Reaktionskomponenten mit einer Probe von Mikrokapseln in der folgenden Reihenfolge (50 μl Gesamtvolumen): Lösung A (20 μl); Lösung B (15 μL); hohle Mikrokapseln mit BrocApt-Plasmiden aus Schritt 4.10 (14 μL); und DFHBI-1T-Farbstoff (1 μL).
Anmerkungen: Nachdem Sie alle Komponenten hinzugefügt haben, wirbeln Sie das Röhrchen kurz vor und sammeln Sie die Probe während einer kurzen Zentrifugation bei 0,2 × g für einige Sekunden. - Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 6 h und überprüfen Sie die Fluoreszenz an einem Plattenleser mit Anregung bei λex = 470 nm und Emission bei λem = 510 nm ± 20 nm.
- Bebilden Sie die Kapseln auf einem beliebigen LCSM-System mit 488-nm- und 561-nm-Lasern. Erzielen Sie Bilder in bester Qualität mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv und 8-Well-Objektträgern mit Deckglas.
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Representative Results
Hier befasst sich die Studie mit der Funktionalität von DNA-Templates, die nach der Verkapselung in Seidenproteinkapseln für verschiedene Sensordesigns (zwei Arten von RNA-regulierten Transkriptions-/Translationselementen) kodieren. Mikrokapseln wurden durch Schicht-für-Schicht-Montage (LbL) der Schlüsselkomponenten hergestellt: Eine Hauptschicht, DNA-Plasmide, die für Sensordesigns kodieren, und Seidenfibroin-Biopolymer (Abbildung 2). Die schichtweise Abscheidung von Makromolekülen ermöglicht es, die Permeabilität der Kapselmembran auf der Grundlage inter- und intramolekularer Wechselwirkungen zwischen den absorbierten Schichten und der Dicke der Hülle zu steuern. Die einstellbare Permeabilität des Systems bot das Potential, die Diffusion essentieller Moleküle zu kontrollieren und gleichzeitig die Diffusion großer unerwünschter Makromoleküle durch die Kapselmembran20 zu begrenzen.
Homogene (4,5 μm) und robuste Seidenfibroin-Mikrokapseln mit einer Schalendicke von ~500 nm (20 Schichten) in hydratisiertem Zustand können bei korrekter Befolgung des Protokolls hergestellt werden (Abbildung 3)21. Der LbL-Ansatz ermöglichte es, die Beladungskapazität von DNA-Templates basierend auf der Anfangskonzentration der Plasmide abzustimmen. Die optimale DNA-Beladung kann erreicht werden, indem die Anfangskonzentration der DNA-Templates von 50-200 ng/μL variiert wird. Tabelle 1 zeigt die Anzahl der DNA-Kopien, die nach Abschluss der LbL-Verkapselung in einer einzigen Mikrokapsel zurückgehalten werden, und wurde für jedes Sensordesign auf der Grundlage der anfänglichen DNA-Konzentrationen und Mw der DNA-Plasmide gemäß Gleichung 1 berechnet. Die optimale DNA-Beladungskapazität wurde mit 32 bzw. 20 DNA-Kopien für ThyRS- bzw. BrocApt-Sensordesigns erreicht. Die Bewertung der Beladungskapazität war wichtig, um eine genaue Abschätzung der verkapselten DNA-Konzentrationen zu erhalten, um sie während der IVTT-Aktivierung der Sensoren durch Zugabe von konzentrierteren Kapselproben titrieren zu können.
Die Permeabilität der Kapselhüllen kann mit der MWCO-Methode systematisch analysiert werden. Die Methode schätzt die Porengröße der Membran anhand des Molekulargewichts von gelösten Molekülen, die die Kapselmembran nicht durchdringen konnten. Durch die Beauftragung von Mikrokapseln mit variablen Mw-Fluorophormolekülen und die Durchführung einer konfokalen Bildgebung in der Fokusebene, die dem größten Durchmesser über mehrere Kapseln hinweg entspricht, kann die Permeabilität der Schalenmembranen beurteilt werden. Die ImageJ-Analyse ermöglicht es, die Fluoreszenzintensitäten innerhalb und außerhalb der Kapseln abzuschätzen und vollständig permeable (äußere und innere Fluorophorintensitäten waren vergleichbar), teilweise permeable (50%-70% der Kapseln hatten eine geringere Fluoreszenz innen im Vergleich zu außen) und nicht permeable (die interne Fluorophorintensität war im Vergleich zur äußeren Intensität geringer) zu identifizieren (Abbildung 4). Die Umrechnung von Mw in den hydrodynamischen Radius für jeden Fluorophor ermöglicht die Abschätzung der Maschenweite der Kapselmembran (Tabelle 2).
Die selektive Permeabilität von Proteinkapseln kann während der systematischen Optimierung des LbL-Abscheidungsprotokolls erreicht werden, indem variable Konzentrationen einer Hauptschicht (von 0-6 mg/ml), die Konzentration eines Seidenfibroins (von 0,5-2 mg/ml) und die Anzahl der abgeschiedenen Schichten (von 10-25) verwendet werden, bis eine optimale Permeabilität erreicht ist. In diesem Protokoll wurde eine optimale Permeabilität zwischen 25-32 nm mit 6 mg/ml PEI als Hauptschicht und 20 Schichten von 1 mg/ml Seidenfibroin, die während der LbL-Assemblierung abgeschieden wurden, erreicht (Abbildung 4). Dieser Permeabilitätsbereich war ideal, damit die Komponenten des IVTT-Systems durch die Kapselhülle sickern konnten. Typischerweise sind die größten molekularen Komplexe eines IVTT-Systems prokaryotische ribosomale Einheiten, 30S und 50S, die, wenn sie von mRNA in einem ribosomalen Komplex gebunden werden, eine Größevon bis zu ~20 nm erreichen können 22. Die Struktur der entwickelten Mikrokapselhüllen ähnelt einem hochgradig verflochtenen Netzwerk von Seidenfaserschichten, die durch β-Blatt-Blöcke, die bei der LbL-Assemblierung entstehen, physikalisch vernetzt sind. Diese Membranstruktur ist semipermeabel: hochpermeabel für kleine Moleküle (z. B. Ionen, Aminosäuren, Peptide, Zucker usw.) und auf große Moleküle (z. B. Proteine mit hohem Molekulargewicht, Glykoproteine, Zellen usw.) beschränkt, die nur die Perkolation von Molekülen mit einem hydrodynamischen Radius von weniger als 25 nm ermöglicht. Daher können Seidenfibroin-Mikrokapseln mit optimaler DNA-Beladung und Membranpermeabilität als Bioreaktorträger für die IVTT-Aktivierung verwendet werden.
Die transkriptionelle und translationale Aktivität von ThyRS- und BrocApt-Designsensoren kann mit kommerziell erhältlichen IVTT-Systemen getestet werden. ThyRS erfordert eine translationale Aktivierung des Reportergens in Gegenwart des Theophyllin-Liganden. Die Aktivierung von synthetischem ThyRS umfasst mehrere Schritte, um die Genexpression zu initiieren, darunter die mRNA-Synthese, die Konformationsänderung der mRNA-Sequenz bei der Bindung an den Analyten, die Freisetzung der Ribosomenbindungsstelle und die Synthese des Reporterproteins GFPa1. Alle diese Schritte erfordern eine freie Diffusion der IVTT-Komponenten durch die Kapselmembran. Das vorgeschlagene Design von DNA-beladenen Seidenfibroin-Mikrokapseln verbesserte die Aktivierungsparameter von RNA-regulierten Sensordesigns: Sowohl die Expressionskinetik als auch die Fluoreszenzausbeute waren im Vergleich zur freien, nicht immobilisierten DNA signifikant höher (Abbildung 5A). Die CLSM-Bildgebung bestätigte auch die erfolgreiche Aktivierung des GFPa1-Gens in Kapseln, die mit DNA-Plasmiden beladen waren, die für ThyRS-Sequenzen kodieren (Abbildung 5B-D).
Alternativ wurde die Aktivierung des BrocApt-Sensordesigns im IVTT-System durchgeführt, das die T7 E. coli-Promotor-gekoppelte Transkription/Translation in Gegenwart des DHFBI-1T-Farbstoffs unterstützt . Die Fluoreszenzausbeute wurde durch die Bindung des fluorogenen Farbstoffs an die mRNA-Sequenz initiiert. Wichtig ist, dass das Ausgangssignal von Seidenmikrokapseln im Vergleich zu nicht verkapselten DNA-Proben mit äquivalenten Konzentrationen um ein Vielfaches höher war (Abbildung 6). Daher können Seidenfibroin-Mikrokapseln die wesentliche Funktionalität von DNA-kodierten Sensorelementen beibehalten, was für die Entwicklung neuartiger In-vitro-Biosensorplattformen für den schnellen und empfindlichen Nachweis von Analyten von Interesse wichtig sein kann.
Abbildung 1: Plasmidkarte und Sequenz von pSALv-RS-GFPa1 . (A) Das Plasmid enthält eine Theophyllin-Riboswitch-Sequenz (ThyRS), die stromaufwärts des GFPa1-kodierenden Gens unter der Kontrolle des PTAC-Promotors platziert ist, β-Lactamase (bla) kodierendes Gen, das für die Resistenz gegen Ampicillin verantwortlich ist. (B) Die Ptac-Promotorsequenz ist fett und unterstrichen dargestellt; Die Sequenz des Theophyllin-Riboschalters ist fett und kursiv dargestellt. Die GFPa1-Codierungssequenz ist fett gedruckt. Die Sequenzen der Restriktionsstellen sind unterstrichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Überblick über die Herstellung von Mikrokapseln mit dem Layer-by-Layer-Ansatz. UnberührteSiO2-Kerne wurden zunächst mit PEI-Polymer funktionalisiert, gefolgt von der sequentiellen Abscheidung von DNA-Plasmiden, die für verschiedene Sensordesigns und Seidenfibroinschichten kodieren, bis die gewünschte Anzahl von Seidenproteinschichten adsorbiert wurde. Hohle, makellose Mikrokapseln, die verschiedene DNA-Sensordesigns enthalten, können durch das Auflösen von Opferkernen hergestellt werden. Die Aktivierung jedes in der Mikrokapsel verkapselten Biosensordesigns kann während IVTT-Reaktionen in Gegenwart entsprechender Liganden erreicht werden. Diese Abbildung ist ein Nachdruck von Drachuk, I. et al.21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Mikroskopische Untersuchungen an DNA-beladenen Mikrokapseln . (A) 2D-Querschnitts- und (B) konfokale 3D-Mikroskopiebilder von hohlen (SF)20-Mikrokapseln , die mit DNA-Plasmiden, die für ThyRS kodieren (32 DNA-Kopien/Kapsel), beladen sind und aus 6 mg/ml PEI-grundiertenSiO2-Kernen hergestellt wurden. Autofluoreszenz aus Seidenfibroinkapseln (DAPI-Kanal, blau) und gefärbter DNA (FITC-Kanal, grün) wurde angewendet, um die Lokalisation von DNA-Plasmiden zu identifizieren und die Dicke der Kapselmembran abzuschätzen. Der Einsatz in (A) stellt Intensitätsprofile für DNA- und Seidenfibroinhüllen in der gesamten Kapsel dar. Maßstabsleiste: 2 μm. Der Einsatz in (B) stellt das Intensitätsprofil für Seidenprotein in der Kapselhülle dar. Die Membrandicke wurde als Länge bei halber Intensitätsspitze gemessen. Die Verarbeitung der Querschnittsbilder und das 3D-Rendering wurden mit der Bildgebungssoftware NIS auf dem Nikon C2+ System durchgeführt. Diese Abbildung ist ein Nachdruck von Drachuk, I. et al.21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Abschätzung der Membranpermeabilität für Seidenmikrokapseln mit der MWCO-Methode. Selektive CLSM-repräsentative Fluoreszenzbilder von hohlen Seidenfibroin-Mikrokapseln, die FITC-Dextran-Lösungen verschiedener Mw (20 μM, diH2O) ausgesetzt wurden. Die Kapseln wurden mit einer unterschiedlichen Anzahl von Schichten und PEI-Konzentrationen hergestellt. Eine Erhöhung der Konzentration einer Hauptschicht führt zu einer erhöhten kolloidalen Stabilität von Mikrokapseln mit durchlässigeren Schalen, während die Eliminierung der Hauptschicht eine Aggregation von Kapseln mit weniger durchlässigen Schalenmembranen verursacht. Maßstabsleiste: 5 μm. Diese Abbildung ist ein Nachdruck von Drachuk, I. et al.21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Aktivierung des ThyRS-Sensordesigns in Seidenfibroin-Mikrokapseln. (A) Kinetik für die GFPa1-Expression während der ThyRS-Aktivierung von DNA-Plasmiden, die in 20-lagige SF-Mikrokapseln geladen wurden (rot gefärbte Linien) und Kontroll-nicht-verkapselte DNA (blau gefärbte Linien). Die DNA-Konzentrationen in einem Probenvolumen (50 μL) betrugen von oben nach unten 6,5 ng/μL, 4,5 ng/μL, 2,5 ng/μL und 0 ng/μL und entsprechen den Änderungen der Farbintensitäten. (B) CLSM-Bilder von Seidenfibroin-Kapseln, die mit 32 DNA-Kopien pro Kapsel beladen sind. Maßstabsleiste: 5 μm. (C) Das Bild entspricht den Querschnittsintensitätsprofilen, die dem Bild (B) entsprechen, über zwei Kapseln (weiße Linie in B). Die rote Linie steht für Seidenkapseln und die grüne Linie für GFPa1, das in Kapseln exprimiert wird. (D) Das Bild zeigt gerenderte 3D-Seidenkapseln, die nach der Inkubation im IVTT-System mit 32 DNA-Kopien beladen sind. Grüne Fluoreszenz entspricht dem GFPa1-Signal und rote Fluoreszenz fluoreszenzmarkierten Seidenschichten. Maßstabsleiste: 2 μm. Die ThyRS-Aktivierung erfolgte mit Theophyllin (2 mM, DMSO) während der Inkubation von Mikrokapseln im IVTT-System (S30-Extrakt). Diese Abbildung ist ein Nachdruck von Drachuk, I. et al.21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Aktivierung von BroccApt in Seidenfibroin-Mikrokapseln. Der Vergleich der Transkriptionskinetik wurde für 20-lagige Seidenmikrokapseln mit 30 DNA-Kopien pro Kapsel (rote Linien) und nicht verkapselte Kontroll-DNA (blaue Linien) durchgeführt. Von oben nach unten betrugen die Konzentrationen der verkapselten DNA in einer Probe: 3,6 ng/μl, 2 ng/μl, 1 ng/μl und 0 ng/μl und entsprechen den Änderungen der Farbintensitäten. Die Konzentrationen der nicht verkapselten DNA betrugen: 20 ng/μL, 10 ng/μL, 5 ng/μL und 0 ng/μL und entsprechen den Änderungen der Farbintensitäten. Die Aktivierung erfolgte mit DHBFI-1T (100 μM, diH2O) während der Inkubation im zellfreien PURE-System. Diese Abbildung ist ein Nachdruck von Drachuk, I. et al.21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Design des DNA-Sensors | Anfängliche DNA-Konzentration (ng/μl) | Anzahl der DNA-Kopien pro Kapsel (DNA/Kapsel) |
| 50 | 16 | |
| ThyRS | 100 | 32 |
| 150 | 48 | |
| 200 | 64 | |
| 50 | 10 | |
| BrocApt | 100 | 20 |
| 150 | 30 | |
| 200 | 40 |
Tabelle 1: DNA-Kopienzahl pro Kapsel für jedes DNA-Design. Die Kopienzahl wurde nach Gleichung 1 berechnet und mit der Anfangskonzentration der DNA-Plasmide, der Retentionsaffinität der DNA-Sequenzen während des LbL-Abscheidungsprozesses und der Länge der DNA-Plasmide korreliert.
| Mw von FITC-Dextran (kDa) | Hydrodynamischer Radius (nm) |
| 4 | 1.4 |
| 20 | 3.3 |
| 40 | 4.5 |
| 70 | 6 |
| 150 | 8.5 |
| 250 | 10 |
| 500 | 14 |
| 2,000 | 18 |
Tabelle 2: Physikalische Eigenschaften von FITC-dextrans. Der hydrodynamische Radius für jeden Fluorophor wurde verwendet, um die Permeabilität von hohlen Seidenfibroin-Mikrokapseln abzuschätzen.
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Discussion
Selektiv permeable Hydrogel-Mikrokapseln, die mit verschiedenen Arten von DNA-kodierten Sensordesigns beladen sind, können nach diesem Protokoll hergestellt werden. Eine der Besonderheiten des LbL-Ansatzes ist die Fähigkeit, die Komplexität von Mikrokapseln während der Bottom-up-Assemblierung maßzuschneidern, die in der Regel mit der Adsorption molekularer Spezies an Opfervorlagen beginnt. Durch sorgfältige Anpassung der Konzentrationen der Ausgangskomponenten, der pH-Bedingungen und der Anzahl der Schichten können Mikrokapseln mit unterschiedlichen DNA-Beladungsparametern, Funktionalität und einstellbarer Permeabilität hergestellt werden23. Um die Vielseitigkeit der Kapseln zu erhöhen, kann eine weitere Funktionalisierung der Schalenoberfläche mit AuNPs und IgG erreicht werden, um biokompatible Sensorträger für die in vivo Diagnostik zu implementieren. Beide alternativen Wege beruhen auf der einzigartigen molekularen Struktur des Seidenfibroins. Die In-situ-Reduktion von Au3+ -Ionen kann aufgrund des Vorhandenseins von Tyrosinresten (5,3 Mol.-%) erreicht werden, die in der Lage sind, Metallionen in Gegenwart eines optimalen Reduktionspuffers zu reduzieren. Die Konjugation spezifischer Antikörper an die Oberfläche von AuNPs-funktionalisierten Proteinmikrokapseln kann durch die Implementierung der Carbodiimid-Aktivierungschemie erfolgen. Beide Schritte erfordern eine sorgfältige Entwicklung und Optimierung des Protokolls, um die einwandfreie Funktionalität der Biosensorkapseln für zukünftige Anwendungen zu erreichen. Um diese Mikrokapseln beispielsweise als "intelligente" Verabreichungssysteme zu verwenden, bei denen eine molekulare Fracht auf bestimmte Reize (wie pH-Wert oder chemische Hinweise) abgegeben wird, sollten spezifische Eigenschaften dieser Kapseln charakterisiert und abgestimmt werden, einschließlich der Verabreichungseffizienz, der Verweilzeit, des Verabreichungswegs und der Behandlung von Krankheitsmodellen.
Die DNA-beladenen Mikrokapseln wurden mit Hilfe der CLSM-Technik und Fluoreszenzmessungen charakterisiert. Andere Charakterisierungsmethoden wie Rasterkraftmikroskopie (AFM), kryogene Elektronentomographie (CEM) und direkte stochastische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) können jedoch angewendet werden, um spezifische Strukturen der Mikrokapseln zu differenzieren, einschließlich einzelner Fasern, Nanodomänen und Lokalisierung von DNA-Plasmiden24,25,26.
Das entwickelte Protokoll unterstreicht die Verwendung von Seidenfibroin-Biopolymer als biokompatibles Netzwerkmaterial, das die Tertiärstruktur von beladenen DNA-Plasmiden bewahrt. Die Stabilität immobilisierter DNA-Sequenzen innerhalb des Seidenfibroin-Netzwerks erfolgt durch hydrophobe Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrückenbindungen, die eine schützende Mikroumgebung gegen pH-Inaktivierung, Oxidation oder Hydrolyse bieten27. Darüber hinaus bieten die β-kristallinen Domänen von Seidenfibroin eine einzigartige mechanische Barriere, die die Bewegung eingeschlossener Makromoleküle einschränkt und den Abbau von DNA-Plasmiden während der Lagerung in wässrigen Lösungen verhindert.
Die semipermeable Beschaffenheit von Seidenfibroin-Mikrokapseln, die mit DNA-Matrizen beladen sind, schuf einzigartige räumliche und physikalisch-chemische Bedingungen für die IVTT-Reaktionen. Transkriptionell und translational aktivierte RNA-Aptamer und Riboswitch, die in Seidenfibroin-Mikrokapseln immobilisiert wurden, waren in der Lage, ein mindestens dreimal höheres Ausgangssignal im Vergleich zu freien, nicht immobilisierten Sensoren zu erzeugen. Darüber hinaus kann die Immobilisierung von DNA-Templates in Mikrokapseln die Aktivität von verkapselten Sensoren über die Nachweisgrenze von nicht verkapselten Sensoren hinaus deutlich erhöhen. Während nicht verkapselte Sensoren bei niedrigen DNA-Konzentrationen eine minimale Reaktion aufwiesen, hatten die verkapselten Sensoren eine sehr ausgeprägte Ausgangsantwort, die leicht titriert werden kann, um die subtilen Änderungen der DNA-Konzentrationen widerzuspiegeln. Das verbesserte Antwortsignal der verkapselten Reporter war wahrscheinlich auf die uneingeschränkte Diffusion der Komponenten der IVTT-Maschinerie und die reduzierte Mobilität der DNA-Plasmide zurückzuführen. Mehrere Studien haben erkannt, dass die Ausbeute der Proteinsynthese in zellfreien Reaktionen von der makromolekularen Umgebung abhängt28,29. Die Immobilisierung von DNA-Plasmiden in ein Seidennetzwerk bot eine effektive begrenzte Umgebung, die die Bewegung der Oligonukleotide einschränkte und die Reaktionen der Transkriptions-/Translationsmechanismen selbst von mehreren DNA-Kopien beschleunigte21.
Während die LbL-Methode einen sehr vielseitigen Ansatz bietet, um multifunktionale Baugruppen auf kontrollierbare Weise zu konstruieren, ist das Herstellungsverfahren relativ zeitaufwändig und erfordert in der Regel Verarbeitungsanpassungen, um die Ausbeute der Mikrokapseln zu erhöhen. Eine weitere Überlegung bei der Herstellung von Mikrokapseln auf Basis von Biomolekülen ist die Kompatibilität eines bestimmten Systems mit der Anforderung der Kernauflösung nach Abschluss der LbL-Abscheidung. Um homogene und robuste DNA-beladene Mikrokapseln auf Hohlseidenbasis herzustellen, wurden die Schalen bisher auf Opferkieselsäurekernen (SiO 2) abgeschieden, die anschließend durch Flusssäure (HF)-Ätzen entfernt werden mussten. Auch das HF-Handling oder das Ätzen gelten nicht als biokompatible Verfahren, was ihre breite Anwendung in praktischen Anwendungen einschränkt. Als Alternative zu anorganischen kolloidalen SiO2-Templaten sind Karbonatkerne typischerweise inert in der Bildung von Komplexen mit Polymerschichten und können unter milden Bedingungen unter Verwendung von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gelöst werden. Die Anpassung der Opferkerne kann jedoch die Abscheidungseigenschaften von Multischichten und die Integrität der Schalenstruktur beeinträchtigen, was eine weitere Optimierung des Protokolls erfordert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das aktuelle Protokoll die Herstellung von seidenbasierten DNA-beladenen Mikrokapseln mit unterschiedlichen Sensordesigns ermöglicht. Die Kombination aus einer begrenzten Mikroumgebung, die durch die LbL-Methode bereitgestellt wird, und der Verwendung von Seidenfibroin als biokompatibles Material verbesserte die Sensoreigenschaften der verkapselten DNA. Mit der rasanten Entwicklung der fluorogenen RNA-Aptamer-Technologie kann der potenzielle Einsatz von DNA-beladenen Seidenmikrokapseln auf Multiplex-In-vitro-Diagnostika ausgeweitet werden. In jüngster Zeit haben sich mehrere Variationen von RNA-basierten Fluoreszenz-Aptameren als leistungsstarke hintergrundfreie Technologie für die Bildgebung von RNA in lebenden Zellen mit hoher Signal-Rausch-Empfindlichkeit herauskristallisiert30,31. Durch die Anwendung synthetischer RNA-Nanotechnologie zur Entwicklung künstlicher RNA-Aptamere können die fluorogenen Eigenschaften von Aptameren genutzt werden, um spezifische Liganden von Interesse zu detektieren. Diese Technologie wird besonders wertvoll sein, um Biomarker von Interesse in verschiedenen Formaten zu überwachen, darunter papierbasierte Point-of-Use-Sensoren, Hydrogel-basierte Pflaster für Schweiß oder interstitielle Flüssigkeit und implantierbare Materialien.
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Disclosures
Die hier dargestellten Ansichten und Meinungen sind die der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die Ansichten des DoD oder seiner Komponenten
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das LRIR 16RH3003J-Stipendium des Air Force Office of Scientific Research sowie durch das Programm Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) des U.S. Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering unterstützt.
Die Plasmidvektorsequenz für ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) wurde großzügigerweise von Dr. J. Gallivan zur Verfügung gestellt. Seidenraupenkokons von Bombyx mori wurden großzügig von Dr. D.L. Kaplan von der Tufts University, MA, gespendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO? silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na?CO? | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
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