Summary
该协议描述了如何从根尖或基底外侧感染人肠道类器官,以使用单细胞RNA测序(scRNAseq)技术在单细胞水平上表征宿主/病原体相互作用。
Abstract
人类肠道类器官是研究胃肠道病原体感染的最佳细胞模型。这些类器官可以来自胃肠道的所有部分(胃,空肠,十二指肠,回肠,结肠,直肠),并且在分化时,含有在每个单独部分自然发现的大多数细胞类型。例如,肠道类器官含有吸收营养的小肠细胞、分泌细胞(杯状细胞、Paneth 和肠内分泌)、干细胞以及所有谱系特异性分化中间体(例如,早期或未成熟的细胞类型)。使用胃肠道衍生类器官研究传染病的最大优点是可以精确地识别肠道病原体靶向的细胞类型,并解决胃肠道的不同部分及其特定细胞类型是否对病原体挑战做出类似的反应。在过去的几年中,胃肠道模型以及其他组织的类器官已被用于研究病毒的向性和发病机制。然而,在使用高致病性病毒时利用类器官的所有优点是一项技术挑战,需要严格的生物安全考虑。此外,由于类器官通常在三维空间中生长,细胞的基底外侧面向类器官的外部,而其顶端侧面向类器官的内部(管腔)。这种组织对肠道病原体构成了挑战,因为许多肠道感染在摄入后从细胞的顶端/腔侧开始。以下手稿将提供一个全面的方案,通过考虑感染侧(顶端与基底外侧)来进行单细胞RNA测序以表征细胞类型特异性宿主/病原体相互作用,从而为人类肠道类器官的肠道病原体感染做准备。该方法详细介绍了类器官的制备以及在生物安全3级(BSL-3)遏制条件下进行这项工作所需的考虑因素。
Introduction
由于缺乏主要的人类细胞模型,研究细胞类型特异性向性和细胞类型特异性对人类肠道病毒的免疫反应历来具有挑战性。随着类器官1的发展,这种限制现在已经部分根除。在胃肠道的情况下,已经为人类和其他几种物种(例如,小鼠,牛,猫,蝙蝠)开发了胃和肠类器官模型2,3,4,5,6。 肠道类器官再现了人类肠上皮的结构结构,并含有隐窝和绒毛样结构,功能性肠谱系,甚至已用于鉴定以前未知的细胞谱系。可以使用两种不同的方法来生长肠道类器官。首先,从组织切除或活检中分离出含有隐窝的肠干细胞,并在特定的培养条件(例如,Wnt3A,R-spondin,Noggin和EGF)下生长以扩增,然后将干细胞分化为大多数肠道细胞谱系(例如,肠细胞,Paneth细胞,杯状细胞,肠内分泌细胞)7。该方法允许从胃肠道的所有部分(例如,胃,十二指肠,空肠,回肠和结肠)中分离出类器官。第二种方法依赖于人诱导的多能或胚胎干细胞,然后逐步分化成肠上皮细胞8。与患者衍生的类器官相比,这些诱导的基于干细胞的类器官通常被描述为更具胚胎性。虽然所有这些类器官模型对于解开形成肠道所需的发育线索至关重要,但它们在传染病研究中的使用仍处于起步阶段。
肠道病毒是一个涵盖所有通过胃肠道感染的病毒的广泛术语,例如小核糖核酸病毒(例如,EV-71),呼肠病毒(例如轮状病毒)和杯状病毒(例如诺如病毒)9。肠道病毒通过摄入受污染的食物和水来启动其传染性生命周期,由于未经处理的废物排放到环境中以及在感染发作后缺乏医疗护理,使发展中国家的人们处于高风险10。根据病原体的类型,感染可导致肠胃炎、呕吐和/或肠内膜渗漏引起的水样腹泻。人类诺如病毒是一种高度流行和传染性强的肠道病原体,导致全球超过6亿人感染和1500万人住院治疗11。类器官一直是诺如病毒研究的关键,因为它们支持人类诺如病毒的感染和复制,而人类诺如病毒以前无法在标准细胞培养模型12中培养。
在过去的二十年中,冠状病毒已成为人类的主要病原体13。该家族包括高致病性MERS、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2,在对这些病毒进行研究时需要严格的安全级别控制。有趣的是,虽然这三种病原体大多因其诱发的呼吸道症状和窘迫而得到认可,但现在很明显,这些病毒不仅感染呼吸道,还感染其他器官。除了呼吸窘迫之外,在SARS-CoV-2感染患者中诱发的一个重要病理是存在胃肠道症状14。一小部分SARS-CoV-2感染患者表现出这种症状,从非常轻微到严重的腹泻不等。此外,SARS-CoV-2基因组可以在感染患者的粪便和胃肠道活检中检测到15。重要的是,胃肠道症状的存在不仅限于SARS-CoV-2,因为在MERS和SARS-CoV-1感染患者中也观察到了这些症状。为了了解SARS-CoV-2如何诱导胃肠道不适并精确识别SARS-CoV-2在胃肠道中的倾向性,人类肠道类器官一直是一种关键工具,现在被用来揭示细胞类型对这种病原体的特定反应16,17。
在评估永生化细胞系和类器官的病原体感染时,细胞群的转录谱分析(批量RNA测序)一直是标准做法。虽然这使我们能够确定对病原体的反应的全局变化(例如,细胞因子的上调),但批量RNAseq不允许我们确定为什么群体中的特定细胞比其他细胞更容易感染。单细胞RNA测序(scRNAseq)已成为解开细胞谱系特异性转录程序的强大工具,可用于确定这些程序如何支持或抑制病毒感染18,19。scRNAseq的第一次描述是在2009年,用于评估在小鼠卵裂球20中发现的不同细胞的转录谱。这些技术现在已经扩展,可以通过几个不同的平台实现。该技术的早期版本应用荧光激活细胞分选器(FACS)分离单个细胞进行测序,通常仅限于96或384孔板,从而为每个样品提供300个单独的细胞进行分析21。这些方法现在已经通过单细胞测序平台得到了发展,该平台使用微流体装置将单细胞封装成含有条形码的珠子的单个液滴。该技术允许在每个样品条件下捕获多达10,000个细胞。
将类器官技术与scRNAseq相结合,使我们能够研究肠道病原体如何以细胞类型特异性方式影响胃肠道。然而,需要考虑若干技术和生物安全问题。首先,经典的类器官培养方法(3D)类器官,嵌入细胞外基质(ECM)中)将上皮细胞的基底外侧暴露在类器官的外部。当肠道病原体通过摄入受污染的食物/水来引发感染时,感染最常从细胞的顶端开始,而这些3D肠道类器官是无法进入的。因此,需要准备类器官,以使通过2D接种使病原体感染的顶端一侧易于接近,从而直接暴露细胞的顶端侧,或通过显微注射22,23。其次,要对受感染的生物样本进行scRNAseq,重要的是要考虑它们的传染性。虽然已经提出了在单细胞分离之前固定细胞和灭活病原体以进行后续RNAseq的方法,但这些方法通常会导致测序质量下降18。下面的方案将描述几种考虑感染侧(顶端与基底外侧感染)用肠道病毒感染肠道类器官的方法(图1)。此外,该协议将包括一个工作流程,用于从感染了高致病性病毒的类器官中解离和分离单个细胞,用于scRNAseq。该协议将强调在生物安全3级(BSL-3)遏制条件下工作时需要实施的关键步骤,以避免产生气溶胶和潜在的污染。
Protocol
从海德堡大学医院的结肠切除术或回肠活检中接受人体组织,用于以下方案。这项研究是在海德堡大学医院的建议下进行的,根据《赫尔辛基宣言》,所有受试者都得到了知情的书面同意。所有样本均以匿名方式接收和维护。该协议由海德堡大学医院伦理委员会根据协议S-443 / 2017批准。
1. 肠道和结肠类器官的维持和传代
注意:人类肠道类器官来源于人体组织或诱导多能/胚胎干细胞,因此需要伦理批准。需要遵守特定国家/地区的法规。人体材料通常未经测试,因此通常被认为是BSL-2材料。需要在实验进行国确认适当的收容条件。
- 使用前面描述的方法2从分离的组织和/或活检中制备肠道和结肠类器官。此外,有关如何从患者来源的材料或iPSCs制备类器官的更多技术细节可以在Lees等人和Mahe等人24,25中找到。
- 一旦建立了类器官培养,请遵循以下描述的分裂常规,以制备类器官以进行肠道病原体感染。
- 在24孔非组织培养处理的板中将20-100个类器官接种在50μL100%ECM溶液中。每孔加入500μL生长培养基(表1)。
- 每2天更换一次培养基,取出250μL旧培养基,向每个孔中加入250μL新鲜培养基。在更换介质之前,将介质加热到室温。
注意:冷介质会使含有类器官的 ECM 溶液液化。 - 当内部由于死细胞的积累而开始变暗时,每周排出一次类器官。这方面的一个例子可以在 图2中找到。
- 在分裂当天,从-20°C取出ECM溶液并在冰上解冻。
- 放置新的空细胞培养板,该培养板将在37°C下分裂后用于接种类器官(这需要至少1小时才能变暖并且可以加热过夜)。将培养基加热至室温。
- 用P1000移液管除去生长培养基,并向每个孔中加入500μL冷1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)3分钟,以部分液化ECM溶液并从板中解离。
- 为确保完全破坏 ECM 溶液,请使用 P1000 移液器(设置为 450 μL)。上下移液 10 次以重悬 PBS、ECM 溶液和类器官,将重悬的类器官转移到 15 mL 锥形管中,并将它们放在冰上。
- 将相同类器官的多个孔收集到同一锥形管中。
- 如果同时分裂多种不同的类器官(不同的供体,不同的切片,不同的预处理等),请将它们收集在不同的锥形管中。收集时,将锥形管保持在冰上。
- 在4°C下以500×g旋转样品5分钟。 用移液器小心地取出PBS,以保持底部的类器官沉淀。
- 避免使用带有移液器的真空废物系统,因为类器官的颗粒非常松散,并且在太快去除PBS时很容易被吸入。
- 向锥形管中加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶,并用 P1000 移液器上下移液 10 次,重悬类器官。将含有类器官的锥形管在37°C孵育3分钟。
- 加入 2 mL 含有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F12 培养基,以停止消化,并通过用 P1000 移液器上下移液 10 次来重悬以破坏类器官。
- 在4°C下以500×g旋转样品5分钟。 从离心机中取出锥形管并将其储存在冰上。
- 用5 mL一次性移液管小心地除去培养基/胰蛋白酶,以保持底部的类器官沉淀。留出约500μL培养基,并用P1000移液器将其取出。
- 一旦从所有锥形管中取出培养基/胰蛋白酶,从37°C培养箱中取出24孔非细胞培养处理的板并将其置于细胞培养罩下。
- 根据个体供体类器官的生长习性,将100%ECM溶液(保持在冰上)加入锥形管中,以1:3至1:5的比例将分裂的类器官。(例如,如果在50μL滴ECM溶液中通过一个含有20-100个类器官的孔,则将类器官沉淀重悬到150-250μL冰冷的ECM溶液中。
- 接种50μLECM溶液/类器官混合物每孔24孔非细胞培养处理板,预热至37°C。
注意:ECM溶液一旦变暖,就会很快聚合。使用过程中始终保持ECM溶液冷藏(储存在冰上)。当类器官重悬后,立即在新板上播种。对于初学者,建议将一盒移液器吸头存放在-20°C,以留出额外的播种时间。 - 将24孔板在37°C下孵育10-15分钟,以使ECM溶液聚合。
- 聚合后,向每个孔中加入500μL生长培养基(表1)26,并在37°C下孵育类器官。 每天通过显微镜检查类器官。每 2 天更换一次介质,如步骤 1.4 所示。
2. 二维(2D)类器官的制备
注意:以下方案将描述如何将肠道类器官作为细胞的单层接种在细胞培养板中,以从其顶端感染肠上皮细胞。使用48孔板进行测序实验,使用8孔玻璃底室载玻片使用免疫荧光方法控制感染。
- 生长和维持类器官,如第1节所述。
- 在2D中接种类器官之前,在37°C下用200μL2.5%人胶原蛋白在每孔水中涂覆48孔板和8孔玻璃底载玻片1小时。
注意:肠道类器官最好接种在48孔板和8孔玻璃底室载玻片中。经验表明,它们在96孔板中感染不良。Transwell插入片也可用于2D的顶端和基底外侧感染。如果使用透气孔,请在感染前监测经上皮电阻 (TEER) 以确认汇合单层。通常,肠道类器官具有紧密的屏障,TEER为450-600 Ohm / cm2。 - 在48孔板的每个孔中播种100-150个类器官,或为8孔玻璃底室载玻片的一个孔接种。
- 为了估计类器官的数量,计算在第1节中制备的24孔板的50μLECM溶液滴中存在的类器官的数量。平均而言,需要1-2个孔,这将产生大约15,000-30,000个细胞。
- 要破坏ECM溶液并使类器官胰蛋白酶消化,请遵循步骤1.8-1.17。
- 从48孔板和8孔玻璃底腔载玻片中去除人胶原蛋白。
- 将类器官沉淀重悬于锥形管中,加入250μL生长培养基/孔中,并将混合物加入胶原包衣孔中。将板置于37°C培养箱中。
注意:在进行实验时,比较多种条件(模拟 与 感染的+/-治疗感兴趣)。为了最大限度地减少每个2D种子类器官孔之间的变异性,在同一锥形管中收集必要类器官的总数。从多达 12 孔的 24 孔板中收集类器官,可以使用 1 mL 胰蛋白酶和 2 mL 中和培养基。当使用12-24孔时,将其增加到2mL胰蛋白酶和4mL中和培养基。 - 48小时后,从培养箱中取出板并将其置于细胞培养罩中。除去生长培养基并用每孔250μL分化培养基代替它(表1)。48 小时后重复此介质更换操作。
- 48小时后,通过提取RNA,用250ng RNA制作cDNA,并使用干细胞(OLFM4和/或SMOC2),杯状细胞(MUC2),肠内分泌细胞(CHGA)和肠细胞(SI和/或CYP3A4)的引物进行SYBR绿色qPCR来确认分化(切换到分化培养基后四天)(图3)。
注意:从生长培养基切换到分化培养基后,类器官会降低干细胞标志物(OLFM4和/或SMOC2)的表达,并通过qPCR增加杯状细胞(MUC2),肠内分泌细胞(CHGA)和肠细胞(SI和/或CYP3A4)标记物的表达。准备额外的孔并用生长培养基维持,以比较生长培养基中每个细胞类型特异性标记物的表达水平 与 分化培养基。 - 在确认分化后,类器官已准备好进行顶端感染。将类器官移动到所选病原体所需的生物安全水平收容。
注意:在BSL-2或BSL-3遏制下处理病原体时,请参阅研究所的当地法规和标准操作程序。 - 为了从其顶端感染2D生长的肠道类器官,用P1000移液管除去培养基,并在分化培养基中加入以实验所需的感染多重性稀释的病原体(病原体/培养基混合物的最小体积为每孔50μL,最大体积为每孔250μL)。
- 允许感染在37°C下进行2小时,使用位于细胞培养箱中的摇臂台或每15-20分钟手动摇动板。根据所选的病原体优化此时间。
- 2小时后,用P1000移液器取出培养基,并用每孔250μL新鲜分化培养基替换。将细胞在37°C孵育至单细胞测序的时间点。
- 要制备用于单细胞测序的细胞,请继续执行第4部分。
3. 制备用于顶端和基底外侧感染的三维(3D)类器官
- 如第1节所述,在24孔,非细胞培养处理的平板中生长类器官。
- 传代后两天,从培养箱中取出板并放入细胞培养罩中。
- 用P1000移液器除去生长培养基,用预热至室温的500μL/孔分化培养基代替,并将板置于37°C培养箱中。
- 48小时后,用新鲜的分化培养基(500μL/孔)代替。
注意:在感染前,类器官在分化培养基中维持总共4天。 - 确认步骤 2.9 中所述的区分。
- 在确认已发生分化后,类器官已准备好接受感染。
- 在冰上解冻ECM。将分化培养基加热至室温,并在37°C下加热24孔板。
- 要进行感染,请从ECM溶液中取出类器官。
注意:尽可能多地去除 ECM 溶液,因为病毒更喜欢粘附在 ECM 溶液而不是细胞上。如果类器官周围残留的ECM溶液过多,则感染性将受到严重影响。 - 通过加入500μL冷1x PBS并孵育3分钟来破坏ECM。使用 P1000 上下移液 10 倍。将类器官混合在管中,以500×g离心5分钟。使用 P1000 卸下 PBS。
注意:为了最大限度地减少每种感染条件之间的差异,将来自24孔板的几个孔的类器官组合到同一个锥形管中。例如,如果需要八个感染条件,则24孔板(每个包含约100个类器官)的八个孔将被合并,随后在针头破坏后分成新的24孔板的八个孔(见步骤3.12)。 - 将类器官重悬于 1 mL 分化培养基中。对于根尖和基底外侧感染,请遵循步骤 3.10.1,对于基底外侧感染,仅遵循步骤 3.10.2。
- 将27 G针头连接到1 mL注射器上,并将沉淀重悬六次,以允许类器官的破坏并在顶端和基底外侧发生感染。继续执行步骤 3.11。
注意:在针头断裂之前观察到时,类器官应该是经典的囊肿外观和章鱼芽状类器官,中心为深色。在破坏之后,这些类器官将显得更小,内部更少甚至没有黑暗。在进行感染时,总是会有至少两种情况(模拟和感染),24孔板的至少两个孔最初将组合成15 mL锥形管以进行基于针头的破坏(解释为什么至少使用1 mL用于重悬)。当进行两个以上的条件时,将多达10个孔的24孔板组合在单个15 mL锥形管中,并重悬于1 mL分化培养基中以进行针头破坏。中断后,每n + 1加入500μL分化培养基(例如,如果使用10孔,则用4.5mL充注以获得5.5 mL总量)。如果需要10个以上的条件,请使用几个锥形管。建议使用1 mL注射器,因为注射器的这个体积会更好地破坏类器官。注射器的替代方法是使用扁平的P1000尖端。 - 将类器官重悬于每孔500μL分化培养基中。注意不要破坏类器官,并确保顶端一侧不可触及。继续执行步骤 3.11。
- 将27 G针头连接到1 mL注射器上,并将沉淀重悬六次,以允许类器官的破坏并在顶端和基底外侧发生感染。继续执行步骤 3.11。
- 使用P1000移液器将每孔500μL类器官悬浮液转移到24孔细胞培养板中,并将板移动到所选病原体所需的生物安全水平。
注意:在BSL-2或BSL-3遏制下处理病原体时,请参阅当地法规和研究所的标准操作程序。始终对BSL-3外的类器官进行针头破坏,以避免针头发生潜在事故。当地法规也可能阻止在BSL-3中使用针头。 - 加入在分化培养基中稀释的病原体,以达到实验所需的感染多重性。不要超过500μL的总体积(在24孔板中总共有1mL)。
- 允许感染在37°C下进行2小时(此时需要适应所选的病原体),使用位于细胞培养箱中的摇床台或每15-20分钟手动摇动板。
- 在2小时孵育后,将类器官收集到每个条件下的1.5mL管中,并在4°C下以500×g旋转5分钟。
- 用P1000移液器移出含有病原体的培养基,并将其储存在冰上。用PBS洗涤一次类器官沉淀。
- 将类器官重悬于50μL的100%ECM溶液(先前在冰上解冻)中,板放入预热至37°C的24孔非细胞培养处理板中,并将24孔板在37°C下孵育10-15分钟,以使ECM溶液聚合。
- 聚合后,在室温下向每个孔中加入500μL分化培养基,并在37°C下孵育,直到收获以进行单细胞测序。
注意:如果接种后需要收获超过48小时,请每2天更换一次培养基,方法是取出旧培养基并用500μL新鲜分化培养基代替。然而,经验表明,由于类器官是在分化培养基下生长的,因此它们的存活时间不会超过48小时。
4. 在生物安全3级(BSL-3)条件下制备单细胞溶液和凝胶微珠(GEMs)
注意:完成以下步骤需要单细胞测序设备(材料表)和能够处理100μL反应的PCR机存在于BSL-3设施内。类器官如第1节所述生长,并按照第2-3节所述感染,具体取决于病原体和进入途径。在感染后预先确定的时间,收获类器官。下面描述了用于收获肠道类器官的方法。
- 在收获受感染的类器官之前,从-80°C取出单细胞凝胶珠(材料表),并升温至室温(至少提前30分钟)。
- 此外,将RT试剂,还原剂B和RT酶C(全部储存在-20°C)平衡至室温。重悬模板开关寡核苷酸,如制造商的说明中所述。
注:根据所考虑的病原体的既定标准操作程序,需要根据当地生物安全法规执行以下步骤。作为BSL-3工作的经验法则,必须确保对离开细胞培养罩的所有容器(板,管等)的外部进行适当消毒。这同样适用于进行实验的人的手/手套。 - 要对在2D中播种的类器官进行感染(第2节),请继续执行步骤4.4。要对3D类器官进行感染(第3节),请转到第4.5节。
- 对于2D类器官感染,将细胞培养板带入罩中,并用P1000移液管除去分化培养基。
- 向每个孔中加入250μL室温下的1x PBS。
- 用P1000移液器除去PBS,并向48孔板的每个孔中加入250μL室温解离酶(例如TrypLE Express)。换手套,清洁板,并将带有解离酶的板放入37°C培养箱中。
- 每5分钟通过显微镜观察细胞解离。
注意:大约需要15分钟才能将2D培养的肠道类器官解离成单细胞。这个时间需要调整,因为它将取决于最初播种和感染的类器官数量以及病原体,因为一些病原体更具细胞敏感性,并导致类器官比其他器官更快地解离。 - 在确认明显的单细胞悬浮液后,将板带回细胞培养罩,并通过在48孔板的每孔中加入250μL含有10%FBS的DMEM / F12培养基来停止消化。
- 使用P1000移液器将细胞收集到15mL锥形管中。
- 换手套,清洁试管,并在4°C下以500×g旋转样品5分钟。
- 用P1000小心地除去培养基/解离酶,以保持细胞沉淀在底部。将单个细胞重悬于含有0.1%BSA的最小体积PBS中。对于肠道类器官,对于48孔板的每个孔,重悬于250μL中。
- 将细胞悬浮液通过过滤器进入FACS管中,以除去任何大团块并将含有细胞的FACS管放在冰上。
- 继续执行步骤4.6,继续细胞计数和预混液的制备。
- 对于3D类器官的感染,从培养箱中取出板并将其置于细胞培养罩中。
- 用P1000移液器从24孔板的每个孔中除去分化介质。向每个孔中加入500μL冰冷的1x PBS,并在冰上孵育3分钟。
- 为确保ECM溶液完全中断,请使用P1000移液器(设置为450μL)。上下移液10次,重悬PBS,ECM溶液和类器官;将重悬的类器官转移到15 mL锥形管中并置于冰上。将每种感染情况收集在其自己的15 mL锥形管中。
注意:使用15 mL锥形管比50 mL锥形管或1.5 mL管具有更好,更独特的细胞沉淀。 - 换上手套,将管子从细胞培养罩中取出。清洁管子的外部。
- 在4°C下以500×g旋转样品5分钟。
- 将管子移回细胞培养罩,并用P1000移液器取出PBS,以避免从管底部重悬类器官沉淀。
- 将沉淀重悬于1mL解离酶(例如,TrypLE Express)中。换手套,清洁试管,并将样品在37°C孵育。
- 每10分钟持续30分钟,将管子移回细胞培养罩中,并通过用P1000移液器上下移液10次来重悬类器官。
注意:通常,肠道类器官在3D感染时需要大约30分钟才能形成单个细胞悬浮液。 - 为了确定何时将类器官解离到单个细胞,使用p10移液管取10μL类器官悬浮液。
- 将悬浮液置于一次性塑料细胞计数器载玻片中。用透明胶带密封样品输入端口。
- 换上手套,清洁细胞计数器的外部。使用明场显微镜确定是否制造了单细胞悬浮液。
- 确认单细胞悬浮液后,通过加入1mL含有10%FBS的DMEM / F12培养基并用P1000移液器上下移液10次来停止消化。
- 换手套,清洁试管,并在4°C下以500×g旋转样品5分钟。
- 用P1000移液器小心地除去培养基/解离酶,以避免从管底部重用细胞沉淀。
- 将单个细胞重悬于含有0.1%BSA的最小体积PBS中。对于肠道类器官,重悬于250μL中。
- 将细胞悬浮液通过过滤器进入FACS管中,以除去任何大团块并将含有细胞的FACS管放在冰上。
- 继续执行步骤4.6,继续细胞计数和预混液的制备。
- 通过将10μL细胞悬浮液加入一次性塑料细胞计数室来确定每μL的细胞数。
- 在从细胞培养罩中取出样品之前,用透明胶带密封样品输入端口,因为在此阶段,细胞悬浮液仍然具有传染性。
- 换手套,清洁细胞计数室,并使用明场显微镜计数细胞数。
- 在细胞培养罩内,根据制造商的说明,根据实验中的样品数量,在1.5 mL管中制备RT试剂,模板开关寡核苷酸,还原剂B和RT酶C的预混液。对于每个样品,将33.4μL预混液等分到PCR管中并储存在冰上。
- 按照制造商的说明中所述,根据目标细胞编号将细胞和水添加到预混液中。
注意:通常回收50%-60%的细胞(即,在芯片上加载10,000个细胞时,使用5,000-6,000个细胞进行分析)。因此,请始终加载 10,000 个电池。如果细胞密度不允许这样做,则离心细胞并以较低的体积重悬。注意不要使芯片过载,因为这会导致芯片堵塞。此外,如果细胞未正确解离,则每个磁珠获得多个细胞的风险将增加,这需要在下游生物信息学处理中去除。 - 更换手套,将单细胞控制器移入细胞培养罩,并准备芯片,因为芯片仅覆盖有未密封的垫圈。
注意:机器需要位于罩内,以防止暴露于受感染的细胞悬浮液和潜在的气溶胶。 - 将单细胞芯片添加到芯片支架中,并用50%甘油填充未使用的通道。
- 按照制造商的说明,将预混液、珠子和隔油添加到用于样品的通道中。
- 用垫圈盖住芯片,将芯片加载到控制器中,然后启动程序。
注意:建议仅加载八个通道中的六个。乳液不当的问题经常发生在1号和8号车道上。该公司表示,所有车道都是独立的,这不应该发生;但是,如果可能的话,避免使用这两个通道,如果需要八个样本,请运行两个芯片。 - 程序完成后,取出芯片和垫圈。
- 使用多通道移液器并将100μL乳液转移到干净的PCR管中。确保每个孔都有均匀的白色,表明已经发生了完整的乳液。
- 换手套,清洁试管,然后将PCR试管转移到可以支持100μL反应的PCR机上。运行程序:53°C 45分钟;85°C 5分钟。
- 完成后,将样品储存在4°C。 此时,按照制造商的说明处理反应或在4°C下储存3天或-20°C储存1周。
- 在85°C下5分钟后,大多数包膜病毒将被灭活,根据正常操作程序从BSL-3中除去cDNA,并在BSL-1实验室中进行文库制备。
注意:该实验需要作为三个生物学重复(例如,在三个不同的日期)进行,因为每个实验之间每种细胞类型的分化程度可能略有不同。生成的测序文库可以在一次测序运行中以不同的方式进行索引和测序。
Representative Results
用于单细胞测序的类器官的制备
单细胞测序结果高度依赖于使用优质细胞。为了确保类器官质量良好,应每天正确维护和观察它们,以确定它们何时准备好被分裂(图2)。分裂类器官的时间取决于供体;一些捐赠者生长得更快,需要每5天分开一次,而另一些则较慢,需要每10天分开一次。平均而言,当中心变暗时,类器官每周分裂一次(图2B)。如果允许类器官变得太大并在中心积累太多的死细胞,类器官就会死亡。
类器官保持在含有大量Wnt3A的培养基中。这支持干细胞生态位并促进类器官继续生长和增殖。在这些生长条件下,类器官含有大量的干细胞和过境扩增细胞以及较低数量的分化细胞群,如成熟肠细胞,杯状细胞和肠内分泌细胞。然而,为了模仿人类肠道内的细胞复杂性,重要的是推动细胞分化并产生更多的这些细胞。这是通过改变介质条件和去除Wnt3A,并减少R-Spondin和Noggin来实现的(表1)。通常,细胞分化为肠细胞,杯状细胞和肠内分泌细胞需要4天的分化培养基(图3)。获得良好的差异化是关键;否则,评估病原体向性和细胞类型特异性反应将变得困难。
确认BSL-3病原体失活
必须使用所选病原体确认完全灭活,并验证从BSL-3中去除cDNA是安全的。对于SARS-CoV-2,通过取100μLSARS-CoV-2并将其在PCR机器中在85°C下孵育5分钟来验证病毒的完全灭活。 然后将病毒重新添加到幼稚的Vero细胞中,并在感染后24小时,48小时和72小时通过免疫荧光和斑块测定将病毒感染与非热处理病毒进行比较,以确保所有颗粒不再具有传染性。这些结果被发送到当地监管机构,并在他们批准后进行单细胞实验和cDNA处理。
单细胞测序结果
为了评估SARS-CoV-2如何感染人结肠和回肠类器官,进行了单细胞测序。如上所述制备类器官并以2D格式感染,以允许SARS-CoV-2的顶端感染。在感染后12小时和24小时收获受感染的细胞,并如上所述进行单细胞测序。对单细胞测序数据的分析使我们能够确定只有人类肠上皮细胞的亚群(未成熟的肠细胞2)支持SARS-CoV-2的感染(图4)。此外,由于并非群体中的所有细胞都被感染,因此对受感染的细胞和未感染的旁观者细胞都进行了分析(图5)。这些结果表明,SARS-CoV-2在受感染的细胞中诱导了促炎信号级联反应,而未感染的旁观者细胞显示出干扰素介导的免疫反应。此外,scRNA-Seq表明,由于病毒介导的途径阻塞,受感染的细胞无法感知干扰素(图5)。使用批量RNA测序时无法获得此信息。
图1:示意图描述了制备人类肠道类器官以感染肠道病原体的三种不同方法。 根尖感染可以通过在2D中播种肠道类器官来实现。顶端和基底外侧感染可以通过破坏3D类器官来进行。最后,仅基底外侧感染可以通过感染完整的3D肠道类器官来进行。这些方法中的每一种都可用于生成用于单细胞测序的样品。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2:类器官维持示意图和代表性明场图像(A)人体肠道类器官的维持和传代示意图。分裂后第1天、第3天、第5天和第7天的代表性明场图像。到第7天,由于死细胞的积累,类器官变得又大又暗,并准备被分裂。比例尺表示 25 μm。请点击此处查看此图的放大版本。
图3:切换到分化培养基后4天人肠道类器官的代表性qPCR。 将肠道类器官维持在生长培养基中或切换到分化培养基4天。收获RNA并对干细胞(OLFM4),Paneth细胞(LYZ),杯状细胞(MUC2)和肠细胞(SI)的标记物进行qPCR。N = 5。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4:识别被SARS-CoV-2感染的细胞群。 人结肠和回肠衍生的类器官感染了SARS-CoV-2。在感染后12小时和24小时后,收获细胞并进行单细胞RNA测序,以确定哪些细胞群支持SARS-CoV-2感染。发现病毒感染随时间增加,主要感染未成熟的肠细胞2。这个数字是从Triana等人修改而来的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5:内在先天免疫应答的测定。人结肠衍生的类器官感染了SARS-CoV-2。在感染后12小时和24小时后,收获细胞并进行单细胞RNA测序,以确定病毒感染和未感染旁观者细胞的内在先天免疫应答。SARS-CoV-2感染细胞表现出强烈的促炎反应,而未感染的旁观者细胞表现出干扰素介导的反应。图修改自Triana等人19。请点击此处查看此图的放大版本。
成长媒体 | |
复合 | 最终浓度 |
广告 DMEM/F12 | 谷氨酸麦克斯 (1X) |
+谷氨酸 | 1 mM 肝素 |
+嘿嘿嘿 | 笔 10 U/mL |
+P/S | 链球菌 10 微克/毫升 |
L-沃恩 | 50% (体积) |
抗氧化剂 B27 | 01:50 |
N-乙酰半胱氨酸 | 1 毫米 |
断续器 | 50 纳克/毫升 |
A83-01 | 500 毫安 |
胰岛素样肽-1 | 100 纳克/毫升 |
FGF 基本 | 50 纳克/毫升 |
胃泌素 | 10 毫米 |
差异化培养基 | |
复合 | 最终浓度 |
广告 DMEM/F12 | 谷氨酸麦克斯 (1x) |
+谷氨酸 | 1 mM 肝素 |
+嘿嘿嘿 | 笔 10 U/mL |
+P/S | 链球菌 10 微克/毫升 |
抗氧化剂 B27 | 01:50 |
N-乙酰半胱氨酸 | 1 毫米 |
R-spondin | 5% (体积) |
诺金 | 50 纳克/毫升 |
断续器 | 50 纳克/毫升 |
胃泌素 | 10 毫米 |
A83-01 | 500 毫安 |
表1:用于生长和分化培养基的培养基组成。
Discussion
肠道病原体通常通过从面向肠腔的顶端感染肠上皮细胞来启动其生命周期。虽然类器官被广泛认为是重现肠道上皮细胞复杂性和组织的良好模型,但它们的组织为三维封闭结构,使其顶端膜无法被病原体接触。该协议描述了从其顶端,基底外侧或两者用BLS-3病原体感染肠道类器官的方法。这些方案可以很容易地适应研究BSL-2或BLS-3收容或任何其他类器官模型下的任何肠道病原体,方法是遵循下面强调的几个关键步骤。上述方法根据德国法规用于单细胞液滴的分离和制备。作为免责声明,本议定书不描述在BSL-3条件下工作时需要采取的生物安全处理措施(标准操作程序)。同样重要的是要坚持其他国家/地区的法规可能会有所不同,并且必须与地方当局联系,以确保所有当地法规都得到尊重。
在二维中播种根尖感染类器官的关键步骤之一是控制细胞与作为经典三维类器官生长时相似的分化。根据肠道病原体的不同,向性可能仅限于非常罕见的细胞或需要高度分化的细胞。在这种情况下,使用未完全分化的二维类器官可能导致这种肠道病原体不能感染肠道类器官的错误结论。如果可能的话,建议使用该协议的三种配置进行感染:仅用于根尖感染的2D类器官(第2节),用于根尖和基底外侧感染的裂开式3D类器官(第3节),以及仅用于基底外侧感染的全3D类器官(第3节)。这种方法将有助于辨别病原体的进入途径(根尖 与 基底外侧),并且还将控制已达到相似的分化水平。2D顶端感染的替代方法是显微注射,它将使用3D类器官,但将病原体直接输送到顶端(详见Bartfeld等人27)。 这种方法需要熟练的注射器来确保病原体被正确放置,并且类器官保持完整。显微注射通常用于BSL-2密封,可能不适合BSL-3密封。
在2D接种类器官中进行感染实验时,另一个重要的考虑因素是最终的细胞密度。如步骤2.3所述,将100-150个类器官接种在48孔板的一个孔或8孔玻璃底室载玻片的一个孔中。根据类器官线和处理类器官的人,这些类器官的大小可能会有很大不同。这可能导致48孔板或8孔玻璃底室载玻片中的细胞密度非常不同。根据肠道病毒的不同,一些病毒更喜欢更稀疏的细胞,而另一些病毒也能够感染汇合细胞。不同细胞汇合的这种感染性差异的分子起源尚不清楚;因此,在进行进一步的下游表征之前,应进行旨在为所选肠道病原体找到最佳细胞密度的试验实验。
通常,FACS分选是在执行单细胞液滴乳液之前进行的。该步骤通常用于将死细胞与活细胞分开,将单细胞与二倍体分开。当使用BSL-3病原体时,它要求设施配备适当的FACS分选机,这种情况并不常见。此外,并非类器官中的所有细胞都具有相同的大小,并且通常很难区分双体或较大的细胞,从而导致对特定细胞类型进行负选择的风险。此外,该领域仍在讨论,每个样本在5,000-10,000之间分选所需的时间是否可能导致单个细胞的转录本谱的重大修改。虽然已经描述了与单细胞测序(例如甲醇和RNAAssist)相容的细胞固定方法,但观察到这导致测序质量下降18。最后,人们怀疑使用细胞死亡标记物对细胞进行分类也会导致偏倚。鉴于细胞通过隐窝 - 绒毛轴的定向增殖和分化,将要脱落和释放的大多数分化的细胞位于绒毛的尖端。这些细胞通常对细胞死亡途径的不同标志物(例如,细胞凋亡, 坏死和坏死性)呈阳性;然而,当观察小鼠肠道的轮状病毒感染时,绒毛的尖端是感染最严重的区域28。因此,过滤掉可能看起来呈死亡标志物阳性的细胞将导致可能代表生理感染的受感染细胞的阴性选择。目前,在单细胞测序之前,没有很好的解决方案可以分选和固定类器官。建议使用活的,未分类的细胞,因为需要进一步的研究来找到合适的替代方案。
单细胞测序彻底改变了评估细胞反应的方式。该技术允许在基础条件和病原体感染下鉴定细胞谱系特异性反应。这种方法在以前受到批量读数限制的许多领域打开了大门。虽然这种方法非常强大,但它有其局限性。一个关键的局限性是测序下游所需的广泛生物信息学分析。在分析组织和分配当前没有注释的细胞类型时,这一点尤其重要。需要有熟练的生物信息学家来支持所有单细胞研究。
该协议描述了如何播种和处理人类肠道类器官,用肠道病原体感染它们,并执行scRNAseq。现在有可能将这种方法应用于其他器官,因为大多数器官已经开发了类器官模型系统。与肠道类器官相比,肺和肝脏类器官的组织方式相似,因此,使用类似的方法可以转移到这些类器官上。关键控制将是验证当在二维空间中生长或裂开时,这些类器官实现与3D类器官对应物相似的分化。定义分化状态的特定特征和基因对于每个器官模型都是特定的。其他类器官模型,如肾脏和血管类器官,大致密结构,将需要额外的方法来连续地将这些结构解离成单细胞。
Disclosures
作者声明没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
Megan Stanifer和Steeve Boulant得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)的研究资助:(项目编号240245660,278001972,415089553和272983813到Steeve Boulant,416072091到Megan Stanifer),巴登 - 符腾堡州和联邦卫生部für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B到MS和01KI20198A和(NUM-COVID 19,Organo-Strat 01KX2021)到SB。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |
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