Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التحديد العالمي لشبكات التفاعل الانتقالي المشترك عن طريق التنميط الريبوسومي الانتقائي

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62878
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

تلعب التفاعلات الانتقالية المشتركة دورا حاسما في تعديلات السلسلة الوليدة واستهداف مسارات الطي والتجميع. هنا ، نصف التنميط الريبوسومي الانتقائي ، وهي طريقة للتحليل المباشر لهذه التفاعلات في الجسم الحي في نموذج حقيقيات النوى Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

في السنوات الأخيرة ، أصبح من الواضح أن الريبوسومات لا تقوم فقط بفك تشفير الحمض النووي الريبي المرسال لدينا ولكن أيضا توجه ظهور سلسلة الببتيد المتعدد في البيئة الخلوية المزدحمة. توفر الريبوسومات منصة للربط الذي يتم التحكم فيه مكانيا وحركيا لعوامل استهداف الأغشية ، وتعديل الإنزيمات ، والمرافقين القابلة للطي. حتى التجميع في مجمعات قليلة الجودة عالية الترتيب ، وكذلك خطوات تكوين شبكة البروتين والبروتين ، تم اكتشافه مؤخرا ليتم تنسيقه مع التوليف.

هنا ، نصف التنميط الريبوسومي الانتقائي ، وهي طريقة تم تطويرها لالتقاط التفاعلات الانتقالية المشتركة في الجسم الحي. سنقوم بتفصيل مختلف خطوات تنقية التقارب المطلوبة لالتقاط مجمعات سلسلة الريبوسوم الوليدة جنبا إلى جنب مع التفاعلات الانتقالية المشتركة ، بالإضافة إلى استخراج الحمض النووي الريبي المرسال ، واستبعاد الحجم ، والنسخ العكسي ، والتسلسل العميق ، وخطوات تحليل البيانات الضخمة ، المطلوبة لفك رموز التفاعلات الانتقالية المشتركة بدقة قريبة من الكودون.

Introduction

Selective Ribosome Profiling (SeRP) هي الطريقة الوحيدة ، حتى الآن ، التي تلتقط وتميز التفاعلات الانتقالية المشتركة ، في الجسم الحي ، بطريقة مباشرة1،2،3،4،5،6. يتيح SeRP التنميط العالمي للتفاعلات لأي عامل مع ترجمة الريبوسومات بدقة قريبة من الكودون 2,7.

تعتمد هذه الطريقة على التجميد المفاجئ للخلايا المتنامية والحفاظ على الترجمة النشطة. ثم يتم التعامل مع محللات الخلايا باستخدام RNase I لهضم كل الحمض النووي الريبوزي المرسال في الخلية باستثناء شظايا الحمض النووي الريبوسومي المحمية من الريبوسوم والتي تسمى "آثار أقدام الريبوسوم". ثم تنقسم العينة إلى قسمين. يستخدم جزء واحد مباشرة لعزل جميع آثار أقدام الريبوسوم الخلوية ، مما يمثل جميع الترجمة المستمرة في الخلية. يستخدم الجزء الثاني لتنقية التقارب لمجموعة فرعية محددة من الريبوسومات المرتبطة بعامل ذي أهمية ، على سبيل المثال: تعديل الإنزيمات ، وعوامل النقل ، والمرافقين القابلة للطي ، وتفاعلات التجميع المعقدة. يطلق على آثار الأقدام الريبوسومية المنقاة بالتقارب اسم interactome. بعد ذلك ، يتم استخراج mRNAs المحمية من الريبوسوم واستخدامها لتوليد مكتبة cDNA ، تليها تسلسل عميق.

يسمح التحليل المقارن لإجمالي عينات translatome و interactome بتحديد جميع orfs التي ترتبط بعامل الاهتمام ، بالإضافة إلى توصيف كل ملف تعريف تفاعل orf. يقدم هذا الملف الشخصي تقارير عن بداية الاشتباك الدقيقة وتسلسلات الإنهاء التي يمكن للمرء من خلالها استنتاج الكودونات التي تم فك تشفيرها والمخلفات ذات الصلة من سلسلة polypeptide الناشئة ، وكذلك على اختلافات سرعة الريبوسوم أثناء التفاعل 7,8. ويصور الشكل 1 البروتوكول على أنه مخطط.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول SeRP. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول بالكامل في غضون 7-10 أيام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليد سلالات لتنميط الريبوسوم الانتقائي

ملاحظة: Selective Ribosome Profiling (SeRP) هي طريقة تعتمد على تنقية التقارب لعوامل الاهتمام ، لتقييم طريقة تفاعلها مع مجمعات سلسلة الريبوسومات الوليدة. يتم استخدام إعادة التركيب المتماثلة 9 ، بالإضافة إلى الطرقالمستندة إلى CRISPR / Cas910 لدمج مختلف العوامل ذات الأهمية مع علامات لتنقية التقارب. هذه العلامات هي GFP ، لتنقية تقارب GFP-trap ، و TAP-tag لتنقية حبات IgG-Sepharose بالإضافة إلى AVI-Tag التي تم تنقيتها بواسطة avidin أو streptavidin ، لسرد بعض الأمثلة الناجحة من السنوات الأخيرة.

  1. قم بإجراء فحوصات النمو أو الفحص الوظيفي للتحقق من أن وضع العلامات لم يؤثر على وظيفة البروتينات. يجب تقييم العلامات الطرفية N مقابل C.
    ملاحظة: الريبوسومات (rRNA) ، بالإضافة إلى العديد من المجالات المرتبطة بالريبوسوم في عوامل مختلفة ، مشحونة للغاية ، مما يجعل العلامات المشحونة للغاية (مثل polyhistidine) غير مفضلة للاستخدام ، لأنها يمكن أن تؤدي إلى اكتشاف خاطئ أو تغيير وضع الربط.

2. نمو الثقافة

  1. قم بزراعة مزارع الخميرة المبنية (استنادا إلى السلالة BY4741) ، التي تحتوي على البروتينات الموسومة المطلوبة ، إما في الوسط الغني بالخميرة السائلة - مستخلص - الببتون - سكر العنب (YPD) ، أو في الوسط الأدنى من سكر العنب الاصطناعي (SD) (1.7 جم / لتر من قاعدة نيتروجين الخميرة مع كبريتات الأمونيوم أو 1.7 جم / لتر من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون كبريتات الأمونيوم مع 1 جم / لتر من حمض الجلوتاميك أحادي الصوديوم ، 2٪ من الجلوكوز وتستكمل بمزيج كامل أو مناسب من الأحماض الأمينية).
  2. تنمو 250-500 مل من زراعة الخلايا إلى 0.5 OD600 (منتصف السجل) ، عند 30 درجة مئوية ، في وسط مناسب.

3. جمع الخلايا وتحللها

  1. جمع الخلايا بسرعة عن طريق الترشيح الفراغي على غشاء نشاف النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر مع نظام تصفية الزجاج (حامل مرشح زجاجي مع قمع زجاجي سعة 1 لتر ، قاعدة فراغ وغطاء ، شاشة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، طوقا ومشبك زنبركي ، 90 مم ؛ قارورة مشتركة أرضية 1 لتر).
  2. قم بتجميد الخلايا التي تم جمعها ، عن طريق كشط الخلايا الحبيبية باستخدام ملعقة وغمرها على الفور في أنبوب 50 مل مملوء بالنيتروجين السائل.
    نقطة التوقف: يمكن تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3-4 أسابيع.
  3. قم بإجراء تحلل الخلايا عن طريق الطحن المبرد في مطحنة الخلاط: مرتين لمدة دقيقتين عند 30 هرتز ، مع 1 مل من مخزن التحلل المؤقت (انظر الجدول 1). يبرد في النيتروجين السائل بين الطحن.
الكاشف المبلغ لكل عينة (ميكرولتر) التركيز النهائي
10 ملغم/مل CHX (سيكلوهيكسيميد) 220 0.5 ملغم/مل
1M تريس هيدروكلورايد الرقم الهيدروجيني 8.0 88 20 مللي متر
3M KCl 205.7 140 مللي متر
1M MgCl2 26.4 6 مللي متر
1M PMSF 4.4 1 مللي متر
NP-40 4.4 0.10%
مثبطات الأنزيم البروتيني 2 حبة
دناز الأول 8.8 0.02 يو/مل
المجلد النهائي 4,400

الجدول 1: وصفة للمزيج الرئيسي للتحلل العازل.

ملاحظة: يمكن تغيير المخزن المؤقت للتحلل ليحتوي على المزيد من مثبطات الأنزيم البروتيني (مثل البيستاتين ، الليوبيبين ، الأبروتينين ، إلخ) في حالة عدم استقرار البروتين محل الاهتمام ، ولكن من المهم تجنب EDTA من أجل الحفاظ على الوحدات الفرعية الصغيرة والكبيرة للريبوسوم التي يتم تجميعها خلال الخطوات التالية. لأسباب مماثلة ، احتفظ دائما بما لا يقل عن 6 mM MgCl2 في محلول التخزين المؤقت.

تحذير: حمض الهيدروكلوريك شديد التآكل و PMSF سام. ارتداء القفازات والتعامل معها بعناية.

  1. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 30000 × جم ، 4 درجات مئوية لمسح الليزات وجمع supernatant.

4. تنقية مجمعات سلاسل الريبوسوم الوليدة ل SeRP

  1. لكل تجربة ، قسم supernatant إلى قسمين ؛ كل منها في أنبوب مختلف من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة: عينة الحمض النووي الريبي الكلي (~ 200 ميكرولتر) وعينة التنقية المناعية (IP) (~ 700 ميكرولتر) عينات translatome.
  2. معالجة عينة الحمض النووي الريبي الكلي
    1. هضم عينة الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام 10 U من RNase I لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية ؛ قم بالتدوير بسرعة 30 دورة في الدقيقة باستخدام رف خلط دوار.
      ملاحظة: يمكن معايرة ظروف الهضم باستخدام التنميط المتعدد لضمان عدم الإفراط في أو نقص الهضم من ذروة الأحاديات.
    2. تحضير المزيج الرئيسي وسادة السكروز كما هو موضح في الجدول 2.
الكاشف المبلغ لكل عينة (ميكرولتر) التركيز النهائي
50٪ سكروز 200 25%
1M تريس هيدروكلورايد الرقم الهيدروجيني 8.0 8 20 مللي متر
3M KCl 18.7 140 مللي متر
1M MgCl2 4 10 مللي متر
100 ملغم/مل CHX 0.4 0.1 ملغم/مل
مثبطات الأنزيم البروتيني 1 قرص
المجلد النهائي 400

الجدول 2: وصفة لمزيج وسادة السكروز الرئيسي.

  1. قم بتحميل العينة على 400 ميكرولتر من وسادة السكروز وأجهزة الطرد المركزي في دوار TLA120 لمدة 90 دقيقة عند 245000 × g وعند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإزالة السوبرناتانت بسرعة باستخدام مضخة تفريغ وكريات تراكب مع مخزن مؤقت للتحلل 150 ميكرولتر. أعد تعليق الكريات عن طريق الاهتزاز لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية وعند 300 دورة في الدقيقة.
  3. أعد تعليق الكريات المتبقية عن طريق السحب ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: 100-200 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي عادة ما يكون كافيا للتنميط الريبوسومي للترانسلاتوم الكلي. يمكن للمرء إضافة خطوة استنفاد الحمض النووي الريبي الريبي من أجل الحد من تلوث الحمض النووي الريبوزي المرسال ، وهو الملوث الأكثر انتشارا لسلاسل الريبوسوم الوليدة يعقد تنقية التقارب11 (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
  1. معالجة عينة التنقية المناعية
    1. اغسل 100-400 ميكرولتر من مصفوفة ربط التقارب (1: 1 حبات مترافقة مع الأجسام المضادة في 70٪ EtOH) لكل عينة مع مخزن مؤقت تحلل 3 × 1 مل (بدون DNase I ومثبطات الأنزيم البروتيني) ؛ أعد تعليق مصفوفة التقارب في المخزن المؤقت للتحلل ، ثم قم بالتدوير عند 30 دورة في الدقيقة باستخدام رف خلط دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ترسب عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 3000 × جم ، 4 درجات مئوية. تخلص من السائل العلوي. كرر ثلاث مرات.
    2. هضم عينات التنقية المناعية باستخدام 10 U لكل وحدة A260 نانومتر من RNase I ، جنبا إلى جنب مع مصفوفة ربط التقارب (على سبيل المثال ، 100-400 ميكرولتر من GFP-TRAP لكل عينة).
    3. قم بالتدوير لمدة 25 دقيقة عند 30 دورة في الدقيقة باستخدام رف مزيج دوار لربط البروتين بمصفوفة التقارب ، عند 4 درجات مئوية.
    4. قم بإعداد المزيج الرئيسي للغسيل العازل كما هو مفصل في الجدول 3.
الكاشف المبلغ لكل عينة (ميكرولتر) التركيز النهائي
10 ملغم/مل CHX 50 0.1 ملغم/مل
1M تريس هيدروكلورايد الرقم الهيدروجيني 8.0 100 20 مللي متر
3M KCl 233 140 مللي متر
1M MgCl2 50 10 مللي متر
1M PMSF 5 1 مللي متر
NP-40 0.5 0.01%
مثبطات الأنزيم البروتيني 2 حبة
50٪ جلسرين 1,000 10%
المجلد النهائي 5,000

الجدول 3: وصفة للمزيج الرئيسي للغسيل العازل.

  1. اغسل مصفوفة ربط التقارب ثلاث مرات باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل ، في كل مرة لمدة 1 دقيقة تقريبا ، مع الدوران في رف المزيج عند 30 دورة في الدقيقة ، عند 4 درجات مئوية.
  2. ترسب عن طريق الطرد المركزي عند 3000 × g لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية. تخلص من السائل العلوي.
  3. اغسل مرتين أخريين في مخزن مؤقت للغسيل سعة 1 مل ، في كل مرة لمدة 5 دقائق ، مع الدوران في رف المزيج عند 30 دورة في الدقيقة ، عند 4 درجات مئوية.
  4. ترسب عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 3000 × جم و 4 درجات مئوية.
  5. استخدم 50 ميكرولتر من الخرز لتخليص البروتين بنفس الكمية من المخزن المؤقت للعينة 2x. استخدم بقية الخرز لاستخراج الحمض النووي الريبي.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية عند 3000 × جم ، 4 درجات مئوية لتكوير الخرز والتخلص من السائل العلوي.
  7. تجمد في النيتروجين السائل وتخزن في -80 درجة مئوية. استخدم هذه العينات لاستخراج الحمض النووي الريبي لاحقا.
    نقطة التوقف: يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو أكثر. هذا يمكن أن يكون نقطة توقف.
  8. تقييم نجاح خطوة تنقية التقارب عن طريق لطخة غربية أو تلطيخ Coomassie مع aliquots (~ 10 ٪ من حيث الحجم ، بعد الخلط) من كل خطوة. استخدم دائما عنوان IP وهميا على سلالة WT غير موسومة كعنصر تحكم للربط غير المحدد بمصفوفة التقارب.
    ملاحظة: يمكن التغلب على الخلفية العالية غير المحددة عن طريق خطوات غسيل إضافية مع زيادة تركيزات الملح / المنظفات. يمكن تثبيت التفاعل العابر من خلال علاج مختلف العوامل المتقاطعة ، على سبيل المثال ، علاج بارافورمالديهايد (PFA) للخلايا الحية - إضافة 0.4٪ -1٪ PFA إلى وسائط النمو لمدة 2-5 دقائق ، تليها تبريد الجلايسين (0.3 م) لمدة 3 دقائق ، يوصى بشدة.
    تحذير: بارافورمالديهايد هو مادة مسرطنة مشتبه بها. نظرا لأن بارافورمالدهيد يتبخر بسرعة ويكون مسببا للتآكل ، فاعمل في غطاء أمان كيميائي وارتد طبقتين من القفازات.

5. إعداد مكتبة cDNA للتسلسل العميق

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    ملاحظة: اعمل مع أنابيب 1.5 مل غير لاصقة خالية من RNase لمنع استنفاد الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي المحتمل.
    1. قم بإذابة العينات من الخطوتين 4.2.5 و 4.3.12 على الجليد وإعادة تعليق العينات باستخدام 10 mM Tris-HCl pH 7.0 إلى حجم نهائي قدره 700 ميكرولتر.
      تحذير: حمض الفينول والكلوروفورم متطايرة وضارة. العمل في غطاء السلامة الكيميائية.
    2. أضف 40 ميكرولتر من 20٪ SDS إلى 0.7 مل إجمالي الحمض النووي الريبي أو استخلاص IP. أغلق وعكس عدة مرات. يجب أن يحول هطول الأمطار البروتيني العينات إلى اللون الأبيض.
    3. أضف 0.75 مل من حمض الفينول المسخن مسبقا: الكلوروفورم إلى العينات. أغلق الأنابيب بإحكام ورجها في خلاط حراري عند 1400 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وعند 65 درجة مئوية. تبرد العينات على الثلج لمدة 5 دقائق.
    4. جهاز الطرد المركزي للأنبوب من الخطوة 5.1.3. في 20000 × غرام لمدة 2 دقيقة. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب جديد وأضف إليها 0.7 مل من حمض الفينول: الكلوروفورم.
    5. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأحيانا دوامة. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 20,000 × جم. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب جديد وأضف إليها 0.6 مل كلوروفورم ودوامة.
    6. جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة عند 20,000 × جم. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب جديد.
    7. ترسب الأحماض النووية عن طريق إضافة 78 ميكرولتر من 3 M NaOAc ، ودرجة الحموضة 5.5 ، و 2 ميكرولتر من GlycoBlue ، و 0.75 مل من الأيزوبروبانول. دوامة بدقة لمدة 5 دقائق. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل عند -80 درجة مئوية أو 16 ساعة عند -20 درجة مئوية.
    8. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 20000 × جم وعند 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت. اغسل الكريات بالثلج البارد 0.75 مل من الإيثانول بنسبة 80٪. اقلب الأنابيب لغسل شامل. جهاز طرد مركزي عند 20000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من supernatant.
    9. تدور لأسفل عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 20 ثانية وإزالة الإيثانول المتبقي والتخلص من السوائل. جفف الكريات بغطاء مفتوح لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية. إعادة تعليق العينات على النحو التالي: بالنسبة ل IP ، أعد تعليق العينة في 10 ميكرولتر من 10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 7.0. لتحليل إجمالي translatome ، أعد تعليق العينة في 20 ميكرولتر من 10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 7.0.
      نقطة التوقف: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
  2. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق قياس الفلور
    ملاحظة: يجب أن تكون جميع المواد والأسطح التالية خالية من RNase أثناء إعداد مكتبة cDNA لتسلسل الجيل التالي. أثناء التعامل مع عينات الحمض النووي الريبي ، ارتد قفازات.
    1. تمييع 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الكلي المستخرج من الفينول الحمضي في 9 ميكرولتر من 10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 7.0. حدد كميا باستخدام مقياس الفلورومتر، وفقا للتعليمات الواردة في موقع الشركة المصنعة على الويب.
    2. تمييع العينات التي تحتوي على 50 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مع 10 ميكرولتر من 10 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.0.
      ملاحظة: لا تقم بقياس عينات IP ، استخدم كل شيء للخطوة التالية.
  3. جل تنقية شظايا البصمة المحمية بالريبوسوم
    1. اضبط جل البولي أكريلاميد TBE-urea بنسبة 15٪ واغمره في مخزن مؤقت يعمل 1x TBE. قم بالتشغيل لمدة 30 دقيقة عند 200 فولت قبل تحميل العينة. لكل عينة، أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة TBE-urea 2x.
      ملاحظة: حجم النطاق المتوقع حوالي 25-35 nt.
    2. قم بإذابة سلم الحمض النووي 10 نقاط أساس وعينات تشوه (وليس سلم) عند 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، ثم قم بتبريدها على الجليد. قم بتحميل كل عينة على كل حارة أخرى. قم بتشغيل الجل لمدة 50-70 دقيقة عند 200 فولت.
    3. قم بتخفيف 6 ميكرولتر من SYBR Gold (10000 × التركيز) في 60 مل من المخزن المؤقت 1x TBE والبقع أثناء الاهتزاز في صناديق محمية من الضوء لمدة 15-20 دقيقة. أثناء تلطيخ الجل ، قم بإعداد مشرط معقم وأنابيب كاسرة للهلام 0.5 مل في أنابيب تحمل علامة 1.5 مل.
    4. قم بقص الأشرطة المطلوبة باستخدام مشرط معقم (استخدم مشرطا طازجا أو نظف جيدا بين العينات) وضع كل قطعة هلام في أنبوب قاطع للهلام.
    5. التقط صورة للجل للتأكد من عدم ترك أي بقايا عينة في الجل.
    6. قم بطرد مركزي للأنابيب التي تحتوي على شرائح مقطوعة عند 20000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وانقل قطع الجل المتبقية من أنبوب كسر الجل إلى أنبوب 1.5 مل.
    7. أضف 0.5 مل من 10 مللي متر تريس ، الرقم الهيدروجيني 7.0. رج الخلاط الحراري بسرعة 1400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية.
    8. انقل إلى عمود خلات السليلوز مع طرف ماصة عريض التجويف ، وأجهزة طرد مركزي عند 20000 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. انقل التدفق إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل واتركه على الجليد.
    10. من أجل ترسيب الأحماض النووية ، أضف: 550 ميكرولتر من IPA ، و 55 ميكرولتر من 3 M NaOAc ، و 2 ميكرولتر من GlycoBlue ودوامة لخلطها جيدا. ضع العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
    11. جهاز طرد مركزي لمدة 1 ساعة على الأقل عند 20000 × جم و 4 درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت. اغسل الكريات ب 0.75 مل من الإيثانول البارد المثلج بنسبة 80٪. اقلب الأنابيب لغسلها جيدا حتى تنفصل الكريات عن القاع. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 20000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
    12. تدور لأسفل عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 20 ثانية وإزالة الإيثانول المتبقي. جفف الكريات بغطاء مفتوح لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية.
    13. أضف 15 ميكرولتر من 10 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 7.0 وأعد تعليق الكريات جيدا. تدور لأسفل عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 20 ثانية وتنقل العينة إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
      نقطة التوقف: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي النقي عند -80 درجة مئوية لبضعة أشهر.
  4. إزالة الفسفرة
    1. استخدم 3 ميكرولتر من المزيج التالي لكل عينة: أضف 1 ميكرولتر من مثبط RNase إلى 2 ميكرولتر من 10x T4 متعدد النوكليوتيدات كيناز المخزن المؤقت بدون ATP. أضف 2 ميكرولتر من كيناز متعدد النوكليوتيدات T4 إلى كل عينة. ماصة بلطف لتخلط جيدا وتحضن في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، دون أن تهتز.
    2. لتعطيل الإنزيم ، احتضن العينة عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وقم بالدوران لأسفل عند 450 × g ، 4 °C ، لمدة 20 ثانية. أضف 0.5 مل من 10 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 7.0.
    3. لترسيب الحمض النووي ، أضف 2 ميكرولتر من GlycoBlue ، و 550 ميكرولتر من IPA ، و 55 ميكرولتر من 3 M NaOAc.
    4. دوامة لخلط جيدا وتبريد العينات في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
      نقطة التوقف: يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو أكثر.
    5. كرر الخطوات 5.3.11-5.3.13.
      نقطة التوقف: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي منزوع الفوسفوريلات عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
  5. القياس الكمي باستخدام محلل حيوي
    1. قم بإجراء تخفيف بنسبة 1: 4 لكل عينة من عينات الحمض النووي الريبي عن طريق خلط 1 ميكرولتر من العينة و 4 ميكرولتر من الماء المعالج بواسطة DEPC.
      تحذير: DEPC هو مادة مسرطنة. ارتداء القفازات والعمل بعناية.
    2. قم بتشغيل Bioanalyzer رقاقة / شريط RNA صغير. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: حجم جزء الحمض النووي الريبوسومي المحمي من الريبوسوم المتوقع حوالي 28-30 نانوغرام.
  6. Ligate 3' نهاية مع Linker-1
    1. تمييع 5 pmol من شظايا الحمض النووي الريبي الصغيرة إلى 10 ميكرولتر مع 10 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 7.0. قم بنزع عينات من الطبيعة عند 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وتبرد على الجليد.
    2. تحضير المزيج الرئيسي كما هو مفصل في الجدول 4 واستخدام 29 ميكرولتر لكل عينة.
الكاشف المبلغ لكل عينة (ميكرولتر) التركيز النهائي
50٪ PEG 8000 معقم 16 20%
DMSO 4 10%
10× T4 الحمض النووي الريبي ligase 2 المخزن المؤقت 4 1x
مثبطات SUPERase-In RNase 2 2 يو
10 mM وصلة أدينيل 3-L1 0.1 25 ميكرومتر
المياه المعالجة من DEPC 2.9
المجلد النهائي 29

الجدول 4: وصفة لمزيج رئيسي من الربط النهائي لمدة 3 أقدام.

  1. أضف 1 ميكرولتر من T4 RNA ligase 2 وامتص بلطف لتخلط جيدا. احتضان في 23 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  2. من أجل ترسيب الأحماض النووية ، أضيف: 550 ميكرولتر من IPA ، و 500 ميكرولتر من 10 mM Tris ، ودرجة الحموضة 7.0 ، و 55 ميكرولتر من 3 M NaOAc ، و 2 ميكرولتر من GlycoBlue. دوامة لخلط جيدا، ووضع العينات في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
    نقطة التوقف: تخزين العينات عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو أكثر.
  3. كرر الخطوات 5.3.2-5.3.12.
  4. إعادة تعليق الكريات في 6 ميكرولتر من 10 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 7.0. تدور لأسفل عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 20 ثانية ، وتنقل العينة إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    نقطة التوقف: يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
  1. تنقية هلام من 3' آثار أقدام مرتبطة
    1. اضبط جل البولي أكريلاميد TBE-urea بنسبة 10٪ واغمره في مخزن مؤقت 1x TBE. قم بالتشغيل لمدة 30 دقيقة عند 200 فولت قبل تحميل العينة. إلى كل عينة، أضف 6 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة TBE-urea 2x.
      ملاحظة: حجم النطاق المتوقع حوالي 71-73 nt.
    2. كرر الخطوات 5.3.2-5.3.13.
      نقطة التوقف: يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
  2. النسخ العكسي لشظايا البصمة المرتبطة ب 3 بوصات لإنشاء ssDNA
    1. قم بإعداد مزيج رئيسي كما هو مفصل في الجدول 5 واستخدم 3 ميكرولتر لكل عينة.
الكاشف المبلغ لكل عينة (ميكرولتر) التركيز النهائي
10 mM dNTPs 1 0.5 مللي متر
25 ميكرومتر لينكر L(rt) 0.5 625 نانومتر
المياه المعالجة من DEPC 1.5
المجلد النهائي 3

الجدول 5: وصفة للمزيج الرئيسي للنسخ العكسي قبل تمسخ الأحماض النووية.

  1. دوامة وتدور أسفل العينة.
  2. احتضان العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. تبريد العينات على الجليد.
  4. تحضير مزيج رئيسي كما هو مفصل في الجدول 6 واستخدام 6 ميكرولتر لكل عينة. دوامة وتدور أسفل العينة. أضف 1 ميكرولتر من الحرف المرتفع III إلى كل عينة وامتص بلطف لتخلط جيدا وتحضن لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
الكاشف المبلغ لكل عينة (ميكرولتر) التركيز النهائي
5× المخزن المؤقت FS 4 1x
مثبطات SUPERase-In RNase 1 2 يو
DTT 0.1 م 1 5 مللي متر
المجلد النهائي 6

الجدول 6: وصفة للمزيج الرئيسي للنسخ العكسي بعد تمسخ الأحماض النووية.

  1. أضف 2.3 ميكرولتر من 1 N NaOH ، الذي يتحلل الحمض النووي الريبي ويروي النسخ العكسي.
    تحذير: NaOH شديد التآكل. ارتداء القفازات وحماية العين.
  2. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، حتى تتحول العينة إلى اللون الوردي.
  3. اضبط جل البولي أكريلاميد TBE-urea بنسبة 10٪ واغمره في مخزن مؤقت 1x TBE. قم بالتشغيل لمدة 30 دقيقة عند 200 فولت قبل تحميل العينة. إلى كل عينة، أضف 23 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة TBE-urea 2x.
    ملاحظة: حجم نطاق الحمض النووي المتوقع هو 115-117 nt.
  4. كرر الخطوات 5.3.2-5.3.12.
  5. أعد تعليق الكريات في 15 ميكرولتر من 10 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 8.0. تدور لأسفل عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 20 ثانية وتنقل العينة إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    نقطة التوقف: يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
  1. تعميم الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين
    1. قم بإعداد المزيج الرئيسي التالي وقم بتحميل 4 ميكرولتر لكل عينة ، كما هو مفصل في الجدول 7.
الكاشف المبلغ لكل عينة (ميكرولتر) التركيز النهائي
10× المخزن المؤقت CircLigase II 2 1x
5 م بيتين (اختياري) 1 0.25 م
50 ملليمتر لكل مليون متر مكعب2 1 2.5 ملليمتر
المجلد النهائي 4

الجدول 7: وصفة لمزيج رئيسي تعميم ssDNA .

  1. أضف 1 ميكرولتر من CircLigase II ssDNA ligase إلى كل عينة واحتضنها لمدة 1 ساعة عند 60 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن زيادة كفاءة هذه الخطوة عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من CircLigase II ssDNA ligase إلى كل عينة بعد حضانة 1 ساعة.
  2. قم بتعطيل الإنزيم عن طريق الحضانة عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. يبرد على الثلج ويستمر في تضخيم PCR أو يخزن عند -80 درجة مئوية.
    نقطة التوقف: يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية لسنوات.
  1. تضخيم PCR
    1. قم بإعداد المزيج الرئيسي التالي من PCR وقم بتحميل 82 ميكرولتر لكل عينة ، كما هو مفصل في الجدول 8.
الكاشف المبلغ لكل عينة (ميكرولتر) التركيز النهائي
المياه المعالجة من DEPC 61.6
5× المخزن المؤقت تفاعل Phusion HF 17.6 1x
10 mM dNTPs 1.8 200 ميكرومتر
100 ميكرومتر PCR التمهيدي الأمامي 0.2 225 نانومتر
HF فوسيون بوليميراز 0.8 1.6 يو
المجلد النهائي 82

الجدول 8: وصفة لتضخيم PCR المزيج الرئيسي.

  1. إلى كل أنبوب يحتوي على مزيج رئيسي ، أضف 5 ميكرولتر من الحمض النووي الدائري.
    ملاحظة: قم بتخزين بقية عينات الحمض النووي الدائرية عند -80 درجة مئوية.
  2. أضف 1 ميكرولتر مختلفة من 20 ميكرومتر PCR عكس الباركود التمهيدي إلى كل عينة (انظر الجدول 9) والدوامة لخلط جيدا.
  3. Aliquot كل أنبوب في أربعة أنابيب PCR منفصلة ، سيتم استخدام كل منها لعدد مختلف من دورات PCR.
  4. قم بتشغيل تفاعل PCR وفقا للبرنامج التالي ، كما هو مفصل في الجدول 10.
دور التشوه (98 درجة مئوية) صلب (60 درجة مئوية) تمديد (72 درجة مئوية)
1 30 ثانية
2-16 10 ثانية 10 ثانية 5 ثانية

الجدول 10: برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتفاعل البوليميراز المتسلسل.

  1. بعد الدورات 8 و 9 و 10 و 11 ، قم بإزالة أنابيب PCR (بالنسبة لعينات IP ، تتراوح الدورات من 9 إلى 15) كمحاولة أولى. بعد كل دورة ، أوقف البرنامج مؤقتا ، وأخرج أليكوت واحد وضعه على الجليد ، ثم استأنف البرنامج بسرعة.
    ملاحظة: يجب تعديل عدد الدورات بناء على كمية الحمض النووي الدائري في كل تفاعل. ارجع إلى الشكل 4 للحصول على مثال ومزيد من التوضيح.
  2. لكل تفاعل 17 ميكرولتر، أضف 3.5 ميكرولتر من صبغة تحميل الحمض النووي 6x.
  3. إذابة سلم الحمض النووي 10 نقطة أساس.
  4. لفصل الحجم عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي ، قم بغمر 8٪ TBE polyacrylamide في مخزن مؤقت لتشغيل TBE 1x وتحميل عينات كل رقم دورة مختلف في الآبار المجاورة وتشغيل الجل لمدة 50 دقيقة عند 180 فولت.
  5. قم بتخفيف 6 ميكرولتر من SYBR Gold (10000 × التركيز) في 60 مل من المخزن المؤقت 1x TBE والبقع أثناء الاهتزاز في صناديق محمية من الضوء لمدة 15-20 دقيقة.
  6. أثناء تلطيخ الجل ، قم بإعداد مشرط معقم وأنابيب كاسرة للهلام 0.5 مل في أنابيب تحمل علامة 1.5 مل.
  7. التقط صورة للأحماض النووية الملطخة.
  8. قم بقص الشريط المطلوب بحجم شريط متوقع يتراوح بين 174-176 نقطة أساس باستخدام المشرط المعقم ووضع شريحة الجل في أنبوب كسر الجل المحضر سعة 0.5 مل (نظف جيدا بين العينات واستخدم عامل تعطيل RNase ، أو قم بالتبديل إلى شفرة جديدة).
  9. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 20000 × g و 4 °C ، ثم انقل قطع الجل المتبقية من أنبوب كسر الجل 0.5 مل إلى أنبوب 1.5 مل.
  10. أضف 500 ميكرولتر من 10 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ورج في خلاط حراري عند 1400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق و 70 درجة مئوية.
  11. انقل الجل المذاب إلى عمود خلات السليلوز مع طرف ماصة عريض التجويف.
  12. قم بالطرد المركزي للعمود لمدة 3 دقائق عند 20000 × جم و 4 درجات مئوية وانقل التدفق إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل واتركه على الجليد.
  13. لترسيب الحمض النووي ، أضيف: 550 ميكرولتر من IPA ، و 32 ميكرولتر من 5 M NaCl ، و 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA ، و 2 ميكرولتر من GlycoBlue والدوامة لتخلط جيدا.
  14. احتفظ بالعينات لمدة 1 ساعة على الأقل عند -80 درجة مئوية ، أو -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    نقطة التوقف: يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو أكثر.
  15. كرر الخطوات 5.3.11-5.3.12.
  16. إعادة التعليق في 11 ميكرولتر من 10 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 8.0. تدور لأسفل عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 20 ثانية وتنقل العينة إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    نقطة التوقف: يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية لسنوات.
  1. تحديد توزيع الحجم بواسطة Bioanalyzer
    1. قم بإجراء تخفيف بنسبة 1:4 لكل عينة عن طريق خلط 1 ميكرولتر من العينة مع 4 ميكرولتر من الماء المعالج بواسطة DEPC.
    2. قم بتشغيل شريحة الحمض النووي الريبي الصغيرة Bioanalyzer. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: الطول المتوقع هو 175 ± 5 نقاط أساس.
  2. تحديد تركيز الحمض النووي بواسطة مقياس الفلورومتر
    1. قم بإجراء فحص تركيز dsDNA عالي الحساسية باستخدام مقياس الفلورومتر وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    2. تعدد الإرسال وعينات التسلسل وفقا لتوصيات Illumina (دليل تجميع محولات الفهرس12).

6. تحليل البيانات

  1. إجراء التحليل كما هو مفصل في الملف التكميلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو موضح في مخطط التدفق لهذا البروتوكول (الشكل 1) ، نمت الخلايا إلى مرحلة التسجيل ، ثم تم جمعها بسرعة عن طريق الترشيح وحلها عن طريق الطحن المبرد. ثم تم تقسيم الليزات إلى قسمين: أحدهما لإجمالي آثار أقدام الحمض النووي الريبوزي المرسال المحمية من الريبوسوم والآخر لآثار أقدام الحمض النووي الريبوزي المرسال المحمية من الريبوسوم المختارة ، والتي أجرينا عليها تنقية التقارب لسحب مجمعات سلاسل البروتين الريبوسوم الوليدة الموسومة بالبروتين. لقد ضمنا التعبير عن البروتين الموسوم ونجاح السحب لأسفل من خلال تحليل اللطخة الغربية ، كما يتضح من الشكل 2. لقد تحققنا من عزل آثار الأقدام المحمية من الريبوسوم ، والتي عادة ما يتراوح طولها بين 20 و 45 نانومترا بواسطة الرحلان الكهربائي الصغير للحمض النووي الريبي (نظام 2100 BioAnalyzer) ، مما يسمح بتحول 5-10 nt في الكشف عن الحجم ، وفقا لدليل النظام (الشكل 3). بعد ذلك ، أنشأنا مكتبة cDNA للتسلسل العميق وتحليل البيانات الضخمة. أثناء إنشاء مكتبة cDNA ، لاحظ أن ركوب الدراجات يمكن أن يؤدي إلى انخفاض العائد (كما هو موضح في الحارة 2 في الشكل 3) ، ولكن إعادة التضخيم ممكنة من أجل استعادة المكتبة التي تم إنشاؤها. قد يحدث الإفراط في ركوب الدراجات عندما يتم استنفاد الاشعال PCR ولكن التفاعل يستمر. عندما لا تزال dNTPs موجودة ، يستمر التفاعل ، مما يولد قطعا أثرية أطول من PCR مع تسلسلات وهمية بسبب منتجات PCR التي تستعد لنفسها13 (كما يمكن رؤيته في الممرات 3-4 في الشكل 3 ، المشار إليه باللطاخة المرئية). إذا أصبح تركيز dNTPs محدودا أيضا ، يمكن أن تظهر المنتجات التي تشير إلى وجود ابلازدوبكسات غير متجانسة تتكون من أجزاء مكتبة متجانسة جزئيا فقط. يعمل الشكل 4 كمرجع ، حيث يمثل المسار 2 التضخيم الأمثل ، والمسار 3 تضخيما مقبولا. لا ينبغي استخدام عينات من الممرات 4 و 5 (الدورتان 10 و 11) بسبب إمكانية إدخال نسخ PCR مكررة وتحف. تم التحقق من صحة المكتبة التي تم إنشاؤها بواسطة الرحلان الكهربائي للحمض النووي عالي الحساسية (تم استخدام نفس نظام BioAnalyzer) لتوزيع الحجم الدقيق والقياس الكمي (الشكل 5). بعد ربط رابط النهاية 3 '، والنسخ العكسي وتضخيم PCR ، من المتوقع توزيع طول cDNA على هذا النحو ، مع ذروة حادة حول 175 nt.

قمنا بقص وإزالة المحولات والباركود من المكتبة المتسلسلة ، وتم اختيار القراءات فقط بين 20 و 45 nt لمزيد من التحليل. ويبين الشكل 6 توزيع الطول الناتج. تم تقسيم القراءات إلى مجموعات مختلفة من: تسلسلات الترميز ، والإنترونات ، والتسلسلات بين الجينات (الشكل 7) ، وتم تصنيفها بشكل أكبر كما هو موضح في الشكل 8.

تم إجراء التحليل النهائي للكشف عن التفاعلات الانتقالية المشتركة وتوصيفها استنادا إلى إثراء شظايا الحمض النووي الريبوزي المرسال المحمية بالريبوسومات، مما أدى إلى إنتاج الرسوم البيانية في الشكل 9. قارنا إشغال الريبوسوم الطبيعي (في كل نيوكليوتيد على طول كل أورف) من إجمالي ترانسلاتوم إلى ترانسلاتوم المختار المقابل له (الوليد بين البيناكتوم). لكل مقارنة نيوكليوتيدات تلغي معدلات الترجمة القطع الأثرية. تم تقييم قابلية التكاثر بين النسخ المتماثلة البيولوجية من خلال ارتباط بيرسون (عتبة > 0.6). نقدم ملفات تعريف الريبوسوم الانتقائية ، وتحليل التفاعلات الانتقالية المشتركة ل Vma2p مع ثلاثة بروتينات: المرافقة المرتبطة بالريبوسوم Ssb1p ، Pfk2p (Phosphofructokinase) و Fas1p (سينثاز الأحماض الدهنية) ، مع كل بروتين C ' موسومة بشكل نهائي بواسطة GFP. قمنا بتنفيذ البروتوكول في النسخ المتماثلة البيولوجية. الشكل 9 يوضح A و D و G المخطط التجريبي لكل تنقية تقارب. نعرض بعد ذلك الإشغال الريبوسومي لإجمالي الترانسلاتومات مقارنة بالتفاعلات Ssb1 على طول Vma2p orf ، مع ترميز وحدة فرعية من H + -ATPase الفراغي (الشكل 9 B و E و H). وأخيرا، أجرينا تنميط إثراء الريبوسوم القائم على النسبة (IP/Total) في كل موضع ريبوسوم في [codon/aa] على طول orf (الشكل 9 C وF وI). وبمقارنة التفاعلات الانتقالية المشتركة لهذه البروتينات الثلاثة مع Vma2p ، التي يتم تصنيعها بواسطة الريبوسوم ، كشفت أن Ssb1 chaperone يشرك Vma2p الوليد في أربع مناطق مختلفة على طول orf ، حيث حددنا أربع قمم تخصيب كبيرة بواسطة SeRP. بشكل مختلف ، يظهر Pfk2p ذروة إثراء كبيرة واحدة فقط ، كما حددها SeRP ، في وضع مختلف مقارنة بالمرافق الانتقالي المشترك Ssb1. لم يكتشف تحليل التفاعلات الانتقالية المشتركة Fas1 مع Vma2p الوليدة أي إثراء كبير. وهكذا، فإن المقارنة بين هذه الملامح الريبوسومية القائمة على النسب التخصيب توضح قوة هذا البروتوكول في الكشف عن مختلف التفاعلات الانتقالية المشتركة وتوصيفها بدقة قريبة من الكودون.

Figure 2
الشكل 2: نتيجة اللطخة الغربية التمثيلية بعد تنقية التقارب لسلالة BY4741 مع علامة NAA10 الموسومة ب HA. نتيجة اللطخة الغربية التمثيلية بعد تنقية التقارب لسلالة BY4741 مع Naa10 الموسومة ب HA تظهر نطاقا حوالي 27.8 kDa ، في حين أن النوع البري ، كعنصر تحكم سلبي ، لا يظهر أي نطاق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نتيجة BioAnalyzer التمثيلية بعد عزل البصمة واستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام حمض الفينول: الكلوروفورم ، ومتوسط حجم 25 nt. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: الرحلان الكهربائي الهلامي التمثيلي لتضخيم PCR. الرحلان الكهربائي الهلامي التمثيلي لتضخيم PCR مع الممرات 2-5 المحملة بمنتجات PCR من الدورات 8-11 ، والسلالم على كلا الجانبين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: نتيجة BioAnalyzer التمثيلية التي تم الحصول عليها بعد إنشاء مكتبة cDNA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التوزيع المتوقع للطول للقراءات بعد إزالة المحولات باستخدام Cutadapt (إزالة القراءات الأقصر من 20 أو أطول من 45). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: النسبة المئوية المتوقعة لنجاح المحاذاة بعد إزالة قراءات الحمض النووي الريبي غير المشفرة باستخدام Bowtie2 واستخدام TopHat لمحاذاة القراءات المتبقية مع الكائنات الحية المختلفة. تم أخذ العينة من S. cerevisiae (متغير متحور من BY4741). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: رسم بياني تم إنشاؤه باستخدام RiboToolkit يمثل نسبة الترميز المتوقعة مقابل نسبة عدم الترميز للقراءات المحاذاة بعد استخدام Bowtie2 لإزالة عناصر rRNA في القراءات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: التفاعلات الانتقالية المشتركة لثلاثة بروتينات مختلفة: Ssb1p و Pfk2p و Fas1p مع Vma2p ، والتي يتم تصنيعها بواسطة الريبوسوم ، الذي يتم تحليله بواسطة SeRP. يتم عرض جميع محاور y في قراءات لكل مليون قراءة (RPM). (أ، دال، ز) مخطط تجريبي ل SeRP من Ssb1p و Pfk2p و Fas1p C ' الموسومة نهائيا بواسطة GFP ، على التوالي. (ب، هاء، ح) إشغال الريبوسوم على طول orf من إجمالي translatomes مقارنة ب Ssb1 و Pfk2p و Fas1p interactomes ، على التوالي (في النسخ المتماثلة البيولوجية). (جيم واو وأنا) متوسط إثراء Ssb1p و Pfk2p و Fas1p (نسبة IP / الإجمالية) في كل موضع ريبوسوم في [codon / aa] على طول orf ، على التوالي. يشار إلى الاختلاف بين النسخ المتماثلة البيولوجية من خلال المنطقة المظللة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 9: 3' Linker وتسلسل التمهيدي. 3' Linker L1: Linker 3-L1 مع أدينيل 5 و 3 'dideoxy-cytidine معرفات جزيئية فريدة ('NN...') (تنقية HPLC الخالية من RNase; رابط النسخ العكسي: النسخ العكسي (L(rt)) مع معرفات جزيئية فريدة من نوعها 5 ʹ مفسفرة (تنقية HPLC خالية من RNase) ؛ PCR التمهيدي إلى الأمام: PCRf; HPLC تنقية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

ملف تكميلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، يفصل البروتوكول نهج التنميط الريبوسومي الانتقائي لالتقاط التفاعلات الانتقالية المشتركة بدقة قريبة من الكودون. مع ارتفاع الريبوسوم كمركز لتنسيق ظهور السلسلة الوليدة في السيتوبلازم المزدحم ، تعد هذه طريقة حاسمة لتحديد وتوصيف مختلف التفاعلات الانتقالية المشتركة المطلوبة لضمان وجود بروتين وظيفي ، وكذلك لدراسة الأمراض المختلفة. حتى الآن ، SeRP هي الطريقة الوحيدة التي يمكنها التقاط وتوصيف هذه التفاعلات ، بطريقة مباشرة ، في الجسم الحي14،15،16.

الخطوة الأولى والأكثر أهمية هي جمع الخلايا وتحللها. من الضروري التقاط الترجمة المستمرة ، في غضون ثوان ، عن طريق التجميد السريع متبوعا بالتحلل في حالة مجمدة. يجب أن يتم جمع الخلايا على عجل من أجل تجنب الجريان السطحي الريبوسومي وكذلك تحفيز الاستجابات الانتقالية للإجهاد ، والتي يمكن أن تحدث بسرعة. الخطوة الثانية الحاسمة هي خطوة تنقية التقارب. من الضروري تقليل ربط الخلفية عن طريق الغسيل الصارم مع التأكد من الحفاظ على التفاعلات الانتقالية المشتركة ، والتي يمكن تسهيلها عن طريق الربط المتبادل في الجسم الحي . نظرا لأن هذا البروتوكول يعتمد على تسلسل الجيل التالي (NGS) شديد الحساسية ، يمكن تضخيم الخلفية العالية في الخطوات الأولى في خطوات إعداد مكتبة cDNA التالية ، مما يؤدي إلى انخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء.

يجب تقييم معالجة النوكليز ، لهضم جميع الحمض النووي الريبوزي المرسال غير المحمي عن طريق التنميط المتعدد17 مع تقييم دقيق لتوزيع حجم آثار أقدام الريبوسوم المعزولة (كما هو مفصل أعلاه) لتجنب هضم الحمض النووي الريبي أو تحته. يمكن أن تسهل معايرة تركيز Nuclease وأوقات الهضم استعادة البصمة بدقة ، حيث يمكن أن يؤدي الإفراط في الهضم إلى هضم الحمض النووي الريبوسومي rRNA ، مما يؤدي إلى فقدان آثار الأقدام المحمية من الريبوسوم. من المهم ملاحظة أن نقص الهضم يمكن أن يؤدي أيضا إلى انخفاض معدلات اكتشاف آثار الأقدام المحمية من الريبوسوم ، حيث أن خطوات إعداد مكتبة cDNA ، وكذلك خطوات تحليل البيانات الموضحة هنا تتجاهل القراءات الطويلة غير المعهودة.

في حين أن استنفاد الحمض النووي الريبوزي المرسال لا يشكل دائما خطوة حاسمة وليس إلزاميا ، إلا أنه يتمتع ببعض المزايا مثل العينات الأنظف ، وبالتالي معدل أعلى من القراءات المخططة للجينوم. من ناحية أخرى ، هناك احتمال حدوث تحيزات ، حيث أن العديد من بروتوكولات استنفاد الحمض النووي الريبي قد تتسبب أيضا في استنفاد الشظايا المحمية من الريبوسوم المطلوبة. وينبغي للمرء أيضا أن يأخذ في الاعتبار تكاليف مجموعات استنفاد الحمض النووي الريبوزي المرسال. يمكن إجراء استنفاد الحمض النووي الريبوزي المرسال بعد خطوة عزل طباعة الريبوسوم والقدم أو بعد خطوة تعميم الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين.

تم تحسين خطوات إعداد مكتبة cDNA كما هو موضح هنا ، لإدخال mRNA المنخفض ، حيث أن خطوات تنقية التقارب والريبوسوم تقلل بشكل كبير من كمية مدخلات mRNA ، مقارنة بدراسات التعبير RNA-seq. يمكن أن يؤدي رفع مستوى الكمية الأولية من مزارع الخلايا إلى تسهيل إنشاء مكتبة cDNA بشكل كبير. بدلا من ذلك ، يمكن لأي بروتوكول مكتبة cDNA من اختياره أن يتناسب مع خطوات تنقية التقارب وعزل البصمة الموضحة هنا. من المهم ملاحظة أن علاج Nuclease الذي يولد آثار أقدام الريبوسوم يتطلب إصلاح نهايات الحمض النووي الريبوزي المرسال الناتجة (إعداد مكتبة cDNA ، خطوة إزالة الفسفرة) للسماح باتباع خطوات ربط الرابط في بروتوكول cDNA الموضح هنا في البروتوكول الذي تختاره.

أثناء التسلسل ، من المهم التمييز بين SeRP و RNA-Seq ، حيث يختلف عدم تجانس المكتبات التي تم إنشاؤها اختلافا كبيرا ، اعتمادا على عوامل التقارب المعلمة. غالبا ما تكون العوامل المرافقة الجزيئية وعوامل الاستهداف أكثر اختلاطا في التجليد ، وتتفاعل مع مئات أو آلاف الركائز أثناء الترجمة ، مما يؤدي إلى مكتبات cDNA شديدة التنوع. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الجهات الفاعلة المحددة للغاية ، مثل مداخلات التجميع المعقدة المشتركة في الترجمة ، في كثير من الأحيان إلى توليد مكتبات cDNA أقل تنوعا. يمكن أن يؤدي ارتفاع عدد المكتبات المتنوعة وغير المتنوعة على نفس المسار إلى تحسين التسلسل ومتابعة نتائج تحليل البيانات بشكل كبير.

ميزة أخرى فريدة من نوعها ل SeRP هي قدرته على التقاط الاختلافات المحلية في إشغالات الريبوسوم على طول orf مما يسمح باكتشاف التحولات الريبوسومية في معدل الترجمة المرتبطة بكل مجموعة من التفاعلات. لذلك من الضروري مقارنة إشغالات الريبوسوم في كل كودون على طول orf لتحديد التخصيب بشكل صحيح. يمكن أن يؤدي استخدام متوسطات orfs إلى فقدان التفاعلات العابرة أو الاكتشاف الخاطئ.

يفتح الاستخدام الصحيح لطريقة SeRP العديد من المسارات الانتقالية المشتركة للتحليل المباشر ، واكتشاف ميزات ميكانيكية جديدة بالإضافة إلى عوامل جديدة مرتبطة بالريبوسوم ، مما يحدث ثورة في مجال التخليق الحيوي للبروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نشكر جميع أعضاء المختبر على المناقشات المثمرة ومحمد مخزومي على القراءة النقدية للمخطوطة. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة ISF (مؤسسة العلوم الإسرائيلية) 2106/20.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631 6×
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876 2×
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  3. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  4. Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
  5. Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
  6. Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
  7. Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
  8. Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
  9. Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
  10. Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
  11. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
  12. Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019).
  13. Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
  14. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
  15. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  16. Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
  17. Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).

Tags

علم الأحياء ، العدد 176 ،
التحديد العالمي لشبكات التفاعل الانتقالي المشترك عن طريق التنميط الريبوسومي الانتقائي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, … More

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter