Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rating L-DOPA-geïnduceerde dyskinesieën in het eenzijdig 6-OHDA-laesie rattenmodel van de ziekte van Parkinson

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Knaagdiermodellen van levodopa-geïnduceerde dyskinesieën zijn onschatbare hulpmiddelen om therapeutische interventies te identificeren om de ontwikkeling te verzwakken of de manifestaties te verlichten die ontstaan als gevolg van de herhaalde toediening van L-DOPA. Dit protocol laat zien hoe dyskinetische bewegingen kunnen worden geïnduceerd en geanalyseerd in het eenzijdig 6-OHDA-laesie rattenmodel van de ziekte van Parkinson.

Abstract

Levodopa-geïnduceerde dyskinesieën (LIDs) verwijzen naar motorische complicaties die voortvloeien uit langdurige toediening van L-DOPA aan patiënten met de ziekte van Parkinson (PD). Het meest voorkomende patroon dat in de kliniek wordt waargenomen, is de piekdosis dyskinesie die bestaat uit klinische manifestaties van choreiforme, dystonische en ballistische bewegingen. Het 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rattenmodel van PD bootst verschillende kenmerken van LIDs na. Na herhaalde toediening van L-DOPA vertonen 6-OHDA-laesie ratten dyskinetische bewegingen (bijv. Abnormale onwillekeurige bewegingen, AAM's). Dit protocol laat zien hoe AIMs kunnen worden geïnduceerd en geanalyseerd bij ratten met 6 OHDA-laesie met 90% -95% dopaminerge uitputting in de nigrostriatale route. Herhaalde toediening (3 weken) van levodopa (5 mg/kg, gecombineerd met 12,5 mg/kg benserazide) kan de ontwikkeling van amm's induceren. De analyse van het tijdsverloop onthult een significante toename van AMM's na 30-90 minuten (piekdosis dyskinesie). Knaagdiermodellen van LIDs zijn een belangrijk preklinisch hulpmiddel om effectieve antidyskinetische interventies te identificeren.

Introduction

De dopaminevoorloper L-3,4-dihydroxyfenylalanine (L-DOPA) vertegenwoordigt de meest effectieve behandeling voor de motorische symptomen van de ziekte van Parkinson (PD)1. Levodopa-therapie kan motorische symptomen geassocieerd met PD verbeteren, maar verliest effectiviteit met de tijd. Motorische fluctuaties zoals "slijtagefluctuatie" of "verslechtering aan het einde van de dosis" manifesteren zich klinisch als een verkorte duur van het effect van enkele L-DOPA-doses2. In andere gevallen bestaan klinische manifestaties uit langzame draaiende bewegingen en abnormale houdingen (dystonie)3 en treden op wanneer de dopaminespiegels laag zijn (off-period dystonie)4. Aan de andere kant verschijnen levodopa-geïnduceerde dyskinesieën (LIDs) wanneer dopamineniveaus in het plasma en de hersenen hoog zijn5.

LIDs produceren slopende bijwerkingen die motorische complicaties omvatten, zoals choreiform, dystonische en ballistische 6-bewegingen. Eenmaal vastgesteld, treden LIDs op na elke levodopa-toediening. Motorische complicaties treden op bij 40% -50% van de PD-patiënten die gedurende 5 jaar L-DOPA-therapie ondergaan, en de incidentie neemt in de loop van de jaren toe7. Hoewel de pathofysiologische mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van LIDs bij PD-patiënten nog niet volledig zijn opgehelderd, zijn de mate van dopaminerge denervatie, pulsatiele levatiele levodopa-toediening, downstream veranderingen in striatale eiwitten en genen en afwijkingen in niet-dopaminetransmittersystemen factoren die bijdragen aan de ontwikkeling van deze ongewenste bijwerkingen 6,8,9,10.

Het neurotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) is een goed gekarakteriseerd hulpmiddel om PD bij knaagdieren te bestuderen 11,12,13,14. Aangezien 6-OHDA de bloed-hersenbarrière niet overschrijdt, moet het rechtstreeks in de nigrostriatale route worden geïnjecteerd. 6-OHDA-geïnduceerde dopaminerge depletie is concentratie- en plaatsafhankelijk15. Eenzijdige toediening van 6-OHDA aan de mediale voorhersenenbundel (MFB) kan ernstige (>90%) nigrostriatale schade veroorzaken bij knaagdieren 16,17,18,19. Chronische toediening van levodopa aan ernstige eenzijdig 6-OHDA-laesie knaagdieren veroorzaakt het verschijnen van dyskinetische bewegingen die abnormale onvrijwillige bewegingen (AIM's) worden genoemd. Dyskinetisch-achtige bewegingen bij knaagdieren delen vergelijkbare moleculaire, functionele en farmacologische mechanismen gerelateerd aan LIDs bij PD-patiënten5. Daarom zijn 6-OHDA-laesie ratten20 en muizen21 waardevolle preklinische modellen om LIDs te bestuderen. Bij chronische behandeling (7-21 dagen) met therapeutische doses L-DOPA (5-20 mg/kg), vertonen eenzijdig 6-OHDA-laesie ratten en muizen een geleidelijke ontwikkeling van aki's die de voorpoot-, romp- en orofaciale spieren beïnvloeden die contralateraal zijn voor de laesie 17,18,19,20,22,23,24 . Deze bewegingen worden gepresenteerd in een tijdsverloop vergelijkbaar met levodopa-geïnduceerde piekdosis dyskinesieën bij PD-patiënten25 en worden gekenmerkt door hyperkinetische bewegingen en dystonie5. AAM's worden meestal gescoord op basis van hun ernst (bijvoorbeeld wanneer een specifieke AIM aanwezig is) en amplitude (bijvoorbeeld gekenmerkt door de amplitude van elke beweging)5,23,25.

6-OHDA-laesie knaagdiermodellen van LIDs vertonen gezichtsvaliditeit (d.w.z. het model heeft verschillende kenmerken die lijken op de menselijke conditie)5,11,26,27,28. Knaagdier-AIMs, vergelijkbaar met wat optreedt bij PD-patiënten, worden gezien als hyperkinetische (voorpoot- en orolingual) en dystonische (axiale) bewegingen29 en bootsen piekdosis dyskinesie na. Op moleculair en functioneel niveau delen knaagdiermodellen veel pathologische kenmerken met PD-patiënten5, zoals upregulatie van FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 en serotoninetransporter (SERT)34,35 . Wat de voorspellende validiteit betreft, vertonen geneesmiddelen die LIDs bij PD-patiënten verminderen (bijv. het N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptorantagonist amantadine) antidyskinetische werkzaamheid in het knaagdiermodel 22,36,37,38,39.

De knaagdier-AIMs-beoordelingsschaal is gemaakt op basis van vier AIMs-subtypen, waaronder AAM's die het hoofd, de nek en de romp beïnvloeden (axiale AMM's), hyperkinetische voorpootbewegingen (limb-AIMs) en dyskinetisch-achtige orolinguele bewegingen (orolinguele AIM's). Hoewel contralaterale rotatie (locomotief-AAM's) ook aanwezig is bij eenzijdig gelaesiede knaagdieren 20,22,23,25,40, is het niet gescoord als een dyskinetisch-achtige beweging omdat het mogelijk geen specifieke maat van LIDs 22,37,41 vertegenwoordigt.

Hier zullen we beschrijven hoe dyskinetisch-achtige bewegingen (axiale, ledemaat en orolinguele AMM's) kunnen worden geïnduceerd en geanalyseerd in het ernstige (>90%) eenzijdig 6-OHDA-laesie ratmodel van PD. We hebben ons protocol georganiseerd op basis van de eerdere literatuur en onze laboratoriumexpertise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische commissie van de Faculteit der Wijsbegeerte, Wetenschappen en Brieven van Ribeirão Preto (CEUA / FFCLRP 18.5.35.59.5).

1. 6-OHDA laesie

  1. Gebruik Sprague-Dawley mannelijke ratten met een gewicht van 200-250 g aan het begin van de experimenten (6 weken). Huisvest de dieren (2-3 per kooi) onder standaard laboratoriumomstandigheden (12:12 uur licht/donker cyclus, lichten aan om 06:00 uur, temperatuurgecontroleerde faciliteiten (22-24 °C), met voedsel en water beschikbaar ad libitum.
    OPMERKING: Een volledige beschrijving van het genereren van ernstige 6-OHDA-laesie ratten wordt elders beschreven42.
  2. Op passende wijze dieren acclimatiseren voor het begin van een experimentele procedure.
  3. Dien (intraperitoneaal, i.p.) de noradrenalinetransporterremmer imipramine (20 mg/kg, opgelost in 0,9% zoutoplossing) 30 min voor de operatie toe.
    OPMERKING: Toediening van Imipramine zal de selectiviteit van 6-OHDA voor dopaminerge neuronen verhogen.
  4. Dien ketamine/xylazine (70/10 mg/kg) intraperitoneaal toe.
  5. Zorg ervoor dat het dier diep verdoofd is door het gebrek aan reactie op teenknijpen en in een buikligging in het stereotaxische apparaat op de bovenkant van een verwarmingskussen wordt geplaatst.
  6. Verwijder de vacht op het hoofd en desinfecteer het operatiegebied 3 keer, afwisselend een scrub op basis van jodium en alcohol.
  7. Gebruik een scalpel om een incisie (ongeveer 1 cm) te maken in het gebied waar de micro-injectie zal optreden.
  8. Reinig het schedelgebied met wattenstaafjes en zorg ervoor dat de Bregma en Lambda worden blootgesteld.
  9. Zorg ervoor dat MFB stereotaxische coördinaten zijn genomen van bregma 43,44,45: -4,3 mm voorste, 1,6 mm laterale (rechterkant) en 8,3 mm ventraal (van de dura mater).
  10. Dien de 6-OHDA toe met een snelheid van 0,4 μL/min (10 μg in 4 μL zoutoplossing met 0,1% ascorbinezuur) eenzijdig in de rechter mediale voorhersenenbundel (MFB) met behulp van een Hamilton glazen spuit van 50 μL.
  11. Hecht aan het einde van de operatie de hoofdhuidincisie en hydrateer het dier met warme (~ 37 ° C) steriele 0,9% zoutoplossing (~ 10 ml / kg, s.c.).
  12. Haal het dier uit het stereotaxische frame en plaats het in een verwarmde herstelkooi. Monitor totdat het bewustzijn is herwonnen.
  13. Beoordeel de effectiviteit van de dopaminerge laesie 4 weken na de laesie met behulp van een stappentest46,47.
    OPMERKING: In deze test wordt de akinesie van de voorpoot contralateraal aan de laesie beoordeeld door het aantal aanpassingsstappen met de voorpoot contralateraal aan de laesie. Ratten die drie of minder aanpassingsstappen presenteren met de contralaterale voorpoot worden in het onderzoek opgenomen als vermeende ernstig 6-OHDA-laesie ratten48.

2. L-DOPA chronische behandeling

  1. Start de chronische behandeling op maandag, 4 weken na 6-OHDA laesie.
    OPMERKING: Aangezien AAM's gedurende 3 opeenvolgende dagen per week (woensdag, donderdag en vrijdag) gedurende 3 weken worden gefilmd, wordt aanbevolen om de behandeling op maandag te starten.
  2. Behandel de ratten met vers bereide L-DOPA (via subcutaan (s.c.), 1 ml/kg) plus benserazidehydrochloride (respectievelijk 5 mg/kg en 12,5 mg/kg) gedurende 3 weken, eenmaal daags van maandag tot vrijdag45.
    OPMERKING: Eenmaal gevestigd, zullen AAM's zich manifesteren bij elke toediening van L-DOPA. Daarom is 2-4 keer per week toediening van 3 weken na de inductieperiode van 3 weken voldoende om een stabiele expressie van AMM's48 te behouden.

3. AAM's registreren en scoren

  1. Voer experimenten uit tussen 09:00 uur en 17:00 uur. Zorg ervoor dat de onderzoeker zich volledig niet bewust is van de identiteit en farmacologische behandeling van de ratten.
  2. Plaats de rat voorzichtig in een transparante cilinder (20 cm diameter x 40 cm hoog) en laat hem minstens 15 minuten acclimatiseren. Zorg ervoor dat de vloer bedekt is met het beddengoed. Spiegels moeten achter de cilinder worden geplaatst, zodat de experimentator het dier vanuit alle mogelijke hoeken kan observeren.
    OPMERKING: Als er meer dan één rat per experiment is, gebruik dan een cilinder voor elke rat. Manipulatie van de dieren tussen sessies door kan de gedragsanalyse verstoren.
  3. Plaats een videocamera met hoge resolutie op een manier die de weergave van axiale, ledemaat- en orolinguele AIM's bevordert. Omdat rotatiegedrag aanwezig is onder deze experimentele omstandigheden, zullen de spiegels achter de cilinder het mogelijk maken om AAM's onder een hoek van 360 ° te volgen. Gebruik een statief of bevestig de camera rechtstreeks op de bank.
    OPMERKING: Orolinguele AAM's kunnen een uitdaging zijn om te scoren, vooral als er een hoge incidentie van rotatiegedrag is. Het maken van video's met de camera iets onder het vlak waar de dieren zich in een hoek van 15° bevinden, zal helpen om dit bewegingssubtype te observeren.
  4. Haal het dier voorzichtig uit de cilinder en dien levodopa toe (5 mg/kg gecombineerd met 12,5 mg/kg benserazide, s.c.).
  5. Plaats het dier terug in de cilinder en start een timer om AAM's te volgen na L-DOPA-injectie. Gebruik een videocamera om AMM's op te nemen gedurende 180 minuten na de injectie van L-DOPA. Hoewel de analyse kan worden uitgevoerd door directe observatie van het dier, heeft offline scoren de voorkeur.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de timer ook op video is opgenomen, zodat AAM's op precieze tijdstippen na de toediening van L-DOPA kunnen worden gescoord.
  6. Scoor AMM's met intervallen van 30 minuten tot 180 minuten na L-DOPA-injectie (zie tabel 1 voor definities) zoals aanvankelijk beschreven20,23. Scores moeten worden gegeven over tijdperken van 1-2 minuten en worden geclassificeerd als axiale, ledemaat of orolingueel (figuur 1).
  7. Observeer zorgvuldig elke AIM en attribuutscores voor ernst en amplitude. Gebruik tabel 1 voor instructies. Neem geen normaal gedrag op, zoals opvoeden, snuiven, verzorgen en knagen in de beoordeling. Er zullen in totaal zes observatieperioden zijn (30, 60, 90, 120, 150 en 180 min).
SUBTYPEN
Axiale: torsie van hoofd, nek en romp
Ledemaat: onwillekeurige bewegingen van zowel distale als proximale voorpoot
Orolingual: onwillekeurige bewegingen van de orofaciale spieren
STRENGHEID
0: Afwezig
1: Incidenteel (met onderbrekingen, aanwezig in minder dan de helft van de waarnemingstijd)
2: Frequent (met onderbrekingen maar aanwezig in meer dan de helft van de waarnemingstijd)
3: Continu maar onderbroken door externe zintuiglijke prikkels
4: Continu en niet onderbroken door externe zintuiglijke prikkels
AMPLITUDE
Axiale
1: Torsie van hoofd en nek in een hoek van ongeveer 30°
2: Torsie van hoofd en nek bij ongeveer 30° < hoek ≤ 60°
3: Torsie van het hoofd, de nek en de bovenstam in ongeveer 60° < hoek ≤ 90°
4: Torsie van hoofd, nek en romp in > hoek van 90°, waardoor de rat vaak zijn evenwicht verliest
Lidmaat
1: Kleine onwillekeurige bewegingen van de distale voorpoot
2: Bewegingen van lage amplitude die translocatie van zowel distale als proximale voorpoot veroorzaken
3: Onwillekeurige bewegingen van de hele ledemaat, inclusief schouderspieren
4: Sterke ledemaat- en schouderbewegingen, vaak vergelijkbaar met ballisme
Orolingual
1: Kleine onwillekeurige bewegingen van de orofaciale spieren
2: Orofaciale bewegingen met hoge amplitude met tonguitsteeksel

Tabel 1: AIMS-definitie en beoordelingscriteria.

Figure 1
Figuur 1: Opeenvolging van foto's van elk AIM-subtype. (A tot en met A'") Axiale AIM toont dystonisch-achtige bewegingen in verschillende hoeken (A: 30° hoek, A': 30° < hoek ≤ 60°, A": 60° < hoek ≤ 90°, en A'": > hoek van 90°). (B tot B") Limb AIM (zwarte pijlen) die onwillekeurige bewegingen van de distale (B en B') en de hele voorpoot (inclusief schouder, B) weergeven. (C) Orolingual AIM (rode pijl) met hoge amplitude met tonguitsteeksel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Data-analyse

  1. Bereken axiale, ledemaat- of orolinguele AMM-subtypen door de ernst- en amplitudescores voor elke observatieperiode na toediening van L-DOPA (d.w.z. zes observatieperioden) te vermenigvuldigen, zoals eerder beschreven20. De theoretische maximale score die één dier in één testsessie zou kunnen verzamelen is 240 (maximale score per observatieperiode is 40, zie tabel 1 voor details).
  2. Plot-AMM's scoren voor alle zes observatieperioden die op woensdag, donderdag en vrijdag zijn geregistreerd gedurende de 3 weken van chronische levodopa-toediening (figuur 2). AAM's kunnen worden samengevat om de maximale score van elk dier op elke scoredag (figuur 3) of elke week (figuur 4) gedurende de 3 weken van chronische levodopa-toediening aan te geven.
  3. Controleer of de gegevens een bijna normale verdeling hebben voordat u de statistische analysebenadering selecteert.
    OPMERKING: AAM's-beoordelingsschalen bestaan uit ordinale gegevens en kunnen worden geanalyseerd met niet-parametrische statistieken. Parametrische tests worden veel gebruikt bij het vergelijken van AMM-scores tussen experimentele groepen na herhaalde testsessies40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hoewel de AMM-patronen die bij ratten worden waargenomen eenvoudiger en beperkter zijn in vergelijking met die waargenomen bij mensen en niet-menselijke primaten, reproduceert dit model zowel hyperkinetische als dystonisch-achtige bewegingen geïnduceerd door chronische levodopa-toediening. Hier presenteren we gegevens verzameld van een groep (n = 10) van eenzijdig 6-OHDA-laesie ratten die chronisch worden behandeld met levodopa (5 mg / kg gecombineerd met 12,5 mg / kg benserazide) gedurende 3 weken (maandag tot vrijdag). Merk op dat de gegevens in figuur 2, figuur 3 en figuur 4 van dezelfde dieren zijn.

Figuur 2 toont de tijdsverloopanalyse voor scores toegepast op axiale, ledemaat- en orolinguele AMM's gedurende 3 weken chronische levodopa-toediening. Elk AIM-scoresubtype op een specifieke observatieperiode wordt gerapporteerd als de vermenigvuldiging van ernst- en amplitudescores in deze analyse. Dit type analyse kan handig zijn om het effect te onderzoeken van geneesmiddelen die interfereren met het temporele profiel van AMM's.Merk op dat L-DOPA-geïnduceerde piekdosis dyskinesieën optreden tussen 30-90 minuten met een geleidelijke afname na 120 minuten na injectie (figuur 2).

Figure 2
Figuur 2: Analyse van tijdsverloop met axiale, ledemaat- en orolinguele AKI's gedurende 3 weken chronische toediening van L-DOPA (5 mg / kg gecombineerd met 12,5 mg / kg benserazide) aan 6-OHDA-laesie ratten. (A) Axiale, (B) ledemaat en (C) orolinguele AMM's werden gescoord op woensdag, donderdag en vrijdag gedurende 3 weken chronische levodopa-toediening. Elk AIM-subtype wordt gerapporteerd als de vermenigvuldiging van ernsttijden amplitude op elk van de zes observatieperioden. Elk AIM-subtype kan afzonderlijk worden geanalyseerd of worden samengevat zoals aangegeven in (D). Merk op dat de piekernst van de AIM's geleidelijk zal toenemen tijdens de eerste week van chronische levodopa-toediening. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (n = 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3 toont de som van de aki'sscores die worden gepresenteerd voor alle zes observatieperioden die in figuur 2 worden weergegeven (datasets zijn kleurgecodeerd voor eenvoudige vergelijkingen). Deze analyse geeft de maximale score van elk dier aan op elke scoredag (woensdag, donderdag en vrijdag) gedurende de 3 weken van chronische levodopa-toediening. Dit type analyse kan voordelig zijn om het effect van verbindingen met potentiële antidyskinetische profielen te onderzoeken, vooral omdat de scores van AIMs stabiel zijn gedurende week 2 en 3 van chronische levodopa-toediening. Bovendien kunnen wekelijkse AAM's-scores (figuur 4) worden gegenereerd op basis van de som van scores die worden toegeschreven aan ratten met 6 OHDA-laesies op woensdag, donderdag en vrijdag.

Figure 3
Figuur 3: Som van axiale, ledemaat- en orolinguele AMM's op individuele scoringsdagen gedurende 3 weken chronische toediening van levodopa (5 mg/kg gecombineerd met 12,5 mg/kg benserazide) aan ratten met 6 OHDA-laesie. In deze figuur werden de scores van AAM's in elk van de zes observatieperioden (zie details in figuur 2 legenda) opgeteld. Individuele datasets werden kleurgecodeerd om te vergelijken met de gegevens die in figuur 2 worden weergegeven. Deze analyse geeft de maximale score van elk dier aan op elke scoredag (woensdag - W, donderdag - T en vrijdag - F) na 3 weken chronische levodopa-toediening. (A) Axiale, (B) Ledemaat en (C) orolinguele AIM's. (D) Som van axiale, ledemaat en orolinguele AIM's. One-way herhaalde metingen ANOVA en Holm-Sidak post-hoc test onthulden dat AAM's geleidelijk toenemen tijdens de chronische toediening van L-DOPA. Merk op dat de scores van AMM's stabiel zijn over week 2 en 3 van chronische levodopa-toediening (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. woensdag (W) in week 1). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (n = 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Som van wekelijkse axiale, ledemaat- en orolinguele AKI's gedurende chronische toediening van L-DOPA (5 mg/kg gecombineerd met 12,5 mg/kg benserazide) aan 6-OHDA-laesie ratten. In deze figuur werden de AAM's die elke week scoorden (woensdag, donderdag en vrijdag - zie figuur 3) opgeteld. Deze analyse geeft de maximale score van elk dier aan op elke week van chronische levodopa-toediening. (A) Axiale, (B) Ledemaat en (C) orolinguele AIM's. (D) Som van axiale, ledemaat en orolinguele AIM's. One-way herhaalde metingen ANOVA en Holm-Sidak post-hoc test onthulden dat AAM's toenemen tijdens de chronische toediening van L-DOPA (* p < 0,05 vs. Week 1). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (n = 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol laat zien hoe amm's kunnen worden geïnduceerd en geanalyseerd in het rattenmodel van PD geïnduceerd door unilaterale micro-injectie van 6-OHDA in de MFB. Chronische dagelijkse toediening van lage doses levodopa (5 mg/kg, gecombineerd met 12,5 mg/kg benserazide) veroorzaakte de ontwikkeling van aam's gedurende de 3 weken behandeling. Temporele analyse onthulde een significante toename van AMM's en de piekdosis dyskinesie wordt waargenomen tussen 30 en 90 minuten na toediening van LEVODOPA. AMM's zijn repetitieve en doelloze bewegingen die axiale, ledemaat- en orolinguele spieren beïnvloeden. Het protocol en de hier gepresenteerde gegevens komen overeen met de eerdere literatuur 22,23,49,50,51.

De axiale, ledemaat- en orolinguele AAM's-beoordelingsschaal is erg gevoelig omdat deze de hoeveelheid tijd (d.w.z. ernst) beoordeelt dat de knaagdieren dyskinetisch-achtige bewegingen vertonen en de amplitude van deze bewegingen aangeeft20. AMM-scores kunnen worden uitgedrukt in verschillende temporele resoluties (zie figuur 2, figuur 3, figuur 4)17,18,19,52. Verschillende studies hebben de rol van levodopa-dosering op de ontwikkeling van aam's onderzocht. Chronische toediening van lagere doses L-DOPA (5-20 mg /kg) bevordert een geleidelijke ontwikkeling van AAM's boven de behandeling, terwijl hoge doses L-DOPA (25 mg / kg of meer) resulteren in de snelle en robuuste ontwikkeling van AMM's 23,25,27,53. Interessant is dat een deel van de ernstige 6-OHDA-laesiedieren mogelijk geen AAM's ontwikkelt (of zeer lage AAM-scores heeft) na chronische toediening van lage doses L-DOPA 40,49,53. Het is ook essentieel om rekening te houden met de toedieningsweg van de L-DOPA. Hoewel AMM's een vergelijkbaar begin, tijdprofiel en ernstgraad40 delen, is aangetoond dat episodes van dosisfalen vaak voorkwamen bij ratten die intraperitoneaal werden behandeld27. Ook produceerde i.p. toediening van levodopa interindividuele variaties in plasmaspiegels, een effect dat niet werd waargenomen na s.c. injecties27.

In deze studie waren AAM's duidelijk bij dieren met ernstige nigrostriatale schade (meer dan 90% van dopaminerge uitputting). Massaal verlies van striatale dopaminerge innervatie wordt gekenmerkt door een vermindering van het aantal aanpassingsstappen uitgevoerd met de voorpoot contralateraal aan de laesie48. Daarom raden we de staptest aan om dieren te selecteren met vermeende ernstige 6-OHDA-laesies aan de nigrostriatale route. De amfetamine-geïnduceerde rotatietest wordt vaak gebruikt om vermeende ratten met 6 OHDA-laesie te selecteren. Amfetamine verhoogt de afgifte van dopamine in het intacte striatum en verhoogt dus de bestaande onbalans tussen het geïnnervateerde en gedenervateerde striatum. Een interessante studie uitgevoerd bij 312 6-OHDA-laesie ratten11 onthulde echter geen correlatie tussen amfetamine-geïnduceerde rotatie en tyrosinehydroxylase positieve cellen in de ipsilaterale substantia nigra pars compacta. Dezelfde studie toonde een slechte correlatie tussen amfetamine-geïnduceerde rotatie en de ernst van AAM's.

Er is een duidelijke relatie tussen de fenomenologie van AIM's en het patroon van nigrostriatale dopaminerge uitputting20. Het 6-OHDA rat model van PD dat we in dit protocol gebruikten, ontwikkelt ernstige unilaterale uitputting van nigrostriatale dopamine terminals na 6-OHDA infusie in de MFB. Volledig dopamine-uitgeputte 6-OHDA-laesie ratten hebben een hogere incidentie van AAM's in vergelijking met gedeeltelijk dopamine-uitgeputte dieren. Een gedetailleerde analyse van striatale expressie van de neuropeptiden dynorfine en enkefaline na 6-OHDA-laesie en chronische toediening van LEVODOpa wordt elders beschreven45 en is consistent met eerdere literatuur23,25. Op moleculair niveau delen dyskinetische knaagdieren moleculaire markers geassocieerd met de dyskinesie die duidelijk is in niet-menselijke primatenmodellen van PD- en PD-patiënten, zoals striatale upregulatie van ΔFosB-transcriptiefactor 26,32,33,54. Ook toont het knaagdiermodel van PD een verhoogde microvesseldichtheid in het striatum als reactie op L-DOPA-behandeling55 op een vergelijkbare manier waargenomen in het putamen van PD-patiënten56. Knaagdiermodellen van LIDs reageren op antidyskinetische farmacologische benaderingen die in de kliniek worden gebruikt, zoals de NMDA-receptorantagonist amantadine 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37, 38,39. Al met al bevestigen deze bewijzen de gezichtsvaliditeit en voorspellende validiteit van het 6-OHDA-rattenmodel om de pathofysiologie van LIDs te karakteriseren en voor de screening van verbindingen met antidyskinetische eigenschappen. Het muizenmodel van LIDs is ook een waardevol hulpmiddel om verschillende aspecten van LIDs bij transgene muizen te bestuderen. Protocollen voor het muizenmodel van LIDs zijn te vinden in papers van verschillende onderzoeksgroepen 30,57,58.

Het is belangrijk op te merken dat het 6-OHDA-laesie knaagdiermodel van LIDs beperkingen heeft. 6-OHDA-geïnduceerde dopaminerge depletie is acuut in vergelijking met de progressieve aard van nigrostriatale depletie bij de PD-patiënt5. Het kan ook een uitdaging zijn om een uitstekend therapeutisch venster te vinden voor het gebruik van een antidyskinetisch medicijn bij patiënten, omdat het verhogen van de dosering van een medicijn het gunstige effect van L-DOPA kan verstoren of bijwerkingen kan veroorzaken die mogelijk niet zijn waargenomen in het diermodel59,60. Een andere beperking van het rattenmodel van LIDs is het gebrek aan fysieke gelijkenis tussen AMM's bij de knaagdieren en de manifestatie van de choreiform-bewegingen waargenomen bij patiënten en niet-menselijke primaten 10,61,62. Een andere mogelijke beperking van het hier gepresenteerde protocol is dat AAM's elke 30 minuten na toediening van L-DOPA worden gescoord, maar dit probleem kan worden beheerd als de experimentator alle dieren gedurende 180 minuten na toediening van L-DOPA videobanden maakt. De experimentator kan vervolgens het scoreprotocol aanpassen voor frequentere scores (bijvoorbeeld elke 10 of 20 minuten). Deze aanpak is voordelig in experimenten die een dynamischer beeld van het tijdsverloop van AAM's vereisen (bijvoorbeeld de combinatie van AIMs-scoring en in vivo elektrofysiologische of neurochemische opnames).

Kortom, het 6-OHDA ratmodel van LID reproduceert de pathofysiologie van de ziekte en ontwikkelt AAM's die kunnen worden gemoduleerd door geneesmiddelen die klinisch worden gebruikt. Hoewel het beperkingen heeft, vertegenwoordigt het 6-OHDA-rattenmodel van LID nog steeds een onschatbaar preklinisch hulpmiddel om effectieve antidyskinetische interventies met translationeel potentieel te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door São Paulo Research Foundation (FAPESP, subsidie 2017/00003-0). We zijn dankbaar voor de Coördinatie voor de Verbetering van het Hoger Onderwijs Personeel (CAPES). We danken Dr. Anthony R. West, Dr. Heinz Steiner en Dr. Kuei Y. Tseng voor ondersteuning en mentorschap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-hydroxydopamine hydrobromide Sigma-Aldrich, USA H6507 Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride Sigma B7283 Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B HIKVISION DS-2CE16C0T-IRP Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride Alfa Aesar J63723 Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride Ceva Animal Health Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) Cayman Chemical Company 16149 Dopamine precursor
Mirrors Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm PrecisionGlide Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl) Samtec Salt
Syringes 1 ml Sterile BD Plastipak Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride Ceva Animal Health Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jenner, P. Molecular mechanisms of L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (9), 665-677 (2008).
  2. Nutt, J. G. Levodopa-induced dyskinesia: review, observations, and speculations. Neurology. 40 (2), 340-345 (1990).
  3. Luquin, M. R., Scipioni, O., Vaamonde, J., Gershanik, O., Obeso, J. A. Levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: clinical and pharmacological classification. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 7 (2), 117-124 (1992).
  4. Fabbrini, G., Brotchie, J. M., Grandas, F., Nomoto, M., Goetz, C. G. Levodopa-induced dyskinesias. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 22 (10), 1379 (2007).
  5. Cenci, M. A., Crossman, A. R. Animal models of l-dopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 33 (6), 889-899 (2018).
  6. Bastide, M. F., et al. Pathophysiology of L-dopa-induced motor and non-motor complications in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 132, 96-168 (2015).
  7. Manson, A., Stirpe, P., Schrag, A. Levodopa-induced-dyskinesias clinical features, incidence, risk factors, management and impact on quality of life. Journal of Parkinson's Disease. 2 (3), 189-198 (2012).
  8. Grandas, F., Galiano, M. L., Tabernero, C. Risk factors for levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease. Journal of Neurology. 246 (12), 1127-1133 (1999).
  9. Schrag, A., Quinn, N. Dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. A community-based study. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 11 2297-2305 (2000).
  10. Bezard, E., Brotchie, J. M., Gross, C. E. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesia: potential for new therapies. Nature Reviews. Neuroscience. 2 (8), 577-588 (2001).
  11. Tronci, E., Shin, E., Björklund, A., Carta, M. Amphetamine-induced rotation and L-DOPA-induced dyskinesia in the rat 6-OHDA model: a correlation study. Neuroscience Research. 73 (2), 168-172 (2012).
  12. Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson's disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
  13. Ungerstedt, U. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. European Journal of Pharmacology. 5 (1), 107-110 (1968).
  14. Ungerstedt, U. Postsynaptic supersensitivity after 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 367, 69-93 (1971).
  15. Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Experimental Neurology. 152, 259-277 (1998).
  16. Zahm, D. S. Compartments in rat dorsal and ventral striatum revealed following injection of 6-hydroxydopamine into the ventral mesencephalon. Brain Research. 552 (1), 164-169 (1991).
  17. Padovan-Neto, F. E., Echeverry, M. B., Tumas, V., Del-Bel, E. A. Nitric oxide synthase inhibition attenuates L-DOPA-induced dyskinesias in a rodent model of Parkinson's disease. Neuroscience. 159 (3), 927-935 (2009).
  18. Padovan-Neto, F. E., et al. Antidyskinetic effect of the neuronal nitric oxide synthase inhibitor is linked to decrease of FosB/deltaFosB expression. Neuroscience Letters. 541, 126-131 (2013).
  19. Padovan-Neto, F. E., Cavalcanti-Kiwiatkoviski, R., Carolino, R. O., Anselmo-Franci, J., Del Bel, E. Effects of prolonged neuronal nitric oxide synthase inhibition on the development and expression of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-OHDA-lesioned rats. Neuropharmacology. 89, 87-99 (2015).
  20. Winkler, C., Kirik, D., Björklund, A., Cenci, M. A. L-DOPA-induced dyskinesia in the intrastriatal 6-hydroxydopamine model of parkinson's disease: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 10 (2), 165-186 (2002).
  21. Francardo, V., et al. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to l-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 42, 327-340 (2011).
  22. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 15 (1), 120-132 (2002).
  23. Cenci, M. A., Lee, C. S., Björklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. The European Journal of Neuroscience. 10 (8), 2694-2706 (1998).
  24. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of enhanced behavioral responses to L-DOPA following repeated administration in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 151 (2), 334-342 (1998).
  25. Lee, C. S., Cenci, M. A., Schulzer, M., Björklund, A. Embryonic ventral mesencephalic grafts improve levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 7 1365-1379 (2000).
  26. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 6 (6), 461-474 (1999).
  27. Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The "motor complication syndrome" in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with L-DOPA: relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
  28. Animal Models of Movement Disorders: volume I, Neuromethods. Lane, E. L., Dunnett, S. 61, Springer Science+Business Media. (2011).
  29. Carlsson, T., Carta, M., Winkler, C., Björklund, A., Kirik, D. Serotonin neuron transplants exacerbate l-DOPA-induced dyskinesias in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 27 (30), 8011-8022 (2007).
  30. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 16 (1), 110-123 (2004).
  31. Fasano, S., et al. Inhibition of Ras-guanine nucleotide-releasing factor 1 (Ras-GRF1) signaling in the striatum reverts motor symptoms associated with L-dopa-induced dyskinesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21824-21829 (2010).
  32. Berton, O., et al. Striatal overexpression of DeltaJunD resets L-DOPA-induced dyskinesia in a primate model of Parkinson disease. Biological Psychiatry. 66 (6), 554-561 (2009).
  33. Lindgren, H. S., et al. Putaminal upregulation of FosB/ΔFosB-like immunoreactivity in Parkinson's disease patients with dyskinesia. Journal of Parkinson's Disease. 1 (4), 347-357 (2011).
  34. Rylander, D., et al. Maladaptive plasticity of serotonin axon terminals in levodopa-induced dyskinesia. Annals of Neurology. 68 (5), 619-628 (2010).
  35. Smith, R., et al. The role of pallidal serotonergic function in Parkinson's disease dyskinesias: a positron emission tomography study. Neurobiology of Aging. 36 (4), 1736-1742 (2015).
  36. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of a mouse model of l-DOPA-induced dyskinesia. Experimental Neurology. 194 (1), 66-75 (2005).
  37. Dekundy, A., Lundblad, M., Danysz, W., Cenci, M. A. Modulation of L-DOPA-induced abnormal involuntary movements by clinically tested compounds: further validation of the rat dyskinesia model. Behavioural Brain Research. 179 (1), 76-89 (2007).
  38. Blanchet, P. J., Konitsiotis, S., Chase, T. N. Amantadine reduces levodopa-induced dyskinesias in parkinsonian monkeys. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 13 (5), 798-802 (1998).
  39. Verhagen Metman, I., et al. Amantadine as treatment for dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. Neurology. 50 (5), 1323-1326 (1998).
  40. Cenci, M. A., Lundblad, M. Ratings of L-DOPA-induced dyskinesia in the unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease in rats and mice. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9 25 (2007).
  41. Dupre, K. B., et al. Effects of coincident 5- HT1A receptor stimulation and NMDA receptor antagonism on L-DOPA-induced dyskinesia and rotational behaviors in the hemi-parkinsonian rat. Psychopharmacology (Berl). 199 (1), 99-108 (2008).
  42. Guimarães, P. R., Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).
  43. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. New York. (1998).
  44. Tseng, K. Y., et al. Inhibition of striatal soluble guanylyl cyclase-cGMP signaling reverses basal ganglia dysfunction and akinesia in experimental parkinsonism. PloS One. 6 (11), 27187 (2011).
  45. Padovan-Neto, F. E., et al. Selective regulation of 5-HT1B serotonin receptor expression in the striatum by dopamine depletion and repeated L-DOPA treatment: Relationship to L-DOPA-induced dyskinesias. Molecular Neurobiology. 57 (2), 736-751 (2020).
  46. Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Bjorklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: Differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15, 3863-3875 (1995).
  47. Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease lesions. Neuroscience. 88, 617-628 (1995).
  48. Jayasinghe, V. R., Flores-Barrera, E., West, A. R., Tseng, K. Y. Frequency-dependent corticostriatal disinhibition resulting from chronic dopamine depletion: Role of local striatal cGMP and GABAAR signaling. Cerebral Cortex. 27, 625-634 (2017).
  49. Picconi, B., et al. Loss of bidirectional striatal synaptic plasticity in L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Neuroscience. 6 (5), 501-506 (2003).
  50. Carta, M., et al. Role of striatal L-DOPA in the production of dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned rats. Journal of Neurochemistry. 96 (6), 1718-1727 (2006).
  51. Westin, J. E., Andersson, M., Lundblad, M., Cenci, M. A. Persistent changes in striatal gene expression induced by long-term L-DOPA treatment in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 14 (7), 1171-1176 (2001).
  52. Bariotto-Dos-Santos, K., et al. Repurposing an established drug: an emerging role for methylene blue in L-DOPA-induced dyskinesia. The European Journal of Neuroscience. 49 (6), 869-882 (2018).
  53. Lindgren, H. S., Lane, E. L. Rodent Models of l-DOPA-Induced Dyskinesia. Animal Models of Movement Disorders. Neuromethods. Lane, E., Dunnett, S. 61, Humana Press. (2011).
  54. Doucet, J., et al. Drug-drug interactions related to hospital admissions in older adults: A prospective study of 1000 patients. Journal of the American Geriatrics Society. 44, 944-948 (1996).
  55. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain: A Journal of Neurology. 134, Pt 8 2339-2357 (2011).
  56. Jourdain, V. A., et al. Increased putamen hypercapnic vasoreactivity in levodopa-induced dyskinesia. JCI insight. 2 (20), 96411 (2017).
  57. Thiele, S. L., et al. Generation of a model of l-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. Journal of Neuroscience Methods. 197 (2), 193-208 (2011).
  58. Dos-Santos-Pereira, M., et al. Contributive role of TNF-α to L-DOPA-induced dyskinesia in a unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease. Frontiers in Pharmacology. 11, 617085 (2021).
  59. Cenci, M. A., Ohlin, K. E., Odin, P. Current options and future possibilities for the treatment of dyskinesia and motor fluctuations in Parkinson's disease. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 10 (6), 670-684 (2011).
  60. Cenci, M. A. Presynaptic mechanisms of l-DOPA-induced dyskinesia: The findings, the debate, and the therapeutic implications. Frontiers in Neurology. 5, 242 (2014).
  61. Langston, J. W., Quik, M., Petzinger, G., Jakowec, M., Di Monte, D. A. Investigating levodopa-induced dyskinesias in the parkinsonian primate. Annals of Neurology. 47 (4), Suppl 1 79-89 (2000).
  62. Chase, T. N. Levodopa therapy: consequences of the nonphysiologic replacement of dopamine. Neurology. 50 (5), Suppl 5 17-25 (1998).

Tags

Biologie Nummer 176 Ziekte van Parkinson basale ganglia 6-hydroxydopamine L-DOPA-geïnduceerde dyskinesieën abnormale onwillekeurige bewegingen
Rating L-DOPA-geïnduceerde dyskinesieën in het eenzijdig 6-OHDA-laesie rattenmodel van de ziekte van Parkinson
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. … More

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Guimarães, R. P., Padovan-Neto, F. E. Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62924, doi:10.3791/62924 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter