Summary
L-DOPA 유발 운동 이상증의 설치류 모델은 L-DOPA의 반복 투여로 인해 나타나는 증상을 완화하거나 발달을 약화시키기위한 치료 적 개입을 식별하는 데 귀중한 도구입니다. 이 프로토콜은 파킨슨 병의 일방적 인 6-OHDA 병변 쥐 모델에서 운동 장애와 같은 움직임을 유도하고 분석하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
L-DOPA 유발 운동 이상증 (LID)은 파킨슨 병 (PD) 환자에게 장기간 L-DOPA 투여로 인해 발생하는 운동 합병증을 나타냅니다. 클리닉에서 관찰되는 가장 흔한 패턴은 choreiform, 근긴장 이상 및 탄도 운동의 임상 증상으로 구성된 피크 용량 운동 이상증입니다. PD의 6-하이드록시도파민(6-OHDA) 래트 모델은 LID의 여러 특성을 모방합니다. 반복적인 L-DOPA 투여 후, 6-OHDA-병변을 가진 랫트는 이운동성 유사 움직임(예를 들어, 비정상적인 비자발적 움직임, AIMs)을 나타낸다. 이 프로토콜은 흑색 선조체 경로에서 90%-95% 도파민 고갈을 보이는 6-OHDA 병변 쥐에서 AIM을 유도하고 분석하는 방법을 보여줍니다. L-DOPA (5 mg / kg, 벤세 라지드 12.5 mg / kg과 병용)의 반복 투여 (3 주)는 AIM 발생을 유도 할 수 있습니다. 시간 과정 분석은 30-90 분 (피크 용량 운동 이상증)에서 AIM의 상당한 증가를 보여줍니다. LID의 설치류 모델은 효과적인 항이동성 중재를 확인하는 중요한 전임상 도구입니다.
Introduction
도파민 전구체 L-3,4- 디 히드 록시 페닐알라닌 (L-DOPA)은 파킨슨 병 (PD)의 운동 증상에 가장 효과적인 치료법입니다 1. L-DOPA 요법은 PD와 관련된 운동 증상을 개선할 수 있지만 시간이 지남에 따라 효과가 떨어집니다. "마모 변동" 또는 "용량 종료 악화"와 같은 운동 변동은 단일 L-DOPA 용량의 효과 단축 기간으로 임상적으로나타납니다2. 다른 경우에는 임상 증상이 느린 비틀림 운동과 비정상적인 자세 (근긴장 이상)3 로 구성되며 도파민 수치가 낮을 때 발생합니다 (오프 기간 근긴장 이상)4. 반면에 L-DOPA 유발 운동 이상증 (LID)은 혈장과 뇌의 도파민 수치가 높을 때 나타납니다5.
LID는 무도병, 근긴장 이상 및 탄도6 운동과 같은 운동 합병증을 포함하는 쇠약해지는 부작용을 생성합니다. 일단 확립되면 LID는 모든 L-DOPA 투여 후에 발생합니다. 운동 합병증은 5 년 동안 L-DOPA 치료를받는 PD 환자의 40 % -50 %에서 발생하며 발병률은 수년에 걸쳐 증가합니다7. PD 환자에서 LID의 발달에 관여하는 병태생리학적 기전이 아직 완전히 밝혀지지는 않았지만, 도파민성 탈신경화, 박동성 L-DOPA 투여, 선조체 단백질 및 유전자의 다운스트림 변화, 비도파민 전달 시스템의 이상은 이러한 원치 않는 부작용의 발생에 기여하는 인자이다 6,8,9,10.
신경독 6- 하이드 록시 도파민 (6-OHDA)은 설치류 11,12,13,14에서 PD를 연구하기위한 잘 특성화 된 도구입니다. 6-OHDA는 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않기 때문에 흑색 선조체 경로에 직접 주사해야합니다. 6-OHDA-유도된 도파민성 고갈은 농도- 및 부위-의존적이다15. 내측 전뇌 다발(MFB)에서 6-OHDA를 일방적으로 투여하면 설치류16,17,18,19에서 심각한(>90%) 흑색선체 손상이 발생할 수 있습니다. 중증 일방적 인 6-OHDA 병변 설치류에 L-DOPA를 만성적으로 투여하면 비정상적인 비자발적 운동 (AIM)이라고하는 운동 이상과 유사한 움직임이 나타납니다. 설치류에서의 운동 장애-유사 운동은PD 환자에서 LID와 관련된 유사한 분자적, 기능적 및 약리학적 메커니즘을 공유한다5. 따라서, 6-OHDA 병변 래트20 및 마우스21은 LID를 연구하기 위한 귀중한 전임상 모델이다. L-DOPA (5-20 mg / kg)의 치료 용량으로 만성적으로 (7-21 일) 치료했을 때, 일방적으로 6-OHDA 병변을 입은 쥐와 마우스는 병변과 반대쪽의 앞다리, 몸통 및 구강 안면 근육에 영향을 미치는 AIM의 점진적인 발달을 보여줍니다 17,18,19,20,22,23,24 . 이러한 움직임은 PD 환자25에서 L-DOPA 유도 피크 용량 운동 이상증과 유사한 시간 코스에서 나타나며과 운동 운동 및 근긴장 이상증을 특징으로합니다5. AIM은 일반적으로 심각도(예: 특정 AIM이 있는 경우)와 진폭(예: 각 움직임의 진폭으로 특징지어짐)5,23,25에 따라 점수가 매겨집니다.
LID의 6-OHDA 병변 설치류 모델은 얼굴 유효성을 나타냅니다 (즉, 모델은 인간 상태와 유사한 몇 가지 특성을 가짐) 5,11,26,27,28. PD 환자에서 발생하는 것과 유사한 설치류 AIM은 과운동(앞다리 및 구강설) 및 근긴장(축 방향) 운동29으로 간주되며 피크 선량 운동 이상증을 모방합니다. 분자 및 기능적 수준에서 설치류 모델은 FosB / ΔFosB 19,26,30,31,32,33 및 세로토닌 수송 체 (SERT) 34,35의 상향 조절과 같은 PD 환자 5와 많은 병리학 적 특성을 공유합니다. . 예측 타당성과 관련하여, PD 환자에서 LID를 감소시키는 약물 (예를 들어, N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 수용체 길항제 아만타딘)은 설치류 모델 22,36,37,38,39에서 항이동성 효능을 나타낸다.
설치류 AIM 등급 척도는 머리, 목 및 몸통에 영향을 미치는 AIM(축 방향 AIM), 과운동 앞다리 움직임(사지 AIM) 및 운동성 유사 구강 언어 운동(구강 언어 AIM)을 포함하는 4가지 AIM 하위 유형을 기반으로 만들어졌습니다. 반대쪽 회전 (기관차 AIMs)이 일방적으로 병변 된 설치류 20,22,23,25,40에도 존재하지만, LIDS 22,37,41의 특정 측정을 나타내지 않을 수 있기 때문에 운동 장애와 같은 운동으로 점수가 매겨지지 않았습니다.
여기에서는 PD의 중증 (>90 %) 일방적 인 6-OHDA 병변 쥐 모델에서 운동 장애 유사 운동 (축 방향, 사지 및 구강 언어 AIMs)을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다. 우리는 이전 문헌과 실험실 전문 지식을 기반으로 프로토콜을 구성했습니다.
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Protocol
모든 실험은 Ribeirão Preto의 철학, 과학 및 편지 학부 윤리위원회 (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5)에 따라 수행되었습니다.
1. 6-OHDA 병변
- 실험 시작 (6 주)에 체중이 200-250g 인 Sprague-Dawley 수컷 쥐를 사용하십시오. 표준 실험실 조건 (12:12 h 명암 주기, 06:00 h에 조명 켜짐, 온도 조절 시설 (22-24 ° C))에서 동물 (케이지 당 2-3 마리)을 수용하고 음식과 물을 자유롭게 사용할 수 있습니다.
참고: 중증 6-OHDA-병변 래트를 생성하는 방법에 대한 완전한 설명은다른 곳(42)에 기재되어 있다. - 실험 절차를 시작하기 전에 동물을 적절하게 적응시킵니다.
- 수술 30 분 전에 노르 에피네프린 운반 억제제 이미 프라 민 (20mg / kg, 0.9 % 식염수에 용해 됨)을 투여하십시오 (복강 내, i.p).
참고: 이미프라민 투여는 도파민성 뉴런에 대한 6-OHDA 선택성을 증가시킵니다. - 케타민 / 자일 라진 (70/10 mg / kg)을 복강 내 투여하십시오.
- 동물이 발가락 꼬집음에 대한 반응의 부족으로 깊게 마취되고 가열 패드 상단의 정위 장치에서 경향이있는 위치에 위치하는지 확인하십시오.
- 머리의 모피를 제거하고 요오드 기반 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 수술 부위를 3 번 소독하십시오.
- 메스를 사용하여 미세 주사가 발생할 부위를 절개 (약 1cm)하십시오.
- 면봉으로 두개골 부위를 청소하고 브레그마와 람다가 노출되었는지 확인하십시오.
- MFB 입체 좌표가 bregma43,44,45에서 가져왔는지 확인합니다: -4.3mm 전방, 1.6mm 측면(오른쪽) 및 8.3mm 복부(경막에서).
- 6-OHDA를 0.4μL/min(0.1% 아스코르브산이 함유된 4μL의 식염수 중 10μg)의 속도로 50μL 해밀턴 유리 주사기를 사용하여 오른쪽 내측 전뇌 다발(MFB)에 일방적으로 투여합니다.
- 수술이 끝나면 두피 절개 부위를 봉합하고 따뜻한 (~ 37 ° C) 멸균 0.9 % 식염수 (~ 10 mL / kg, sc)로 동물을 재수 화합니다.
- 정위 프레임에서 동물을 제거하고 따뜻하게 된 회복 케이지에 넣으십시오. 의식을 회복 할 때까지 모니터링하십시오.
- 스테핑 테스트 46,47을 사용하여 병변 후 4 주 후에 도파민 성 병변의 효과를 평가하십시오.
알림: 이 검사에서 병변에 반대하는 앞다리의 무운동증은 병변에 반대하는 앞발과 함께 조정 단계의 수를 통해 평가됩니다. 반대쪽 앞다리와 함께 3 개 이하의 조정 단계를 나타내는 쥐는 추정되는 심각한 6-OHDA 병변 쥐48로 연구에 포함되었습니다.
2. L-DOPA 만성 치료
- 6-OHDA 병변 후 4 주 월요일에 만성 치료를 시작하십시오.
참고: AIM은 3주 동안 주 연속 3일(수요일, 목요일, 금요일) 동안 녹화되므로 월요일에 치료를 시작하는 것이 좋습니다. - 쥐를 새로 준비한 L-DOPA (피하 (sc), 1 mL / kg)와 벤세 라지드 염산염 (각각 5 mg / kg 및 12.5 mg / kg)으로 3 주 동안 월요일부터 금요일까지 하루에 한 번45.
참고: 일단 설정되면 AIM은 L-DOPA의 각 관리와 함께 나타납니다. 따라서, L-DOPA 투여는 3주 유도 기간 후에 주 2-4회 AIMs48의 안정한 발현을 유지하기에 충분하다.
3. 목표 기록 및 채점
- 09:00에서 17:00 사이에 실험을 수행합니다. 조사자가 쥐의 정체성과 약리학 적 치료를 전혀 알지 못하도록하십시오.
- 쥐를 투명한 실린더 (직경 20cm x 높이 40cm)에 조심스럽게 넣고 적어도 15 분 동안 순응하도록하십시오. 바닥이 침구 재료로 덮여 있는지 확인하십시오. 실험자가 가능한 모든 각도에서 동물을 관찰 할 수 있도록 거울은 실린더 뒤에 위치해야합니다.
참고: 실험당 한 마리 이상의 쥐가 있는 경우 각 쥐에 대해 실린더를 사용합니다. 세션 사이에 동물을 조작하면 행동 분석을 방해 할 수 있습니다. - 고해상도 비디오 카메라를 축, 사지 및 구강 언어 AIM을 보기 쉬운 방식으로 배치합니다. 이러한 실험 조건에서 회전 거동이 존재하기 때문에 실린더 뒤의 미러를 통해 360° 각도로 AIM을 추적할 수 있습니다. 삼각대를 사용하거나 카메라를 벤치에 직접 고정하십시오.
참고: 오로롤 언어 AIM은 특히 회전 행동의 발생률이 높은 경우 점수를 매기기 어려울 수 있습니다. 동물이 15° 각도로 있는 평면보다 약간 아래에 카메라를 배치하여 비디오를 캡처하면 이 움직임 하위 유형을 관찰하는 데 도움이 됩니다. - 실린더에서 동물을 부드럽게 제거하고 L-DOPA (5mg / kg과 12.5mg / kg의 벤세 라지드, sc.)를 투여합니다.
- 동물을 실린더에 다시 넣고 L-DOPA 주입 후 AIM을 추적하는 타이머를 시작합니다. 비디오 카메라를 사용하여 L-DOPA 주입 후 180분 동안 AIM을 기록합니다. 분석은 동물을 직접 관찰하여 수행 할 수 있지만 오프라인 채점이 선호됩니다.
알림: L-DOPA 투여 후 정확한 시간에 AIM을 채점할 수 있도록 타이머도 비디오로 녹화되었는지 확인하십시오. - 처음에설명된 대로 L-DOPA 주입 후 최대 180분까지 30분 간격으로 AIM을 채점합니다(정의는 표 1 참조). 점수는 1-2분 에포크에 걸쳐 주어져야 하며 축, 사지 또는 구강 언어로 분류되어야 합니다(그림 1).
- 심각도와 진폭에 대한 각 AIM 및 속성 점수를 주의 깊게 관찰합니다. 지침은 표 1 을 사용하십시오. 사육, 킁킁거리기, 몸단장, 갉아먹는 것과 같은 정상적인 행동을 등급에 포함하지 마십시오. 총 6 개의 관찰 기간 (30, 60, 90, 120, 150 및 180 분)이 있습니다.
| 하위 |
| 축 방향 : 머리, 목 및 몸통의 비틀림 |
| 사지 : 원위부와 근위 앞다리의 비자발적 움직임 |
| 구강 언어 : 구강 안면 근육의 비자발적 움직임 |
| 심각도 |
| 0: 없음 |
| 1: 간헐적(중단 포함, 관찰 시간의 절반 미만에 존재) |
| 2: 자주(중단되지만 관찰 시간의 절반 이상에 있음) |
| 3: 지속적이지만 외부 감각 자극에 의해 중단됨 |
| 4 : 지속적이고 외부 감각 자극에 의해 중단되지 않음 |
| 진폭 |
| 축 |
| 1: 약 30° 각도에서 머리와 목의 비틀림 |
| 2: 약 30° < 각도 ≤ 60°에서 머리와 목의 비틀림 |
| 3: 약 60° < 각도에서 90° 각도≤ 머리, 목 및 상부 몸통의 비틀림 |
| 4: 머리, 목, 몸통이 90° 각도로 비틀> 종종 쥐가 균형을 잃게 합니다. |
| 사지 |
| 1 : 원위 앞다리의 작은 비자발적 움직임 |
| 2: 원위부와 근위 앞다리의 전위를 유발하는 저진폭의 움직임 |
| 3 : 어깨 근육을 포함한 전체 사지의 비자발적 움직임 |
| 4: 종종 탄도와 유사한 강한 사지와 어깨 움직임 |
| 오로롤링 |
| 1 : 구강 안면 근육의 작은 비자발적 움직임 |
| 2 : 혀 돌출이있는 높은 진폭의 구강 안면 운동 |
표 1: AIMS 정의 및 등급 기준.
그림 1: 각 AIM 하위 유형을 보여주는 일련의 사진. (A에서 A'까지") 다양한 각도에서 근긴장과 유사한 움직임을 보여주는 축 방향 AIM입니다(A: 30° 각도, A': 30° < 각도 ≤ 60°, A": 60° < 각도≤ 90° 및 A'": > 90° 각도). (B에서 B로") 원위(B 및 B')와 전체 앞다리(어깨, B 포함)의 비자발적 움직임을 보여주는 사지 AIM (검은색 화살표"). (C) 혀 돌출부가있는 높은 진폭의 구강 언어 AIM (빨간색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 데이터 분석
- 앞서 설명한 대로 L-DOPA 투여 후 각 관찰 기간(즉, 6개의 관찰 기간)에 대한 심각도 및 진폭 점수를 곱하여 축, 사지 또는 구강 언어 AIM 하위 유형을 계산합니다20. 한 동물이 한 번의 테스트 세션에서 축적 할 수있는 이론적 최대 점수는 240입니다 (관찰 기간 당 최대 점수는 40입니다. 자세한 내용은 표 1 참조).
- 만성 L-DOPA 투여 3주 동안 수요일, 목요일, 금요일에 기록된 6개의 관찰 기간 모두에 대한 AIM 점수를 플롯합니다(그림 2). AIM은 만성 L-DOPA 투여 3주 동안 각 점수 매일(그림 3) 또는 매주(그림 4)에 각 동물의 최대 점수를 나타내도록 요약할 수 있습니다.
- 통계 분석 접근 방식을 선택하기 전에 데이터에 정규 분포에 가까운 분포가 있는지 확인하십시오.
참고: AIM 등급 척도는 순서형 데이터로 구성되며 비모수 통계량으로 분석할 수 있습니다. 모수 테스트는 반복 테스트 세션40 후 실험 그룹 간의 AIM 점수를 비교할 때 널리 사용됩니다.
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Representative Results
쥐에서 관찰된 AIMs 패턴은 인간 및 비인간 영장류에서 관찰된 패턴에 비해 더 간단하고 제한적이지만, 이 모델은 만성 L-DOPA 투여에 의해 유도된 과운동 및 근긴장유사 운동을 모두 재현합니다. 여기에서는 3 주 (월요일부터 금요일) 동안 L-DOPA (벤세 라지드 12.5mg / kg과 결합 된 5mg / kg)로 만성적으로 처리 된 일방적 인 6-OHDA 병변 쥐 그룹 (n = 10)에서 수집 한 데이터를 제시합니다. 그림 2, 그림 3 및 그림 4 에 제시된 데이터는 동일한 동물에서 나온 것입니다.
그림 2 는 만성 L-DOPA 투여 3주 동안 축, 사지 및 구강 언어 AIM에 적용된 점수에 대한 시간 경과 분석을 보여줍니다. 특정 관찰 기간의 각 AIM 점수 하위 유형은 이 분석에서 심각도 및 진폭 점수의 곱셈으로 보고됩니다. 이러한 유형의 분석은 AIM의 시간적 프로파일을 방해하는 약물의 효과를 탐색하는 데 편리 할 수 있습니다.L-DOPA 유도 피크 용량 운동 이상증은 주사 후 120 분 후에 점진적으로 감소하면서 30-90 분 사이에 발생합니다 (그림 2).
그림 2: 6-OHDA 병변 쥐에게 3주 동안 만성 L-DOPA 투여(벤세라지드 12.5mg/kg과 결합된 5mg/kg) 동안 축, 사지 및 구강 언어 AIM을 보여주는 시간 경과 분석. (A) 축 방향, (B) 사지 및 (C) 구강 언어 AIM은 만성 L-DOPA 투여 3 주 동안 수요일, 목요일 및 금요일에 점수가 매겨졌습니다. 각 AIM 하위 유형은 6개의 관찰 기간 각각에 대한 심각도 곱하기 진폭의 곱셈으로 보고됩니다. 각 AIM 하위 유형은 개별적으로 분석하거나 (D)에 표시된대로 요약 할 수 있습니다. AIM의 최고 중증도는 만성 L-DOPA 투여의 첫 주 동안 점차적으로 증가 할 것입니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현하였다(n=10). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3은 그림 2에 묘사된 6개의 관찰 기간 모두에 대해 제시된 AIM 점수의 합계를 보여줍니다(데이터 세트는 쉽게 비교할 수 있도록 색상으로 구분됨). 이 분석은 만성 L-DOPA 투여 3주 동안 각 채점일(수요일, 목요일 및 금요일)에 각 동물의 최대 점수를 나타냅니다. 이러한 유형의 분석은 특히 AIM 점수가 만성 L-DOPA 투여의 2주 및 3주에 걸쳐 안정적이기 때문에 잠재적인 항이동성 프로파일을 가진 화합물의 효과를 탐색하는 데 유리할 수 있습니다. 또한, 주간 AIMs 점수 (그림 4)는 수요일, 목요일 및 금요일에 6-OHDA 병변 쥐에 기인 한 점수의 합으로부터 생성 될 수있다.
그림 3: 6-OHDA 병변 쥐에게 만성 L-DOPA 투여(5mg/kg과 벤세라지드 12.5mg/kg 결합) 3주 동안 개별 채점일에 대한 축, 사지 및 구강 언어 목표의 합계. 이 그림에서는 6개의 관찰 기간 각각에 제시된 AIM 점수(그림 2 범례의 세부 정보 참조)를 합산했습니다. 개별 데이터 세트는 그림 2에 표시된 데이터와 비교하기 위해 색상으로 구분되었습니다. 이 분석은 만성 L-DOPA 투여 3주 후 각 채점일(수요일 - W, 목요일 - T, 금요일 - F)에 각 동물의 최대 점수를 나타냅니다. (A) 축 방향, (B) 사지 및 (C) 구두 언어 목표. (D) 축, 사지 및 구강 언어 목표의 합. 단방향 반복 측정 ANOVA 및 Holm-Sidak 사후 테스트는 L-DOPA의 만성 투여에 걸쳐 AIM이 점진적으로 증가하는 것으로 나타났습니다. AIMs 점수는 만성 L-DOPA 투여 2주와 3주에 걸쳐 안정적입니다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 대 1주차 수요일(W)). 데이터는 평균 ± SEM으로 표현하였다(n=10). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 6-OHDA 병변 쥐에 대한 만성 L-DOPA 투여(벤세라지드 12.5mg/kg과 함께 5mg/kg)에 걸친 주간 축, 사지 및 구강 언어 AIM의 합계. 이 그림에서는 매주 득점한 AIM을 합산했습니다(수요일, 목요일, 금요일 - 그림 3 참조). 이 분석은 만성 L-DOPA 투여의 매주 각 동물의 최대 점수를 나타냅니다. (A) 축 방향, (B) 사지 및 (C) 구두 언어 목표. (D) 축, 사지 및 구강 언어 목표의 합. 단방향 반복 측정 ANOVA 및 Holm-Sidak 사후 테스트에서 L-DOPA의 만성 투여에 비해 AIM이 증가하는 것으로 나타났습니다(*p < 0.05 대 1주차). 데이터는 평균 ± SEM으로 표현하였다(n=10). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 MFB에서 6-OHDA의 일방적 미세주입에 의해 유도된 PD의 래트 모델에서 AIMs를 유도하고 분석하는 방법을 보여줍니다. 저용량의 L-DOPA (5mg / kg, 벤세 라지드 12.5mg / kg과 병용)를 매일 만성적으로 투여하면 치료 3 주 동안 AIM이 발생했습니다. 시간적 분석은 AIM의 현저한 증가를 나타냈으며, L-DOPA 투여 후 30분에서 90분 사이에 피크 용량 운동 이상증이 관찰됩니다. AIM은 축, 사지 및 구강 언어 근육에 영향을 미치는 반복적이고 목적없는 움직임입니다. 여기에 제시된 프로토콜과 데이터는 이전 문헌 22,23,49,50,51과 일치합니다.
축, 사지 및 구강 언어 AIMs 등급 척도는 설치류가 운동 장애와 유사한 움직임을 나타내는 시간(즉, 심각도)을 평가하고 이러한 움직임의 진폭을 나타내기 때문에 매우 민감합니다(20). AIM 점수는 다양한 시간 해상도로 표현할 수 있습니다(그림 2, 그림 3, 그림 4 참조)17,18,19,52. 여러 연구에서 AIM 개발에 대한 L-DOPA 용량의 역할을 다루었습니다. 저용량의 L-DOPA (5-20 mg / kg)의 만성 투여는 치료에 비해 AIM의 점진적인 발달을 선호하는 반면, 고용량의 L-DOPA (25 mg / kg 이상)는 AIM 23,25,27,53의 신속하고 강력한 발달을 초래합니다. 흥미롭게도, 중증 6-OHDA 병변 동물의 비율은 저용량의 L-DOPA40,49,53을 만성적으로 투여한 후 AIM이 발생하지 않을 수 있습니다(또는 매우 낮은 AIM 점수를 가질 수 있음). L-DOPA의 투여 경로를 고려하는 것도 필수적입니다. AIM은 유사한 발병, 시간 프로파일 및 중증도 등급40을 공유하지만, 복강 내 치료받은 쥐에서 용량 실패 에피소드가 자주 발생한다는 것이 입증되었습니다27. 또한, L-DOPA의 i.p. 투여는 혈장 수준의 개인간 변이를 생성했으며, 이는 SC 주사27 이후에는 관찰되지 않았다.
이 연구에서, AIM은 심각한 흑질 선조체 손상(도파민 고갈의 90% 이상)이 있는 동물에서 분명했습니다. 선조체 도파민 성 신경 분포의 다량의 손실은 병변(48)에 반대하는 앞다리로 수행되는 조정 단계의 수의 감소를 특징으로한다. 따라서 흑색 선조체 경로에서 중증 6-OHDA 병변으로 추정되는 동물을 선택하기 위해 스테핑 테스트를 권장합니다. 암페타민 유도 회전 테스트는 일반적으로 추정 6-OHDA 병변 쥐를 선택하는 데 사용됩니다. 암페타민은 손상되지 않은 선조체에서 도파민 방출을 증가시켜 신경 분포 선조체와 탈 신경 선조체 사이의 기존 불균형을 증가시킵니다. 그러나 312 6-OHDA 병변 쥐11 에서 수행 된 흥미로운 연구는 동측 흑질 pars compacta에서 암페타민 유도 회전과 티로신 하이드 록 실라 제 양성 세포 사이에 상관 관계가 없음을 밝혀 냈습니다. 이 같은 연구는 암페타민 유도 회전과 AIM의 중증도 사이에 나쁜 상관 관계가 있음을 보여주었습니다.
AIM의 현상학과 흑색 선조체 도파민 고갈 패턴 사이에는 명확한 관계가 있습니다20. 이 프로토콜에서 사용한 PD의 6-OHDA 쥐 모델은 MFB에 6-OHDA 주입 후 흑색 선조체 도파민 말단의 심각한 일방적 고갈을 일으킨다. 완전히 도파민이 고갈된 6-OHDA 병변 쥐는 부분적으로 도파민이 고갈된 동물에 비해 AIM 발병률이 더 높습니다. 6-OHDA 병변 및 만성 L-DOPA 투여 후 신경펩티드 다이노르핀 및 엔케팔린의 선조체 발현에 대한 상세한 분석은 다른 곳(45)에 기재되어 있고, 이전의 문헌23,25와 일치한다. 분자 수준에서, 이운동 설치류는 ΔFosB 전사 인자 26,32,33,54의 선조체 상향조절과 같은, PD 및 PD 환자의 비인간 영장류 모델에서 명백한 운동이상증과 관련된 분자 마커를 공유한다. 또한, PD의 설치류 모델은 PD 환자(56)의 푸타멘에서 관찰된 유사한 방식으로 L-DOPA 처리(55)에 반응하여 선조체에서 증가된 미세혈관 밀도를 나타낸다. LID의 설치류 모델은 NMDA 수용체 길항제 아만타딘 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 와 같은 클리닉에서 사용되는 항이동역학적 약리학적 접근법에 반응하며, 35,36,37, 38,39. 전체적으로 이러한 증거는 LID의 병태생리학을 특성화하고 항이동성 특성을 가진 화합물의 스크리닝을 위한 6-OHDA 쥐 모델의 얼굴 타당성과 예측 유효성을 확인합니다. LID의 마우스 모델은 또한 형질전환 마우스에서 LID의 여러 측면을 연구하는 데 유용한 도구입니다. LID의 마우스 모델에 대한 프로토콜은 상이한 연구 그룹30,57,58로부터의 논문에서 찾을 수 있다.
LID의 6-OHDA 병변 설치류 모델에는 한계가 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 6-OHDA-유도된 도파민성 고갈은 PD 환자5에서 니그로선조체 고갈의 진행성 성질에 비해 급성이다. 또한, 약물의 투여량을 늘리는 것은 L-DOPA에 의해 생성되는 유익한 효과를 방해하거나 동물 모델에서 관찰되지 않았을 수 있는 부작용을 유발할 수 있기 때문에 환자에서 항이운동제를 사용하기 위한 우수한 치료 창을 찾는 것이 어려울 수 있다(59,60). LID의 래트 모델의 또 다른 한계는 설치류에서의 AIM과 환자 및 비인간 영장류에서 관찰되는 choreiform 운동의 발현 사이의 물리적 유사성의 부족이다 10,61,62. 여기에 제시된 프로토콜의 또 다른 잠재적 한계는 L-DOPA 투여 후 30분마다 AIM이 점수가 매겨진다는 것이지만, 실험자가 L-DOPA 투여 후 180분 동안 모든 동물을 비디오테이프로 녹화하면 이 문제를 관리할 수 있습니다. 이어서, 실험자는 더 빈번한 스코어링을 위해 스코어링 프로토콜을 조정할 수 있다(예를 들어, 매 10 또는 20분마다). 이러한 접근법은 AIMs 시간 경과의 보다 동적인 그림을 필요로 하는 실험에서 유리하다(예를 들어, AIMs 스코어링 및 생체내 전기생리학적 또는 신경화학적 기록의 조합).
결론적으로, LID의 6-OHDA 래트 모델은 질병의 병태생리학을 재현하고 임상적으로 사용되는 약물에 의해 조절될 수 있는 AIM을 개발한다. 한계가 있지만 LID의 6-OHDA 쥐 모델은 여전히 번역 가능성이 있는 효과적인 항이동성 개입을 식별하는 데 매우 귀중한 전임상 도구입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 상파울루 연구 재단 (FAPESP, 보조금 2017/00003-0)의 지원을 받았습니다. 고등 교육 인력 향상을 위한 조정(CAPES)에 감사드립니다. Anthony R. West 박사, Heinz Steiner 박사, Kuei Y. Tseng 박사의 지원과 멘토링에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-hydroxydopamine hydrobromide | Sigma-Aldrich, USA | H6507 | Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals |
| Benzerazide hydrochloride | Sigma | B7283 | Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor |
| Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI) 2.8mm B | HIKVISION | DS-2CE16C0T-IRP | Camera used to record all behavior |
| Imipramine hidrochloride | Alfa Aesar | J63723 | Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA |
| Ketamine hydrochloride | Ceva Animal Health | Anesthesia for surgical intervention | |
| L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) | Cayman Chemical Company | 16149 | Dopamine precursor |
| Mirrors | Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions | ||
| Needles 0.30 x 13 mm | PrecisionGlide | Needles used to inject drugs | |
| Sodium chloride (NaCl) | Samtec | Salt | |
| Syringes 1 ml Sterile | BD Plastipak | Syringes used to inject drugs | |
| Transparent cylinders | Used to record animal behavior during experiments | ||
| Xylazine hydrochloride | Ceva Animal Health | Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention |
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