Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rating L-DOPA-induceret dyskinesier i den ensidigt 6-OHDA-læsionerede rottemodel af Parkinsons sygdom

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Gnavermodeller af L-DOPA-inducerede dyskinesier er uvurderlige værktøjer til at identificere terapeutiske interventioner for at dæmpe udviklingen eller lindre de manifestationer, der opstår på grund af gentagen administration af L-DOPA. Denne protokol demonstrerer, hvordan man inducerer og analyserer dyskinetisk-lignende bevægelser i den ensidigt 6-OHDA-læsionerede rottemodel af Parkinsons sygdom.

Abstract

L-DOPA-inducerede dyskinesier (LID'er) henviser til motoriske komplikationer, der opstår ved langvarig L-DOPA-administration til patienter med Parkinsons sygdom (PD). Det mest almindelige mønster, der observeres i klinikken, er topdosis dyskinesi, som består af kliniske manifestationer af choreiform, dystoniske og ballistiske bevægelser. 6-hydroxydopamin (6-OHDA) rottemodellen af PD efterligner flere egenskaber ved LID'er. Efter gentagen L-DOPA-administration udviser 6-OHDA-læsionerede rotter dyskinetisk-lignende bevægelser (f.eks. Unormale ufrivillige bevægelser, AIM'er). Denne protokol demonstrerer, hvordan man inducerer og analyserer AIM'er hos 6-OHDA-læsionerede rotter med 90% -95% dopaminerg udtømning i nigrostriatalvejen. Gentagen administration (3 uger) af L-DOPA (5 mg/kg kombineret med 12,5 mg/kg benserazid) kan fremkalde udviklingen af AIM'er. Tidsforløbsanalysen afslører en signifikant stigning i AIM'er efter 30-90 min (topdosis dyskinesi). Gnavermodeller af LID'er er et vigtigt præklinisk værktøj til at identificere effektive antidyskinetiske interventioner.

Introduction

Dopaminprecursoren L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) repræsenterer den mest effektive behandling af de motoriske symptomer på Parkinsons sygdom (PD)1. L-DOPA-behandling kan forbedre motoriske symptomer forbundet med PD, men mister effektivitet med tiden. Motoriske udsving såsom "afslidningsudsving" eller "dosisafslutningsforringelse" manifesterer sig klinisk som en forkortet varighed af effekten af enkelte L-DOPA-doser2. I andre tilfælde består kliniske manifestationer af langsomme vridningsbevægelser og unormale stillinger (dystoni)3 og opstår, når dopaminniveauet er lavt (dystoni uden for perioden)4. På den anden side vises L-DOPA-inducerede dyskinesier (LID'er), når dopaminniveauerne i plasmaet og hjernen er høje5.

LID'er producerer svækkende bivirkninger, der inkluderer motoriske komplikationer såsom choreiform, dystoniske og ballistiske6-satser. Når de er etableret, forekommer LID'er efter hver L-DOPA-administration. Motoriske komplikationer forekommer hos 40% -50% af PD-patienter, der gennemgår L-DOPA-behandling i 5 år, og forekomsten stiger over årene7. Selvom de patofysiologiske mekanismer, der er involveret i udviklingen af LID'er hos PD-patienter, endnu ikke er fuldt belyst, er omfanget af dopaminerg denervation, pulsatil L-DOPA-administration, nedstrøms ændringer i striatale proteiner og gener og abnormiteter i ikke-dopamintransmittersystemer faktorer, der bidrager til udviklingen af disse uønskede bivirkninger 6,8,9,10.

Neurotoksinet 6-hydroxydopamin (6-OHDA) er et velkarakteriseret værktøj til at studere PD hos gnavere11,12,13,14. Da 6-OHDA ikke krydser blod-hjerne-barrieren, skal den injiceres direkte i den nigrostriatale vej. 6-OHDA-induceret dopaminerg udtømning er koncentrations- og stedafhængig15. Ensidig administration af 6-OHDA ved det mediale forhjernebundt (MFB) kan producere alvorlig (>90%) nigrostriatal skade hos gnavere16,17,18,19. Kronisk administration af L-DOPA til svær ensidigt 6-OHDA-læsionerede gnavere forårsager udseendet af dyskinetisk-lignende bevægelser kaldet unormale ufrivillige bevægelser (AIM'er). Dyskinetisk-lignende bevægelser hos gnavere deler lignende molekylære, funktionelle og farmakologiske mekanismer relateret til LID'er hos PD-patienter5. Derfor er 6-OHDA-læsionerede rotter20 og mus21 værdifulde prækliniske modeller til undersøgelse af LID'er. Når de behandles kronisk (7-21 dage) med terapeutiske doser af L-DOPA (5-20 mg/kg), viser ensidigt 6-OHDA-læsionerede rotter og mus en gradvis udvikling af AIM'er, der påvirker forbens-, bagagerums- og orofacialmusklerne i modsætning til læsionen 17,18,19,20,22,23,24 . Disse bevægelser præsenteres på et tidsforløb svarende til L-DOPA-induceret topdosis dyskinesier hos PD-patienter25 og er karakteriseret ved hyperkinetiske bevægelser og dystoni5. AIM'er scores normalt baseret på deres sværhedsgrad (f.eks. Når et specifikt AIM er til stede) og amplitude (f.eks. Karakteriseret ved amplituden af hver bevægelse)5,23,25.

6-OHDA-læsionerede gnavermodeller af LID'er har ansigtsvaliditet (dvs. modellen har flere egenskaber, der ligner den menneskelige tilstand)5,11,26,27,28. Gnaver AIM'er, svarende til hvad der forekommer hos PD-patienter, ses som hyperkinetiske (forben og orolinguale) og dystoniske (aksiale) bevægelser29 og efterligner dyskinesi med topdosis. På molekylært og funktionelt niveau deler gnavermodeller mange patologiske egenskaber med PD-patienter5, såsom opregulering af FosB / ΔFosB 19,26,30,31,32,33 og serotonintransportør (SERT)34,35 . Med hensyn til prædiktiv validitet har lægemidler, der reducerer LID'er hos PD-patienter (f.eks. N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptorantagonisten amantadin), antidyskinetisk effekt i gnavermodellen 22,36,37,38,39.

Gnaver AIM's rating skala blev oprettet baseret på fire AIM'er undertyper, der omfatter AIM'er, der påvirker hoved, nakke og bagagerum (aksiale AIM'er), hyperkinetiske forbensbevægelser (lemmer AIM'er) og dyskinetisk-lignende orolinguale bevægelser (orolinguale AIM'er). Selvom kontralateral rotation (lokomotiv-AIM'er) også er til stede i ensidigt læsionerede gnavere 20,22,23,25,40, er det ikke blevet scoret som en dyskinetisk-lignende bevægelse, da den muligvis ikke repræsenterer et specifikt mål for LIDs 22,37,41.

Her vil vi beskrive, hvordan man inducerer og analyserer dyskinetisk-lignende bevægelser (aksiale, lemmer og orolinguale AIM'er) i den svære (>90%) ensidigt 6-OHDA-læsionerede rottemodel af PD. Vi organiserede vores protokol baseret på den tidligere litteratur og vores laboratorieekspertise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med Den etiske komité for Det Filosofiske, Naturvidenskabelige Fakultet og Breve i Ribeirão Preto (CEUA / FFCLRP 18.5.35.59.5).

1. 6-OHDA læsion

  1. Brug Sprague-Dawley hanrotter, der vejer 200-250 g i begyndelsen af forsøgene (6 uger). Opstald dyrene (2-3 pr. bur) under standard laboratorieforhold (12:12 h lys/mørk cyklus, lys tændt kl. 06:00, temperaturstyrede faciliteter (22-24 °C), med mad og vand til rådighed ad libitum.
    BEMÆRK: En komplet beskrivelse af, hvordan man genererer alvorlige 6-OHDA-læsionerede rotter, er beskrevet andetsteds42.
  2. Akklimatisere dyr på passende vis, inden forsøgsproceduren påbegyndes.
  3. Administrer (intraperitonealt, i.p.) noradrenalintransportørhæmmeren imipramin (20 mg/kg, opløst i 0,9% saltopløsning) 30 minutter før operationen.
    BEMÆRK: Administration af imipramin vil øge 6-OHDA-selektiviteten for dopaminerge neuroner.
  4. Administreres ketamin/xylazin (70/10 mg/kg) intraperitonealt.
  5. Sørg for, at dyret er dybt bedøvet af manglen på respons på tåspidsning og placeret i en udsat position i det stereotaxiske apparat på toppen af en varmepude.
  6. Fjern pelsen på hovedet og desinficer det kirurgiske område 3 gange, skiftevis mellem en jodbaseret skrubbe og alkohol.
  7. Brug en skalpel til at lave et snit (ca. 1 cm) i det område, hvor mikroinjektionen vil forekomme.
  8. Rengør kranieområdet med vatpinde, og sørg for, at Bregma og Lambda er udsatte.
  9. Sørg for, at MFB stereotaxiske koordinater er taget fra bregma43,44,45: -4,3 mm anterior, 1,6 mm lateral (højre side) og 8,3 mm ventral (fra dura mater).
  10. 6-OHDA administreres med en hastighed på 0,4 μL/min (10 μg i 4 μL saltopløsning indeholdende 0,1% ascorbinsyre) ensidigt i det højre mediale forhjernebundt (MFB) ved hjælp af en 50 μL Hamilton glassprøjte.
  11. Ved afslutningen af operationen sutureres hovedbundssnittet og rehydrerer dyret med varm (~ 37 ° C) steril 0,9% saltopløsning (~ 10 ml / kg, s.c.).
  12. Fjern dyret fra stereotaxisk ramme og læg det i et opvarmet genopretningsbur. Overvåg, indtil bevidstheden er genvundet.
  13. Vurder effektiviteten af den dopaminerge læsion 4 uger efter læsion ved hjælp af en trintest46,47.
    BEMÆRK: I denne test vurderes akinesi af forbenet kontralateralt til læsionen gennem antallet af justeringstrin med forpoten kontralateral til læsionen. Rotter, der præsenterer tre eller færre justeringstrin med den kontralaterale forben, indgår i undersøgelsen som formodede alvorligt 6-OHDA-læsionerede rotter48.

2. L-DOPA kronisk behandling

  1. Start den kroniske behandling på mandag, 4 uger efter 6-OHDA læsion.
    BEMÆRK: Da AIM'er vil blive videooptaget i 3 på hinanden følgende dage om ugen (onsdag, torsdag og fredag) i 3 uger, anbefales det at starte behandlingen mandag.
  2. Behandl rotterne med frisklavet L-DOPA (via subkutan (s.c.), 1 ml/kg) plus benserazidhydrochlorid (henholdsvis 5 mg/kg og 12,5 mg/kg) i 3 uger, én gang dagligt fra mandag til fredag45.
    BEMÆRK: Når de er etableret, vil AIM'er manifestere sig med hver administration af L-DOPA. Derfor er L-DOPA-administration 2-4 gange om ugen efter 3-ugers induktionsperioden tilstrækkelig til at opretholde et stabilt udtryk for AIMs48.

3. AIM'er registrering og scoring

  1. Udfør eksperimenter mellem 09:00 og 17:00 h. Sørg for, at investigator er helt uvidende om rotternes identitet og farmakologiske behandling.
  2. Sæt forsigtigt rotten inde i en gennemsigtig cylinder (20 cm diameter x 40 cm høj) og lad den akklimatisere i mindst 15 min. Sørg for, at gulvet er dækket af strøelsesmaterialet. Spejle skal placeres bag cylinderen, så forsøgslederen kan observere dyret fra alle mulige vinkler.
    BEMÆRK: Hvis der er mere end én rotte pr. forsøg, skal du bruge en cylinder til hver rotte. Manipulation af dyrene mellem sessioner kan forstyrre adfærdsanalysen.
  3. Placer et videokamera med høj opløsning på en måde, der favoriserer visning af aksiale, lemmer og orolinguale AIM'er. Da rotationsadfærd er til stede under disse eksperimentelle forhold, vil spejlene bag cylinderen tillade sporing af AIM'er i en vinkel på 360°. Brug et stativ, eller fastgør kameraet direkte til bænken.
    BEMÆRK: Orolinguale AIM'er kan være udfordrende at score, især hvis der er en høj forekomst af rotationsadfærd. Optagelse af videoer med kameraet placeret lidt under flyet, hvor dyrene er i en 15 ° vinkel, hjælper med at observere denne bevægelsesundertype.
  4. Fjern forsigtigt dyret fra cylinderen, og indgift L-DOPA (5 mg/kg kombineret med 12,5 mg/kg benserazid, s.c.).
  5. Sæt dyret tilbage i cylinderen, og start en timer for at spore AIM'er efter L-DOPA-injektion. Brug et videokamera til at optage AIM'er i 180 minutter efter injektion af L-DOPA. Selvom analysen kan udføres ved direkte observation af dyret, foretrækkes offline scoring.
    BEMÆRK: Sørg for, at timeren også er optaget på video, så AIM'er kan scores på præcise tidspunkter efter L-DOPA-administration.
  6. Score AIM'er med 30 minutters intervaller op til 180 minutter efter L-DOPA-injektion (se tabel 1 for definitioner) som oprindeligt beskrevet20,23. Scores skal gives over 1-2 min epoker og klassificeres som aksiale, lemmer eller orolinguale (figur 1).
  7. Overhold omhyggeligt hvert AIM og attribut score for sværhedsgrad og amplitude. Brug tabel 1 til instruktioner. Medtag ikke normal adfærd, såsom opdræt, sniffing, pleje og gnave i vurderingen. Der vil være i alt seks observationsperioder (30, 60, 90, 120, 150 og 180 min).
UNDERTYPER
Aksial: vridning af hoved, nakke og bagagerum
Limb: ufrivillige bevægelser af både distal og proximal forben
Orolingual: ufrivillige bevægelser af de orofaciale muskler
ALVORLIGHED
0: Fraværende
1: Lejlighedsvis (med afbrydelser, til stede på mindre end halvdelen af observationstiden)
2: Hyppig (med afbrydelser, men til stede i mere end halvdelen af observationstiden)
3: Kontinuerlig, men afbrudt af eksterne sensoriske stimuli
4: Kontinuerlig og ikke afbrudt af eksterne sensoriske stimuli
AMPLITUDE
Aksial
1: Vridning af hoved og hals i ca. 30° vinkel
2: Vridning af hoved og hals i ca. 30° < vinkel ≤ 60°
3: Torsion af hoved, hals og øvre bagagerum i ca. 60° < vinkel ≤ 90°
4: Vridning af hoved, nakke og bagagerum i > 90° vinkel, hvilket ofte får rotten til at miste balancen
Medlem
1: Små ufrivillige bevægelser af det distale forben
2: Bevægelser af lav amplitude, der forårsager translokation af både distal og proksimal forben
3: Ufrivillige bevægelser af hele lemmen, herunder skuldermuskler
4: Stærke lemmer og skulderbevægelser, der ofte ligner ballisme
Orolingual
1: Små ufrivillige bevægelser af de orofaciale muskler
2: Orofaciale bevægelser med høj amplitude med tungefremspring

Tabel 1: Definition af AIMS og vurderingskriterier.

Figure 1
Figur 1: Sekvens af fotos, der viser hver AIM-undertype. (A til A'") Aksial AIM, der viser dystoniske bevægelser i forskellige vinkler (A: 30° vinkel, A': 30° < vinkel ≤ 60°, A": 60° < vinkel ≤ 90° og A'": > 90° vinkel). (B til B") Limb AIM (sorte pile), der viser ufrivillige bevægelser af distal (B og B') og hele forbenet (inklusive skulder, B). (C) Orolingual AIM (rød pil) med høj amplitude med tungefremspring. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Dataanalyse

  1. Beregn aksiale, lem- eller orolinguale AIM-undertyper ved at gange sværhedsgraden og amplitudescorerne for hver observationsperiode efter L-DOPA-administration (dvs. seks observationsperioder) som tidligere beskrevet20. Den teoretiske maksimale score, som et dyr kan akkumulere i en testsession, er 240 (maksimal score pr. observationsperiode er 40, se tabel 1 for detaljer).
  2. Plot AIM'er scorer for alle de seks observationsperioder, der er registreret onsdag, torsdag og fredag i løbet af de 3 ugers kronisk L-DOPA-administration (figur 2). AIM'er kan opsummeres for at angive hvert dyrs maksimale score på hver scoringsdag (figur 3) eller hver uge (figur 4) i løbet af de 3 uger med kronisk L-DOPA-administration.
  3. Kontroller, om dataene har en tæt på normal fordeling, før du vælger den statistiske analysemetode.
    BEMÆRK: AIM'er rating skalaer består af ordinære data og kan analyseres med ikke-parametriske statistikker. Parametriske tests bruges i vid udstrækning, når man sammenligner AIM'ers score på tværs af eksperimentelle grupper efter gentagne testsessioner40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Selvom de AIM'er, der observeres hos rotter, er enklere og begrænsede sammenlignet med dem, der observeres hos mennesker og ikke-menneskelige primater, reproducerer denne model både hyperkinetiske og dystonlignende bevægelser induceret af kronisk L-DOPA-administration. Her præsenterer vi data indsamlet fra en gruppe (n = 10) af ensidigt 6-OHDA-læsionerede rotter kronisk behandlet med L-DOPA (5 mg / kg kombineret med 12,5 mg / kg benserazid) i 3 uger (mandag til fredag). Bemærk, at dataene i figur 2, figur 3 og figur 4 er fra de samme dyr.

Figur 2 viser tidsforløbsanalysen for scoringer anvendt på aksiale, lemmer og orolinguale AIM'er over 3 ugers kronisk L-DOPA-administration. Hver AIM-score-undertype i en bestemt observationsperiode rapporteres som multiplikationen af sværhedsgrad og amplitudescore i denne analyse. Denne type analyse kan være praktisk at undersøge effekten af lægemidler, der forstyrrer den tidsmæssige profil af AIM'er.Bemærk, at L-DOPA-inducerede dyskinesier med topdosis forekommer mellem 30-90 minutter med et gradvist fald efter 120 minutter efter injektion (figur 2).

Figure 2
Figur 2: Tidsforløbsanalyse, der viser aksiale, lemmer og orolinguale AIM'er over 3 ugers kronisk L-DOPA-administration (5 mg / kg kombineret med 12,5 mg / kg benserazid) til 6-OHDA-læsionerede rotter. (A) Aksial, (B) lem og (C) orolinguale AIM'er blev scoret onsdag, torsdag og fredag over 3 ugers kronisk L-DOPA-administration. Hver AIM-undertype rapporteres som multiplikationen af sværhedsgradstidsamplitude på hver af de seks observationsperioder. Hver AIM-undertype kan analyseres individuelt eller opsummeres som angivet i (D). Bemærk, at den højeste sværhedsgrad af AIM'erne gradvist vil stige i løbet af den første uge af kronisk L-DOPA-administration. Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM (n = 10). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3 viser summen af AIM'ers score for alle de seks observationsperioder, der er afbildet i figur 2 (datasæt er farvekodet for nemme sammenligninger). Denne analyse angiver hvert dyrs maksimale score på hver scoringsdag (onsdag, torsdag og fredag) i løbet af de 3 ugers kronisk L-DOPA-administration. Denne type analyse kan være en fordel for at undersøge effekten af forbindelser med potentielle antidyskinetiske profiler, især fordi AIM's score er stabil over uge 2 og 3 af kronisk L-DOPA administration. Desuden kan ugentlige AIM-score (figur 4) genereres ud fra summen af scorer, der tilskrives 6-OHDA-læsionerede rotter onsdag, torsdag og fredag.

Figure 3
Figur 3: Summen af aksiale, lemmer og orolinguale AIM'er på individuelle scoringsdage over 3 ugers kronisk L-DOPA-administration (5 mg/kg kombineret med 12,5 mg/kg benserazid) til 6-OHDA-læsionerede rotter. I denne figur blev AIM-scorerne i hver af de seks observationsperioder (se detaljer i figur 2-forklaringen) opsummeret. Individuelle datasæt blev farvekodet for at sammenligne med de data, der vises i figur 2. Denne analyse angiver hvert dyrs maksimale score på hver scoringsdag (onsdag - W, torsdag - T og fredag - F) efter 3 ugers kronisk L-DOPA-administration. (A) Aksial, (B) lem og (C) orolinguale AIM'er. (D) Summen af aksiale, lemmer og orolinguale AIM'er. Envejs gentagne foranstaltninger ANOVA og Holm-Sidak post-hoc test afslørede, at AIM'er stiger gradvist over kronisk administration af L-DOPA. Bemærk, at AIM-score er stabil i uge 2 og 3 ved kronisk L-DOPA-administration (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. onsdag (W) i uge 1). Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM (n = 10). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Summen af ugentlige aksiale, lemmer og orolinguale AIM'er under kronisk L-DOPA-administration (5 mg/kg kombineret med 12,5 mg/kg benserazid) til rotter med 6 OHDA-læsioner. I dette tal blev AIM'er scoret hver uge (onsdag, torsdag og fredag - se figur 3) opsummeret. Denne analyse angiver hvert dyrs maksimale score på hver uge med kronisk L-DOPA-administration. (A) Aksial, (B) lem og (C) orolinguale AIM'er. (D) Summen af aksiale, lemmer og orolinguale AIM'er. Envejs gentagne foranstaltninger ANOVA og Holm-Sidak post-hoc test afslørede, at AIM'er stiger i forhold til kronisk administration af L-DOPA (* p < 0,05 vs. uge 1). Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM (n = 10). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol demonstrerer, hvordan man inducerer og analyserer AIM'er i rottemodellen af PD induceret ved ensidig mikroinjektion af 6-OHDA i MFB. Kronisk daglig administration af lave doser af L-DOPA (5 mg/kg kombineret med 12,5 mg/kg benserazid) medførte udvikling af AIM'er i løbet af de 3 ugers behandling. Tidsmæssig analyse afslørede en signifikant stigning i AIM'er, og topdosis dyskinesi observeres mellem 30 og 90 minutter efter L-DOPA-administration. AIM'er er gentagne og formålsløse bevægelser, der påvirker aksiale, lemmer og orolinguale muskler. Protokollen og de data, der præsenteres her, stemmer overens med den tidligere litteratur 22,23,49,50,51.

Den aksiale, lem- og orolinguale AIM-vurderingsskala er meget følsom, fordi den vurderer den tid (dvs. sværhedsgrad), som gnavere viser dyskinetisk-lignende bevægelser og angiver amplituden af disse bevægelser20. AIM'ers score kan udtrykkes i forskellige tidsmæssige opløsninger (se figur 2, figur 3, figur 4)17,18,19,52. Flere undersøgelser har behandlet rollen som L-DOPA dosering på udviklingen af AIM'er. Kronisk administration af lavere doser af L-DOPA (5-20 mg/kg) favoriserer en gradvis udvikling af AIM'er frem for behandlingen, mens høje doser af L-DOPA (25 mg/kg eller mere) resulterer i en hurtig og robust udvikling af AIM'er 23,25,27,53. Interessant nok kan en andel af alvorlige 6-OHDA-læsionerede dyr muligvis ikke udvikle AIM'er (eller have meget lave AIM'er) efter kronisk administration af lave doser af L-DOPA40,49,53. Det er også vigtigt at overveje L-DOPA's administrationsvej. Selvom AIM'er deler lignende debut, tidsprofil og sværhedsgrad40, er det blevet påvist, at dosissvigtepisoder ofte forekom hos rotter behandlet intraperitonealt27. Også i.p. administration af L-DOPA producerede interindividuelle variationer i plasmaniveauer, en effekt, der ikke blev observeret efter SC-injektioner27.

I denne undersøgelse var AIM'er tydelige hos dyr med alvorlig nigrostriatal skade (over 90% af dopaminerg udtømning). Massivt tab af striatal dopaminerg innervation er kendetegnet ved en reduktion i antallet af justeringstrin udført med forbenet kontralateralt til læsionen48. Derfor anbefaler vi trintesten til at vælge dyr med formodede alvorlige 6-OHDA-læsioner ved nigrostriatalvejen. Den amfetamininducerede rotationstest bruges almindeligvis til at vælge formodede 6-OHDA-læsionerede rotter. Amfetamin øger dopaminfrigivelsen i det intakte striatum, og dermed øger det den eksisterende ubalance mellem det innerverede og denerverede striatum. En interessant undersøgelse udført på 312 6-OHDA-læsionerede rotter11 afslørede imidlertid ingen sammenhæng mellem amfetamininduceret rotation og tyrosinhydroxylasepositive celler i den ipsilaterale substantia nigra pars compacta. Den samme undersøgelse viste en dårlig sammenhæng mellem amfetamininduceret rotation og sværhedsgraden af AIM'er.

Der er et klart forhold mellem fænomenologien af AIM'er og mønsteret af nigrostriatal dopaminerg udtømning20. 6-OHDA-rottemodellen af PD, vi brugte i denne protokol, udvikler alvorlig ensidig udtømning af nigrostriatale dopaminterminaler efter 6-OHDA-infusion i MFB. Fuldt dopaminudtømte 6-OHDA-læsionerede rotter har en højere forekomst af AIM'er sammenlignet med delvist dopaminudtømte dyr. En detaljeret analyse af striatal ekspression af neuropeptiderne dynorphin og enkephalin efter 6-OHDA-læsion og kronisk L-DOPA-administration er beskrevet andetsteds45 og er i overensstemmelse med tidligere litteratur23,25. På molekylært niveau deler dyskinetiske gnavere molekylære markører forbundet med dyskinesi, der er tydelig i ikke-menneskelige primatmodeller af PD- og PD-patienter, såsom striatal opregulering af ΔFosB-transkriptionsfaktor 26,32,33,54. Gnavermodellen af PD viser også øget mikrofartøjstæthed i striatum som reaktion på L-DOPA-behandling55 på en lignende måde observeret i putamen hos PD-patienter56. Gnavermodeller af LID'er reagerer på antidyskinetiske farmakologiske tilgange, der anvendes i klinikken, såsom NMDA-receptorantagonisten amantadin 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37, 38,39. Alt i alt bekræfter disse beviser ansigtsvaliditeten og prædiktiv validitet af 6-OHDA-rottemodellen for at karakterisere patofysiologien af LID'er og til screening af forbindelser med antidyskinetiske egenskaber. Musemodellen af LID'er er også et værdifuldt værktøj til at studere flere aspekter af LID'er hos transgene mus. Protokoller til musemodellen af LID'er kan findes i papirer fra forskellige forskningsgrupper 30,57,58.

Det er vigtigt at bemærke, at den 6-OHDA-læsionerede gnavermodel af LID'er har begrænsninger. 6-OHDA-induceret dopaminerg udtømning er akut sammenlignet med den progressive karakter af nigrostriatal udtømning hos PD-patienten5. Det kan også være udfordrende at finde et fremragende terapeutisk vindue til brug af et antidyskinetisk lægemiddel hos patienter, fordi øget dosering af et lægemiddel kan forstyrre den gavnlige virkning produceret af L-DOPA eller fremkalde bivirkninger, der måske ikke er blevet observeret i dyremodellen59,60. En anden begrænsning af rottemodellen for LID'er er manglen på fysisk lighed mellem AIM'er hos gnavere og manifestationen af de choreiformbevægelser, der observeres hos patienter og ikke-menneskelige primater 10,61,62. En anden potentiel begrænsning af protokollen, der præsenteres her, er, at AIM'er scores hvert 30. minut efter L-DOPA-administration, men dette problem kan håndteres, hvis eksperimentatoren videobånder alle dyr i 180 minutter efter L-DOPA-administration. Eksperimentatoren kan derefter justere scoringsprotokollen for hyppigere scoring (f.eks. hvert 10. eller 20. minut). Denne tilgang er fordelagtig i eksperimenter, der kræver et mere dynamisk billede af AIM's tidsforløb (f.eks. kombinationen af AIM'er-scoring og in vivo elektrofysiologiske eller neurokemiske optagelser).

Afslutningsvis reproducerer 6-OHDA-rottemodellen af LID sygdommens patofysiologi og udvikler AIM'er, der kan moduleres af klinisk anvendte lægemidler. Selvom det har begrænsninger, repræsenterer 6-OHDA-rottemodellen af LID stadig et uvurderligt præklinisk værktøj til at identificere effektive antidyskinetiske interventioner med translationelt potentiale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af São Paulo Research Foundation (FAPESP, bevilling 2017/00003-0). Vi er taknemmelige for koordineringen til forbedring af personale på videregående uddannelser (CAPES). Vi takker Dr. Anthony R. West, Dr. Heinz Steiner og Dr. Kuei Y. Tseng for støtte og vejledning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-hydroxydopamine hydrobromide Sigma-Aldrich, USA H6507 Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride Sigma B7283 Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B HIKVISION DS-2CE16C0T-IRP Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride Alfa Aesar J63723 Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride Ceva Animal Health Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) Cayman Chemical Company 16149 Dopamine precursor
Mirrors Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm PrecisionGlide Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl) Samtec Salt
Syringes 1 ml Sterile BD Plastipak Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride Ceva Animal Health Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jenner, P. Molecular mechanisms of L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (9), 665-677 (2008).
  2. Nutt, J. G. Levodopa-induced dyskinesia: review, observations, and speculations. Neurology. 40 (2), 340-345 (1990).
  3. Luquin, M. R., Scipioni, O., Vaamonde, J., Gershanik, O., Obeso, J. A. Levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: clinical and pharmacological classification. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 7 (2), 117-124 (1992).
  4. Fabbrini, G., Brotchie, J. M., Grandas, F., Nomoto, M., Goetz, C. G. Levodopa-induced dyskinesias. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 22 (10), 1379 (2007).
  5. Cenci, M. A., Crossman, A. R. Animal models of l-dopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 33 (6), 889-899 (2018).
  6. Bastide, M. F., et al. Pathophysiology of L-dopa-induced motor and non-motor complications in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 132, 96-168 (2015).
  7. Manson, A., Stirpe, P., Schrag, A. Levodopa-induced-dyskinesias clinical features, incidence, risk factors, management and impact on quality of life. Journal of Parkinson's Disease. 2 (3), 189-198 (2012).
  8. Grandas, F., Galiano, M. L., Tabernero, C. Risk factors for levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease. Journal of Neurology. 246 (12), 1127-1133 (1999).
  9. Schrag, A., Quinn, N. Dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. A community-based study. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 11 2297-2305 (2000).
  10. Bezard, E., Brotchie, J. M., Gross, C. E. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesia: potential for new therapies. Nature Reviews. Neuroscience. 2 (8), 577-588 (2001).
  11. Tronci, E., Shin, E., Björklund, A., Carta, M. Amphetamine-induced rotation and L-DOPA-induced dyskinesia in the rat 6-OHDA model: a correlation study. Neuroscience Research. 73 (2), 168-172 (2012).
  12. Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson's disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
  13. Ungerstedt, U. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. European Journal of Pharmacology. 5 (1), 107-110 (1968).
  14. Ungerstedt, U. Postsynaptic supersensitivity after 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 367, 69-93 (1971).
  15. Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Experimental Neurology. 152, 259-277 (1998).
  16. Zahm, D. S. Compartments in rat dorsal and ventral striatum revealed following injection of 6-hydroxydopamine into the ventral mesencephalon. Brain Research. 552 (1), 164-169 (1991).
  17. Padovan-Neto, F. E., Echeverry, M. B., Tumas, V., Del-Bel, E. A. Nitric oxide synthase inhibition attenuates L-DOPA-induced dyskinesias in a rodent model of Parkinson's disease. Neuroscience. 159 (3), 927-935 (2009).
  18. Padovan-Neto, F. E., et al. Antidyskinetic effect of the neuronal nitric oxide synthase inhibitor is linked to decrease of FosB/deltaFosB expression. Neuroscience Letters. 541, 126-131 (2013).
  19. Padovan-Neto, F. E., Cavalcanti-Kiwiatkoviski, R., Carolino, R. O., Anselmo-Franci, J., Del Bel, E. Effects of prolonged neuronal nitric oxide synthase inhibition on the development and expression of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-OHDA-lesioned rats. Neuropharmacology. 89, 87-99 (2015).
  20. Winkler, C., Kirik, D., Björklund, A., Cenci, M. A. L-DOPA-induced dyskinesia in the intrastriatal 6-hydroxydopamine model of parkinson's disease: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 10 (2), 165-186 (2002).
  21. Francardo, V., et al. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to l-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 42, 327-340 (2011).
  22. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 15 (1), 120-132 (2002).
  23. Cenci, M. A., Lee, C. S., Björklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. The European Journal of Neuroscience. 10 (8), 2694-2706 (1998).
  24. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of enhanced behavioral responses to L-DOPA following repeated administration in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 151 (2), 334-342 (1998).
  25. Lee, C. S., Cenci, M. A., Schulzer, M., Björklund, A. Embryonic ventral mesencephalic grafts improve levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 7 1365-1379 (2000).
  26. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 6 (6), 461-474 (1999).
  27. Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The "motor complication syndrome" in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with L-DOPA: relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
  28. Animal Models of Movement Disorders: volume I, Neuromethods. Lane, E. L., Dunnett, S. 61, Springer Science+Business Media. (2011).
  29. Carlsson, T., Carta, M., Winkler, C., Björklund, A., Kirik, D. Serotonin neuron transplants exacerbate l-DOPA-induced dyskinesias in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 27 (30), 8011-8022 (2007).
  30. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 16 (1), 110-123 (2004).
  31. Fasano, S., et al. Inhibition of Ras-guanine nucleotide-releasing factor 1 (Ras-GRF1) signaling in the striatum reverts motor symptoms associated with L-dopa-induced dyskinesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21824-21829 (2010).
  32. Berton, O., et al. Striatal overexpression of DeltaJunD resets L-DOPA-induced dyskinesia in a primate model of Parkinson disease. Biological Psychiatry. 66 (6), 554-561 (2009).
  33. Lindgren, H. S., et al. Putaminal upregulation of FosB/ΔFosB-like immunoreactivity in Parkinson's disease patients with dyskinesia. Journal of Parkinson's Disease. 1 (4), 347-357 (2011).
  34. Rylander, D., et al. Maladaptive plasticity of serotonin axon terminals in levodopa-induced dyskinesia. Annals of Neurology. 68 (5), 619-628 (2010).
  35. Smith, R., et al. The role of pallidal serotonergic function in Parkinson's disease dyskinesias: a positron emission tomography study. Neurobiology of Aging. 36 (4), 1736-1742 (2015).
  36. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of a mouse model of l-DOPA-induced dyskinesia. Experimental Neurology. 194 (1), 66-75 (2005).
  37. Dekundy, A., Lundblad, M., Danysz, W., Cenci, M. A. Modulation of L-DOPA-induced abnormal involuntary movements by clinically tested compounds: further validation of the rat dyskinesia model. Behavioural Brain Research. 179 (1), 76-89 (2007).
  38. Blanchet, P. J., Konitsiotis, S., Chase, T. N. Amantadine reduces levodopa-induced dyskinesias in parkinsonian monkeys. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 13 (5), 798-802 (1998).
  39. Verhagen Metman, I., et al. Amantadine as treatment for dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. Neurology. 50 (5), 1323-1326 (1998).
  40. Cenci, M. A., Lundblad, M. Ratings of L-DOPA-induced dyskinesia in the unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease in rats and mice. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9 25 (2007).
  41. Dupre, K. B., et al. Effects of coincident 5- HT1A receptor stimulation and NMDA receptor antagonism on L-DOPA-induced dyskinesia and rotational behaviors in the hemi-parkinsonian rat. Psychopharmacology (Berl). 199 (1), 99-108 (2008).
  42. Guimarães, P. R., Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).
  43. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. New York. (1998).
  44. Tseng, K. Y., et al. Inhibition of striatal soluble guanylyl cyclase-cGMP signaling reverses basal ganglia dysfunction and akinesia in experimental parkinsonism. PloS One. 6 (11), 27187 (2011).
  45. Padovan-Neto, F. E., et al. Selective regulation of 5-HT1B serotonin receptor expression in the striatum by dopamine depletion and repeated L-DOPA treatment: Relationship to L-DOPA-induced dyskinesias. Molecular Neurobiology. 57 (2), 736-751 (2020).
  46. Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Bjorklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: Differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15, 3863-3875 (1995).
  47. Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease lesions. Neuroscience. 88, 617-628 (1995).
  48. Jayasinghe, V. R., Flores-Barrera, E., West, A. R., Tseng, K. Y. Frequency-dependent corticostriatal disinhibition resulting from chronic dopamine depletion: Role of local striatal cGMP and GABAAR signaling. Cerebral Cortex. 27, 625-634 (2017).
  49. Picconi, B., et al. Loss of bidirectional striatal synaptic plasticity in L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Neuroscience. 6 (5), 501-506 (2003).
  50. Carta, M., et al. Role of striatal L-DOPA in the production of dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned rats. Journal of Neurochemistry. 96 (6), 1718-1727 (2006).
  51. Westin, J. E., Andersson, M., Lundblad, M., Cenci, M. A. Persistent changes in striatal gene expression induced by long-term L-DOPA treatment in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 14 (7), 1171-1176 (2001).
  52. Bariotto-Dos-Santos, K., et al. Repurposing an established drug: an emerging role for methylene blue in L-DOPA-induced dyskinesia. The European Journal of Neuroscience. 49 (6), 869-882 (2018).
  53. Lindgren, H. S., Lane, E. L. Rodent Models of l-DOPA-Induced Dyskinesia. Animal Models of Movement Disorders. Neuromethods. Lane, E., Dunnett, S. 61, Humana Press. (2011).
  54. Doucet, J., et al. Drug-drug interactions related to hospital admissions in older adults: A prospective study of 1000 patients. Journal of the American Geriatrics Society. 44, 944-948 (1996).
  55. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain: A Journal of Neurology. 134, Pt 8 2339-2357 (2011).
  56. Jourdain, V. A., et al. Increased putamen hypercapnic vasoreactivity in levodopa-induced dyskinesia. JCI insight. 2 (20), 96411 (2017).
  57. Thiele, S. L., et al. Generation of a model of l-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. Journal of Neuroscience Methods. 197 (2), 193-208 (2011).
  58. Dos-Santos-Pereira, M., et al. Contributive role of TNF-α to L-DOPA-induced dyskinesia in a unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease. Frontiers in Pharmacology. 11, 617085 (2021).
  59. Cenci, M. A., Ohlin, K. E., Odin, P. Current options and future possibilities for the treatment of dyskinesia and motor fluctuations in Parkinson's disease. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 10 (6), 670-684 (2011).
  60. Cenci, M. A. Presynaptic mechanisms of l-DOPA-induced dyskinesia: The findings, the debate, and the therapeutic implications. Frontiers in Neurology. 5, 242 (2014).
  61. Langston, J. W., Quik, M., Petzinger, G., Jakowec, M., Di Monte, D. A. Investigating levodopa-induced dyskinesias in the parkinsonian primate. Annals of Neurology. 47 (4), Suppl 1 79-89 (2000).
  62. Chase, T. N. Levodopa therapy: consequences of the nonphysiologic replacement of dopamine. Neurology. 50 (5), Suppl 5 17-25 (1998).

Tags

Biologi Udgave 176 Parkinsons sygdom basale ganglier 6-hydroxydopamin L-DOPA-induceret dyskinesier unormale ufrivillige bevægelser
Rating L-DOPA-induceret dyskinesier i den ensidigt 6-OHDA-læsionerede rottemodel af Parkinsons sygdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. … More

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Guimarães, R. P., Padovan-Neto, F. E. Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62924, doi:10.3791/62924 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter