जेब्राफ़िश गुर्दे के विकास को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है। यहां, मेसोनेफ्रॉस विकास के दौरान ज़ेब्राफ़िश लार्वा और किशोरों में जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक इन सीटू संकरण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है।
ज़ेब्राफ़िश अपने जीवनकाल में दो गुर्दे की संरचनाएं बनाता है। प्रोनफ्रॉस (भ्रूण गुर्दे) भ्रूण के विकास के दौरान बनता है और निषेचन के बाद 2 दिनों में कार्य करना शुरू कर देता है। केवल दो नेफ्रॉन से मिलकर, प्रोनफ्रॉस लार्वा जीवन के दौरान एकमात्र गुर्दे के रूप में कार्य करता है जब तक कि शरीर के बढ़ते द्रव्यमान के कारण अधिक गुर्दे के कार्य की आवश्यकता न हो। इस उच्च मांग का सामना करने के लिए, मेसोनेफ्रोस (वयस्क गुर्दे) कायापलट के दौरान बनना शुरू हो जाता है। नए प्राथमिक नेफ्रॉन प्रोनफ्रॉस के लिए फ्यूज होते हैं और जुड़े हुए लुमेन बनाते हैं। फिर, माध्यमिक नेफ्रॉन मेसोनेफ्रोस में एक ब्रांचिंग नेटवर्क बनाने के लिए प्राथमिक लोगों (और इसी तरह) को फ्यूज करते हैं। अनुसंधान का विशाल बहुमत भ्रूण का उपयोग करने में आसानी के कारण प्रोनफ्रॉस पर केंद्रित है। इस प्रकार, मेसोनेफ्रॉस विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए पुराने और बड़े लार्वा और किशोर मछली का अध्ययन करने के लिए तकनीकों को विकसित करने की आवश्यकता है। यहां, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक इन सीटू संकरण प्रोटोकॉल को जांच प्रवेश, जांच और एंटीबॉडी की धुलाई, और मेसोनेफ्रॉस की बेहतर कल्पना करने के लिए पिगमेंट के विरंजन के लिए अनुकूलित किया गया है। Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग पूर्वज कोशिकाओं और नवजात नेफ्रॉन के डिस्टल नलिकाओं को लेबल करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल मेसोनेफ्रोस अनुसंधान में एक अंतर को भरता है। यह समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है कि नए गुर्दे के ऊतक कैसे बनते हैं और मौजूदा नेफ्रॉन के साथ एकीकृत होते हैं और पुनर्योजी उपचारों में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
ज़ेब्राफ़िश भ्रूण अपने छोटे आकार, पारदर्शिता, उपलब्ध उपकरणों और पांच दिनों तक खिलाए बिना जीवित रहने के कारण ऊतक विकास का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है1,2। इसने गुर्दे के विकास की समझ और ज़ेब्राफ़िश और स्तनधारियों के बीच संरक्षण में बहुत योगदान दिया है3,4,5। गुर्दे द्रव होमोस्टैसिस को बनाए रखने, रक्त को फ़िल्टर करने और अपशिष्ट को उत्सर्जित करने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है6। नेफ्रॉन, गुर्दे की कार्यात्मक इकाई, एक लंबी नलिका से जुड़ा एक रक्त फिल्टर शामिल है। ज़ेब्राफ़िश में, दो गुर्दे की संरचनाएं अपने पूरे जीवन में बनती हैं। प्रोनफ्रॉस (अस्थायी भ्रूण गुर्दे) प्रारंभिक विकास के दौरान पहले बनता है। इसमें पूर्वकाल-पश्च अक्ष के साथ चलने वाले दो नेफ्रॉन होते हैं और निषेचन (डीपीएफ) के बाद लगभग 2 दिनों में कार्यात्मक हो जाता है। प्रोनफ्रॉस की उपयोगिता इसकी सादगी में निहित है, जिसमें केवल दो नेफ्रॉन होते हैं जो ज्यादातर रैखिक होते हैं और कल्पना करने में आसान होते हैं (हालांकि समीपस्थ जटिल नलिका तीन डीपीएफ पर कुंडल करना शुरू कर देती है)3। इसने न केवल मध्यवर्ती मेसोडर्म से इसके शुरुआती विकास के अध्ययन की सुविधा प्रदान की है, बल्कि विभाजन पैटर्न और नलिका की मरम्मत 7,8 भी की सुविधा प्रदान की है।
ज़ेब्राफ़िश की उपयोगिता पांच डीपीएफ के बाद सीमित हो जाती है, जब जर्दी कम हो जाती है और लार्वा जलीय प्रणाली में खिलाने पर भरोसा करते हैं। लगभग 2 सप्ताह की उम्र में, लार्वा किशोरों में कायापलट से गुजरते हैं, जहां नए ऊतक बनते हैं और पुराने ऊतक खो जाते हैं और / या पुनर्गठित होते हैं। यह तब भी होता है जब मेसोनेफ्रॉस (स्थायी वयस्क गुर्दे) 10,11,12 बनाता है। पहला वयस्क नेफ्रॉन छठे सोमाइट के पास बनता है, और प्रोनफ्रॉस के डिस्टल शुरुआती नलिका के साथ फ़्यूज़ करता है। अतिरिक्त नेफ्रॉन को शुरू में इस स्थिति के पीछे जोड़ा जाता है, लेकिन बाद में पूर्वकाल की ओर भी। इस पहली लहर में प्राथमिक नेफ्रॉन प्रोनफ्रोस की नलिकाओं को फ्यूज करते हैं और अपने अपशिष्ट को जमा करने के लिए एक आम लुमेन साझा करते हैं। माध्यमिक नेफ्रॉन अगली लहर में बनते हैं और प्राथमिक नेफ्रॉन के लिए फ्यूज होते हैं। यह पुनरावृत्ति प्रक्रिया एक मेसोनेफ्रोस बनाती है जो शाखित होती है, कुछ हद तक स्तनधारी गुर्दे के समान होती है। संभवतः, प्रोनफ्रॉस अंततः अपनी नलिका पहचान खो देता है और दो प्रमुख संग्रह नलिकाएं बन जाता है जहां सभी नेफ्रॉन अपने अपशिष्ट को निकालते हैं।
पहले वयस्क नेफ्रॉन के गठन से पहले, एकल पूर्वज कोशिकाएं ~ 4 मिमी (कुल लंबाई) लार्वा (~ 10 डीपीएफ) में दिखाई देने लगती हैं। ये कोशिकाएं, जिन्हें Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन में चिह्नित किया गया है, प्रोनफ्रॉस का पालन करती हैं और नेफ्रोजेनेसिस की भविष्य की साइटों पर माइग्रेट करने लगती हैं। एकल कोशिकाएं समूहों में मिलती हैं, जो नए नेफ्रॉन 12 में अंतर करती हैं। यह स्पष्ट नहीं है कि ये कोशिकाएं कहां रहती हैं या मेसोनेफ्रोजेनेसिस की शुरुआत से पहले वे कौन से जीन व्यक्त करते हैं।
मेसोनेफ्रॉस के विकास को समझना स्तनधारी गुर्दे में उन तरीकों से अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो प्रोनफ्रॉस नहीं कर सकते हैं। इनमें एकल पूर्वज कोशिकाओं से नेफ्रोजेनिक समुच्चय का गठन, मौजूदा लोगों के साथ नए नेफ्रॉन का कार्यात्मक एकीकरण, और मॉर्फोजेनेसिस की शाखाओं में शामिल हैं। हालांकि, पोस्टमब्रायोनिक विकास का अध्ययन करने की सीमाएं हैं। लार्वा अपने बड़े आकार और रंजकता होने के कारण कम पारदर्शी होते हैं। विकास की समयरेखा व्यक्तिगत जानवरों के बीच तुल्यकालिक नहीं है और पर्यावरणीय कारकों पर अत्यधिक निर्भर है, जैसे कि खिलाना और भीड़ 9,14। हालांकि नॉकडाउन अभिकर्मक मौजूद हैं, वे भ्रूण 15 की तुलना में लार्वा में कम प्रभावी हैं। इस प्रोटोकॉल में, ज़ेब्राफ़िश मेसोनेफ्रॉस विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए एक इन सीटू संकरण विधि का वर्णन किया गया है। कई चरणों mesonephros और प्रवेश और जांच और एंटीबॉडी की धुलाई के दृश्य को बढ़ाने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग ईजीएफपी के लिए एकल पूर्वज कोशिकाओं, नेफ्रोजेनिक समुच्चय और नवजात नेफ्रॉन के डिस्टल नलिकाओं को लेबल करने के लिए ईजीएफपी के लिए एक जांच के साथ किया जाता है। यह विधि मेसोनेफ्रॉस के विकास की गहरी समझ और पुनर्योजी उपचारों में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी।
यहां वर्णित इन सीटू संकरण विधि का उद्देश्य मेसोनेफ्रॉस विकास का अध्ययन करना है। हालांकि, इसे कायापलट के दौरान अन्य ऊतकों और अंगों के विकास का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि आंत, तंत?…
The authors have nothing to disclose.
पेंसिल्वेनिया एकेडमी ऑफ साइंस, और पेंसिल्वेनिया जीवविज्ञानियों के राष्ट्रमंडल, और पेंसिल्वेनिया जीवविज्ञानियों के राष्ट्रमंडल, और पेंसिल्वेनिया के इंडियाना विश्वविद्यालय (स्कूल ऑफ ग्रेजुएट स्टडीज एंड रिसर्च, जीव विज्ञान विभाग, और उत्कृष्टता के लिए सिंथिया सुशाक अंडरग्रेजुएट बायोलॉजी फंड) द्वारा वित्त पोषण प्रदान किया गया था। Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन डॉ नील हकरीडे (पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई थी।
Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
Hatchfry encapsulation | Argent | ||
Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
Spirulina microfine powder | Argent | ||
SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |