In situ Hybridisierung in Zebrafischlarven und Jungfischen während der Mesonephrosentwicklung
Summary
Der Zebrafisch ist ein wichtiges Modell für das Verständnis der Nierenentwicklung. Hier wird ein In-situ-Hybridisierungsprotokoll optimiert, um die Genexpression in Zebrafischlarven und Juvenilen während der Mesonephrosentwicklung nachzuweisen.
Abstract
Der Zebrafisch bildet in seinem Leben zwei Nierenstrukturen. Der Pronephros (embryonale Niere) bildet sich während der Embryonalentwicklung und beginnt 2 Tage nach der Befruchtung zu funktionieren. Der pronephros besteht aus nur zwei Nephronen und dient während des Larvenlebens als einzige Niere, bis aufgrund der zunehmenden Körpermasse mehr Nierenfunktion erforderlich ist. Um diesem höheren Bedarf gerecht zu werden, beginnt sich während der Metamorphose der Mesonephros (erwachsene Niere) zu bilden. Die neuen primären Nephrone verschmelzen mit dem Pronephros und bilden verbundene Lumen. Dann verschmelzen sekundäre Nephrone mit primären (und so weiter), um ein verzweigtes Netzwerk im Mesonephros zu schaffen. Die überwiegende Mehrheit der Forschung konzentriert sich auf den Pronephros aufgrund der Leichtigkeit der Verwendung von Embryonen. Daher besteht die Notwendigkeit, Techniken zu entwickeln, um ältere und größere Larven und Jungfische zu untersuchen, um die Entwicklung von Mesonephrosen besser zu verstehen. Hier ist ein In-situ-Hybridisierungsprotokoll für die Genexpressionsanalyse für die Penetration von Sonden, das Waschen von Sonden und Antikörpern und das Bleichen von Pigmenten optimiert, um die Mesonephrose besser sichtbar zu machen. Die transgene Linie Tg(lhx1a-EGFP) wird verwendet, um Vorläuferzellen und die distalen Tubuli von naszierenden Nephronen zu markieren. Dieses Protokoll füllt eine Lücke in der Mesonephrosforschung. Es ist ein entscheidendes Modell, um zu verstehen, wie sich neues Nierengewebe bildet und in bestehende Nephrone integriert und Einblicke in regenerative Therapien gibt.
Introduction
Der Zebrafisch-Embryo ist aufgrund seiner geringen Größe, Transparenz, verfügbaren Werkzeuge und seines Überlebens ohne Fütterung für bis zu fünf Tage ein wichtiges Modell für die Untersuchung der Gewebeentwicklung1,2. Es hat wesentlich zum Verständnis der Nierenentwicklung und des Schutzes zwischen Zebrafischen und Säugetieren beigetragen3,4,5. Die Niere spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Flüssigkeitshomöostase, der Filterung des Blutes und der Ausscheidung von Abfällen6. Das Nephron, die funktionelle Einheit der Niere, besteht aus einem Blutfilter, der mit einem langen Tubulus verbunden ist. Im Zebrafisch bilden sich während seines gesamten Lebens zwei Nierenstrukturen. Der Pronephros (die temporäre embryonale Niere) bildet sich zuerst während der frühen Entwicklung. Es besteht aus zwei Nephronen, die entlang der anterior-posterioren Achse verlaufen und wird etwa 2 Tage nach der Befruchtung funktionsfähig (dpf). Der Nutzen des Pronephros liegt in seiner Einfachheit, da er nur zwei Nephrone hat, die meist linear und leicht zu visualisieren sind (obwohl sich der proximale gewundene Tubulus bei drei dpf zu winden beginnt)3. Dies hat nicht nur Studien seiner frühen Entwicklung aus dem intermediären Mesoderm ermöglicht, sondern auch das Segmentierungsmuster und die Tubulireparatur7,8.
Die Nützlichkeit von Zebrafischen wird nach fünf dpf begrenzt, wenn das Eigelb vermindert ist und die Larven auf die Fütterung im aquatischen System angewiesen sind9. Im Alter von etwa 2 Wochen durchlaufen die Larven eine Metamorphose zu Juvenilen, bei denen sich neues Gewebe bildet und alte Gewebe verloren gehen und / oder reorganisiert werden9. Dies ist auch der Zeitpunkt, an dem sich der Mesonephros (die permanente erwachsene Niere) bildet10,11,12. Das erste erwachsene Nephron bildet sich in der Nähe des sechsten Somites und verschmilzt mit dem distalen frühen Tubulus des Pronephros. Zusätzliche Nephrone werden zunächst posterior zu dieser Position hinzugefügt, später aber auch nach vorne. Die primären Nephrone in dieser ersten Welle verschmelzen mit den Tubuli des Pronephros und teilen sich ein gemeinsames Lumen, um ihren Abfall zu deponieren. Sekundäre Nephrone bilden sich in der nächsten Welle und verschmelzen zu primären Nephronen. Dieser wiederholte Prozess erzeugt einen Mesonephros, der verzweigt ist, ähnlich wie die Säugetierniere. Vermutlich verliert der Pronephros schließlich seine Tubulusidentität und wird zu zwei großen Sammelkanälen, in denen alle Nephrone ihren Abfall ablassen13.
Vor der Bildung des ersten adulten Nephrons beginnen einzelne Vorläuferzellen in ~ 4 mm (Gesamtlänge) Larven (~ 10 dpf) zu erscheinen. Diese Zellen, die in der transgenen Linie Tg(lhx1a-EGFP) markiert sind, haften am Pronephros und scheinen an zukünftige Stellen der Nephrogenese zu wandern. Die einzelnen Zellen verschmelzen zu Clustern, die sich zu neuen Nephronen differenzieren12. Es ist unklar, wo sich diese Zellen befinden oder welche Gene sie vor Beginn der Mesonephrogenese exprimieren.
Das Verständnis der Mesonephrosentwicklung liefert Einblicke in die Säugetierniere auf eine Weise, die der Pronephros nicht kann. Dazu gehören die Bildung nephrogener Aggregate aus einzelnen Vorläuferzellen, die funktionelle Integration neuer Nephrone mit bestehenden und die verzweigte Morphogenese. Es gibt jedoch Einschränkungen bei der Untersuchung der postembryonalen Entwicklung. Die Larven sind aufgrund ihrer größeren Größe und Pigmentierung weniger transparent. Die Entwicklungszeit ist zwischen den einzelnen Tieren nicht synchron und hängt stark von Umweltfaktoren wie Fütterung und Gedränge ab9,14. Obwohl Knockdown-Reagenzien existieren, sind sie bei Larven im Vergleich zu Embryonen weniger wirksam15. In diesem Protokoll wird eine In-situ-Hybridisierungsmethode zur Bestimmung der Genexpression während der Entwicklung von Zebrafisch-Mesonephrosen beschrieben. Mehrere Schritte werden optimiert, um die Visualisierung des Mesonephros und das Eindringen und Waschen der Sonde und des Antikörpers zu verbessern. Die transgene Linie Tg (lhx1a-EGFP) wird zusammen mit einer Sonde für EGFP verwendet, um einzelne Vorläuferzellen, nephrogene Aggregate und die distalen Tubuli von entstehenden Nephronen zu markieren. Diese Methode wird ein tieferes Verständnis der Mesonephrosentwicklung und Einblicke in regenerative Therapien ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene In-situ-Hybridisierungsmethode zielt darauf ab, die Entwicklung von Mesonephrosen zu untersuchen. Es kann jedoch angewendet werden, um die Entwicklung anderer Gewebe und Organe während der Metamorphose zu untersuchen, wie Darm, Nervensystem, Schuppen und Pigmentierung14. Sonden können für endogene Gene oder fluoreszierende Marker in transgenen Linien erzeugt werden.
Es ist wichtig, dass die Larven intakt bleiben, um die Organe und Geweb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung wurde von der Pennsylvania Academy of Science und dem Commonwealth of Pennsylvania Biologs sowie der Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology und dem Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence) bereitgestellt. Die transgene Tg(lhx1a-EGFP)- Leitung wurde von Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh) zur Verfügung gestellt.
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
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