Summary

시투에서 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레와 청소년의 혼성화

Published: August 13, 2021
doi:

Summary

제브라피쉬는 신장 발달을 이해하는 중요한 모델입니다. 여기서, 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레및 청소년의 유전자 발현을 검출하도록 최적화된다.

Abstract

제브라피쉬는 일생에 두 개의 신장 구조를 형성합니다. 배아 발달 중 경향이 있는 (배아 신장)은 형성되고 2 일 후에 수정 후에 작동하기 시작합니다. 단지 두 개의 신전으로 이루어짐에 따라, 수성 세포는 증가하는 바디 질량 때문에 더 많은 신장 기능이 요구될 때까지 애벌레 생활 도중 유일한 신장 역할을 합니다. 이 높은 수요에 대처하기 위하여는, 메소네프로스 (성인 신장)는 변태 도중 형성하기 시작합니다. 새로운 기본 nephrons 는 경향이 있는 알 로에 융합 하 고 연결 된 lumens 형성. 그런 다음 보조 nephrons는 메소네프로스(mesonephros)에 분기 네트워크를 만들기 위해 기본 nephrons에 융합됩니다. 연구의 대다수는 배아를 사용 의 용이성 때문에 경향이 있는 phros에 집중됩니다. 따라서 메소네프로스의 발달을 더 잘 이해하기 위해 더 오래되고 더 큰 애벌레와 청소년 물고기를 연구하는 기술을 개발할 필요가 있습니다. 여기서, 유전자 발현 분석을 위한 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스를 더 잘 시각화하기 위해 프로브 침투, 프로브 및 항체의 세척 및 표백에 최적화되어 있다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 전구 세포와 초기 신장의 말단 튜블러를 라벨에 사용됩니다. 이 프로토콜은 메손프로스 연구의 격차를 메손프로스(mesonephros) 연구의 격차를 메웁니다. 새로운 신장 조직이 어떻게 형성되고 기존 신장론과 통합되고 재생 치료에 대한 통찰력을 제공하는지 이해하는 중요한 모델입니다.

Introduction

Zebrafish 배아는 최대 5 일 1,2에 대한 먹이없이 작은 크기, 투명성, 사용 가능한 도구 및 생존으로 인해 조직 발달을 연구하기위한 중요한 모델입니다. 그것은 크게 신장 발달의 이해와 제브라피시와 포유류 사이의 보존에 기여하고있다3,4,5. 신장은 유체 항상성을 유지하고 혈액을 필터링하고 폐기물을 배설하는 데 필수적인 역할을합니다. 신장의 기능성 단위인 네프론은 긴 튜블러에 연결된 혈액 필터를 포함한다. 제브라피시에서는 두 개의 신장 구조가 평생 동안 형성됩니다. 수경향 (임시 배아 신장) 초기 발달 도중 첫번째 양식. 전방 후방 축을 따라 실행되는 두 개의 네프론으로 구성되어 있으며 약 2일 후에 발효됩니다(dpf). 경향이 있는 소염의 유용성은 단순성에 있으며, 대부분 선형적이고 시각화하기 쉬운 두 개의 네프론을 가지고 있습니다 (근위 복잡한 튜블러는 3 dpf에서 코일되기 시작하지만). 이것은 중간 중음에서 초기 발달의 연구뿐만 아니라 세분화 패턴 및 tubule 수리7,8을 촉진했습니다.

노른자가 감소하고 유충이 수생 계통9에서 먹이에 의존할 때 제브라피시의 유용성은 5dpf 후에 제한됩니다. 약 2 주 에서, 애벌레는 새로운 조직 양식 및 오래된 조직이 분실되고/또는 개편되는 청소년으로 변태를 겪습니다9. 이것은 또한 메소네프로스 (영구 성인 신장)가 10,11,12를 형성 할 때입니다. 첫 번째 성인 nephron 여섯 번째 소밋 근처 형성, 그리고 경향이 있는 phros의 탈경 초기 tubule와 융합. 추가 nephrons는 처음에이 위치에 후방을 추가, 뿐만 아니라 나중에 전방으로. 이 첫 번째 파도의 기본 네프론은 경향이있는 사람의 튜블러에 융합하고 폐기물을 입금하기 위해 일반적인 루멘을 공유합니다. 보조 nephrons다음 파도에서 형성 하 고 기본 nephrons에 융합. 이 반복적인 과정은 포유류 신장에 다소 유사한 분기되는 메손프로스를 만듭니다. 아마도, 경향이 있는 것은 결국 그것의 관 정체성을 잃고 모든 nephrons그들의 낭비를 배수하는 두 개의 중요한 수집 덕트가 됩니다13.

첫 번째 성인 nephron의 형성 전에, 단 하나 전구 세포는 ~4 mm (총 길이) 애벌레 (~10 dpf)에서 나타나기 시작합니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선에 표시된 이 세포는, 경향이 있는 phros를 고착하고 신뢰의 미래 사이트로 이동하는 것처럼 보입니다. 단일 세포는 새로운 nephrons12로 분화하는 클러스터로 결합합니다. 이 세포가 어디에 상주하는지 또는 메소네프로 발생의 발병 전에 어떤 유전자를 표현하는지 불분명합니다.

메손프로스 개발을 이해하면 포유류 신장에 대한 통찰력을 수성세포증이 할 수 없는 방식으로 얻을 수 있습니다. 이들은 단 하나 전구 세포에서 nephrogenic 골체의 형성, 기존 세포와 새로운 nephrons의 기능적인 통합, 및 분진 형태를 포함합니다. 그러나, 태아 발달을 공부하는 한계가 있습니다. 유충은 그들의 더 큰 크기와 색소 침착을 가지고 있기 때문에 덜 투명합니다. 개발 타임 라인은 개별 동물 중 동기가 아니며 먹이 주기 및 혼잡9,14와 같은 환경 요인에 크게 의존합니다. 녹다운 시약이 존재하지만, 배아15에 비해 애벌레에서 덜 효과적입니다. 본 프로토콜에서, 제브라피시 메소네프로스 개발 중 유전자 발현을 결정하는 시투 혼성화 방법이 기재된다. 몇 가지 단계는 메손프로스의 시각화와 프로브 및 항체의 침투 및 세척을 증가시키기 위해 최적화된다. Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선은 EGFP가 단일 전구 세포, 신장 골체 및 초기 신장의 단면 튜블러를 라벨에 부착하기 위한 프로브와 함께 사용됩니다. 이 방법은 메소네프로스 발달에 대한 깊은 이해와 재생 치료에 대한 통찰력을 제공합니다.

Protocol

제브라피시 애벌레와 청소년의 사용은 IUP IACUC (프로토콜 #02-1920, #08-1920)에 의해 승인됩니다. 솔루션 콘텐츠에 대한 세부 정보는 재료 표에 나열됩니다. 1. 애벌레 를 기르다 참고: 애벌레와 청소년을 관심 있는 단계로 올리는 데는 최대 21일 이상이 소요됩니다. 마지막 식사 후 늦은 오후에 짝짓기 탱크에 남성 1 마리와 암컷 물고기 1 마?…

Representative Results

Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선을 이용하여, 이러한 좌식 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 신장 전구 세포 및 다양한 네프론 구조를 라벨링하는 데 효과적이라는 것을 입증하였다. 예상대로, 중추 신경계는 또한이 형질 전환선에 표시되어 있습니다 (표시되지 않음). 초기 메소네프릭 네프론은 약 5.2mm, 등쪽에서 발생하기 쉬운(그림 2A)을 형성하며, 이 네프론의 ?…

Discussion

여기에 설명 된 시투 혼성화 방법은 메소네프로스 개발을 연구하는 것을 목표로 합니다. 그러나, 그것은 창 자, 신경계, 비늘 및 색소 침착14와 같은 변태 도중 그밖 조직 및 기관의 발달을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다. 프로브는 형질 전환선에서 내인성 유전자 또는 형광 마커를 위해 생성될 수 있다.

애벌레는 그들의 네이티브 맥락에서 장기?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

기금은 펜실베니아 과학 아카데미, 펜실베니아 생물학자의 연방, 펜실베니아 인디애나 대학 (대학원 연구 및 연구, 생물학부 및 신시아 수삭 학부 생물학 기금)에 의해 제공되었습니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 박사 닐 Hukriede에 의해 제공되었다 (피츠버그 대학).

Materials

Anti-fluorescein antibody Roche/Sigma-Aldrich 11426338910
Bleaching solution 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent Roche/Sigma-Aldrich 11096176001 Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer Fisher Scientific  22-363-549 100 μm
E3 medium 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator Fisher Scientific NC1083208 Use to manipulate larvae
Fixing solution 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis Roche/Sigma-Aldrich 11685619910
Glass vial Fisher Scientific 03-338B
Hatchfry encapsulation Argent
Hyb- solution 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X) 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT 1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid Sigma-Aldrich M0375
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
PBS (10X) 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST 1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2 1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K Sigma-Aldrich P5568 Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution 20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder Argent
SSC (20X) 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA Sigma-Aldrich R6625
Tricaine Sigma Aldrich E10521 2%, pH 7
Wash buffer 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20

References

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Citer Cet Article
Kasar, S. N., Grandinette, S. A., Semelsberger, S. D., Diep, C. Q. In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development. J. Vis. Exp. (174), e62930, doi:10.3791/62930 (2021).

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