原位 斑马鱼幼体和幼鱼在雌雄同体发育过程中的杂交
Summary
斑马鱼是了解肾脏发育的重要模型。在这里， 对原位 杂交方案进行了优化，以检测斑马鱼幼虫和幼鱼在中胚层发育过程中的基因表达。
Abstract
斑马鱼在其一生中形成两个肾脏结构。前发肾（胚胎肾）在胚胎发育过程中形成，并在受精后2天开始发挥作用。前发肾上腺仅由两个肾单位组成，在幼虫存活期间充当唯一的肾脏，直到由于体重增加而需要更多的肾功能。为了应对这种更高的需求，中胚层（成人肾脏）在蜕变过程中开始形成。新的初级肾单位融合到前静脉并形成连接的管腔。然后，次级肾单位融合到初级肾单位（依此类推）以在中胚层中形成分支网络。绝大多数研究都集中在前驱虫上，因为使用胚胎很容易。因此，有必要开发技术来研究较老和较大的幼虫和幼鱼，以更好地了解中胚层的发育。在这里，用于基因表达分析 的原位 杂交方案针对探针穿透，探针和抗体的洗涤以及色素的漂白进行了优化，以更好地可视化中胚层。 Tg（lhx1a-EGFP） 转基因系用于标记新生肾单位的祖细胞和远端肾小管。该协议填补了中胚层研究的空白。它是了解新肾组织如何形成并与现有肾单位整合并提供再生疗法见解的关键模型。
Introduction
斑马鱼胚胎是研究组织发育的重要模型，因为它的尺寸小，透明度，可用的工具，并且在不进食的情况下存活长达五天1，2。它极大地促进了对肾脏发育的理解以及斑马鱼和哺乳动物之间的保护3，4，5。肾脏在维持液体稳态、过滤血液和排泄废物方面起着至关重要的作用6。肾单位是肾脏的功能单位，包括连接到长小管的血液过滤器。在斑马鱼中，两个肾脏结构在其一生中形成。前发肾（临时胚胎肾）在早期发育期间首先形成。它由两个沿前后轴运行的肾单位组成，并在受精后约2天（dpf）变得功能性。前静脉的效用在于其简单性，只有两个肾单位，它们大多是线性的，易于观察（尽管近端卷曲的小管开始以三 dpf的速度盘绕）3。这不仅促进了从中间中胚层对其早期发展的研究，还促进了分割模式和小管修复的研究7，8。
斑马鱼的用处在五分后变得有限，此时蛋黄减少，幼虫依靠水生系统中的觅食9。在大约2周龄时，幼虫蜕变为幼体，形成新组织，旧组织丢失和/或重组9。这也是中胚层（永久成人肾脏）形成10，11，12的时候。第一个成年肾单位在第六个体参体附近形成，并与前发性肾病的远端早期小管融合。额外的肾单位最初向后添加到该位置，但稍后也向前部添加。第一波中的主肾单位融合到前发管的小管中，并共享一个共同的腔来沉积它们的废物。次级肾单位在下一波中形成并融合到初级肾单位。这种重复过程会产生一个分支的中胚层，有点类似于哺乳动物的肾脏。据推测，前驱肾小管最终会失去其小管特性，并成为两个主要的收集管，所有肾单位都排出废物13。
在第一个成体肾单位形成之前，单个祖细胞开始出现在〜4毫米（总长度）幼虫（〜10 dpf）中。这些细胞在 Tg（lhx1a-EGFP） 转基因系中标记，粘附在前发细胞上，似乎迁移到未来的肾病发生部位。单个细胞合并成簇，分化成新的肾单位12。目前尚不清楚这些细胞位于何处，也不清楚它们在介子发生发生之前表达的基因。
了解中胚层发育可以以前肾无法实现的方式深入了解哺乳动物肾脏。这些包括从单个祖细胞形成肾源聚集体，新肾单位与现有肾单位的功能整合以及分支形态发生。然而，研究胚胎后发育存在局限性。幼虫由于其体型较大且具有色素沉着而不太透明。个体动物之间的发育时间表不同步，并且高度依赖于环境因素，例如进食和拥挤9，14。虽然存在敲低试剂，但与胚胎相比，它们在幼虫中的效果较差15。在该协议中，描述了一种 原位 杂交方法，以确定斑马鱼中胚层发育过程中的基因表达。优化了几个步骤，以提高中胚层的可视化以及探针和抗体的穿透和洗涤。 Tg（lhx1a-EGFP） 转基因系与EGFP探针一起使用，以标记单个祖细胞，肾源聚集体和新生肾单位的远端小管。这种方法将提供对中胚层发育的更深入理解和对再生疗法的见解。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述 的原位 杂交方法旨在研究中胚层发育。然而，它可以应用于研究蜕变过程中其他组织和器官的发育，例如肠道，神经系统，鳞片和色素沉着14。可以为转基因系中的内源性基因或荧光标记物生成探针。
幼虫保持完整至关重要，以便观察其原生环境中的器官和组织。为了保持组织的完整性，重要的是要尽量减少蛋白酶K治疗的时间。重要的是要…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
资金由宾夕法尼亚科学院，宾夕法尼亚生物学家联邦和宾夕法尼亚州印第安纳大学（研究生学习与研究学院，生物学系和辛西娅·苏沙克本科生物学卓越基金）提供。 Tg（lhx1a-EGFP） 转基因系由Neil Hukriede博士（匹兹堡大学）提供。
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish – emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. . The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Biologie du développement. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
