בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

Summary

דג הזברה הוא מודל חשוב להבנת התפתחות הכליות. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום מותאם כדי לזהות ביטוי גנים בזחלי דגי זברה וצעירים במהלך פיתוח mesonephros.

Abstract

דג הזברה יוצר שני מבני כליות בחייו. הנוטה (כליה עוברית) נוצרת במהלך התפתחות עוברית ומתחילה לתפקד ביומיים לאחר ההפריה. המורכב משני נפרונים בלבד, הנוטה משמשת ככליה היחידה במהלך חיי הזחל עד שנדרשת תפקוד כליות נוסף בשל מסת הגוף ההולכת וגדלה. כדי להתמודד עם דרישה גבוהה זו, mesonephros (כליה בוגרת) מתחיל להיווצר במהלך מטמורפוזה. הנפרונים הראשיים החדשים מתמזגים לנוודים ויוצרים לומן מחובר. לאחר מכן, נפרונים משניים מתמזגים לראשונים (וכן הלאה) כדי ליצור רשת הסתעפות במסונפרוס. הרוב המכריע של המחקר מתמקד נוטה בשל הקלות של שימוש בעוברים. לכן, יש צורך לפתח טכניקות ללמוד זחלים מבוגרים וגדולים יותר ודגים צעירים כדי להבין טוב יותר את התפתחות mesonephros. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום לניתוח ביטוי גנים מותאם לחדירת בדיקה, שטיפת בדיקות ונוגדנים, והלבנת פיגמנטים כדי לדמיין טוב יותר את mesonephros. הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP) משמש לתיוג תאי אבות ואת הצינורות הדיסטליים של נפרונים המתהווים. פרוטוקול זה ממלא פער במחקר mesonephros. זהו מודל חיוני להבנת האופן שבו רקמות כליות חדשות נוצרות ומשתלבות עם נפרונים קיימים ומספקות תובנות על טיפולים רגנרטיביים.

Introduction

עובר דג הזברה הוא מודל חשוב לחקר התפתחות הרקמות בשל גודלו הקטן, השקיפות, הכלים הזמינים וההישרדות שלו ללא הזנה עד חמישה ^ימים1,2. היא תרמה רבות להבנת התפתחות הכליות ולשימור בין דגי זברה ליונקים3,4,5. הכליה ממלאת תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס נוזלי, סינון הדם והפרשת ^פסולת6. הנפרון, היחידה התפקודית של הכליה, כולל מסנן דם המחובר לצינור ארוך. בדגי זברה נוצרים שני מבני כליות לאורך כל חייו. הנוטה (הכליה העוברית הזמנית) נוצרת תחילה במהלך ההתפתחות המוקדמת. הוא מורכב משני נפרונים רצים לאורך הציר הקדמי-אחורי והופך לפונקציונלי בסביבות 2 ימים לאחר ההפריה (dpf). התועלת של הנוטה טמונה בפשטות שלה, שיש רק שני נפרונים כי הם בעיקר ליניארי וקל לדמיין (אם כי הצינור המפותל הפרוקסימלי מתחיל סליל בשלושה dpf)³. זה הקל לא רק על מחקרים על התפתחותה המוקדמת מן mesoderm הביניים, אלא גם את דפוס פילוח ותיקון ^{צינורית7,8}.

התועלת של דגי זברה מוגבלת לאחר חמישה dpf, כאשר החלמון פוחת והזחלים מסתמכים על האכלה במערכת ^הימית9. בסביבות 2 שבועות, הזחלים עוברים מטמורפוזה לקטינים, שם נוצרות רקמות חדשות ורקמות ישנות אובדות ו/או מאורגנות ^מחדש9. זה גם כאשר mesonephros (הכליה הבוגרת הקבועה) יוצר10,11,12. הנפרון הבוגר הראשון נוצר ליד הסומיט השישי, ומתמזג עם הצינורית המוקדמת הדיסטלית של הנוגים. נפרונים נוספים מתווספים אחוריים לעמדה זו בתחילה, אך גם לכיוון הקדמי בהמשך. הנפרונים העיקריים בגל הראשון מתמזגים לצינורות של הנוטים וחולקים לומן משותף להפקיד את הפסולת שלהם. נפרונים משניים נוצרים בגל הבא ומתמזגים לנפרונים ראשיים. תהליך חוזר זה יוצר מסונפרוס המסתעף, דומה במקצת לכליות היונקים. ככל הנראה, הנוטה בסופו של דבר מאבדת את זהות הצינור שלה והופכת לשני צינורות איסוף עיקריים שבהם כל הנפרונים מרוקנים את הפסולת ^שלהם13.

לפני היווצרותו של הנפרון הבוגר הראשון, תאי אבות יחידים מתחילים להופיע בזחלים ~4 מ”מ (אורך כולל) (~ 10 dpf). תאים אלה, המסומנים בקו מהונדס Tg(lhx1a-EGFP), לדבוק נוטה ונדמה להעביר לאתרים עתידיים של נפרוגנזה. התאים הבודדים מתמזגים לאשכולות, המבדילים לנפרונים ^חדשים12. לא ברור היכן תאים אלה שוכנים או אילו גנים הם מבטאים לפני תחילתו של mesonephrogenesis.

הבנת התפתחות מסונפרוס מספקת תובנות על כליות היונקים בדרכים שהנואפרוסים אינם יכולים. אלה כוללים היווצרות של אגרגטים נפרוגניים מתאי אבות יחידים, שילוב פונקציונלי של נפרונים חדשים עם קיימים, ומורפוגנזה מסתעפת. עם זאת, ישנן מגבלות לחקר התפתחות פוסט-מבריונית. הזחלים פחות שקופים בשל גודלם הגדול יותר ויש להם פיגמנטציה. ציר הזמן ההתפתחותי אינו סינכרוני בין בעלי חיים בודדים ותלוי מאוד בגורמים סביבתיים, כגון האכלה וצפיפות ^9,14. למרות ריאגנטים נוקאאוט קיימים, הם פחות יעילים בזחלים לעומת ^{עוברים15}. בפרוטוקול זה, מתוארת שיטת הכלאה במקום לקביעת ביטוי גנים במהלך התפתחות mesonephros של דגי זברה. מספר שלבים מותאמים להגברת ההדמיה של mesonephros וחדירה ושטיפה של הבדיקה ואת הנוגדן. הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP) משמש יחד עם בדיקה עבור EGFP כדי לתייג תאים יחידים של אבות, אגרגטים נפרוגניים, ואת צינורות דיסטליים של נפרונים המתהווה. שיטה זו תספק הבנה עמוקה יותר של התפתחות mesonephros ותובנה על טיפולים רגנרטיביים.

Protocol

השימוש בזחלי דגי זברה וצעירים מאושר על ידי IUP IACUC (פרוטוקול #02-1920, #08-1920). פרטי תוכן הפתרון מפורטים ברשימת החומרים. 1. גידול זחלים הערה: זה ייקח עד 21 ימים או יותר כדי להעלות זחלים וצעירים לשלב של עניין. הקימו דגי זברה בוגרים להזדווג על ידי הוספת דג זכר…

Representative Results

באמצעות הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP), הוכח כי זה בפרוטוקול הכלאה במקום יעיל בתיוג תאי צאצא כליות ומבנים שונים של נפרון במהלך פיתוח mesonephros. כצפוי, מערכת העצבים המרכזית מסומנת גם בקו מהונדס זה (לא מוצג). הנפרון המסונפירי הראשוני נוצר במהירות של כ-5.2 מ”מ, גב לנטייה (איור 2A), והצינ…

Discussion

שיטת ההכלאה במקום המתוארת כאן נועדה ללמוד פיתוח מסונפרוס. עם זאת, ניתן ליישם אותו כדי לחקור את ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים במהלך מטמורפוזה, כגון המעיים, מערכת העצבים, קשקשים, ^{פיגמנטציה14}. בדיקות ניתן ליצור עבור גנים אנדוגניים או סמנים פלואורסצנטיים בקווים מהונדסים.

…

Materials

Anti-fluorescein antibody	Roche/Sigma-Aldrich	11426338910
Bleaching solution			0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent	Roche/Sigma-Aldrich	11096176001	Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549	100 μm
E3 medium			5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator	Fisher Scientific	NC1083208	Use to manipulate larvae
Fixing solution			4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis	Roche/Sigma-Aldrich	11685619910
Glass vial	Fisher Scientific	03-338B
Hatchfry encapsulation	Argent
Hyb- solution			50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution			HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X)			1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT			1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid	Sigma-Aldrich	M0375
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127
PBS (10X)			8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST			1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2			1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food			Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P5568	Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution			20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder	Argent
SSC (20X)			3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X)			Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X)			Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer			100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution			200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution			1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA	Sigma-Aldrich	R6625
Tricaine	Sigma Aldrich	E10521	2%, pH 7
Wash buffer			50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20