Sebrafisken er en viktig modell for å forstå nyreutvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokoll optimalisert for å oppdage genuttrykk i sebrafisk larver og ungdommer under mesonephros utvikling.
Sebrafisken danner to nyrestrukturer i sin levetid. Pronephros (embryonal nyre) dannes under embryonal utvikling og begynner å fungere ved 2 dager etter befruktning. Bestående av bare to nephrons, fungerer pronephros som den eneste nyre under larvallivet til mer nyrefunksjon er nødvendig på grunn av den økende kroppsmassen. For å takle denne høyere etterspørselen begynner mesonephros (voksen nyre) å danne seg under metamorfose. Den nye primære nephrons sikringen til pronephros og danner tilkoblede lumen. Deretter smelter sekundære nephrons til primære (og så videre) for å skape et forgreningsnettverk i mesonephros. Det store flertallet av forskningen er fokusert på pronephros på grunn av den enkle å bruke embryoer. Dermed er det behov for å utvikle teknikker for å studere eldre og større larver og juvenil fisk for bedre å forstå mesonephros utvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokoll for genuttrykksanalyse optimalisert for sondeinntrengning, vasking av sonder og antistoffer, og bleking av pigmenter for bedre å visualisere mesonephros. Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) brukes til å merke stamceller og distale tubuli av nascent nephrons. Denne protokollen fyller et gap i mesonephros forskning. Det er en avgjørende modell for å forstå hvordan nye nyrevev dannes og integreres med eksisterende nefroner og gir innsikt i regenerative terapier.
Sebrafiskembryoet er en viktig modell for å studere vevsutvikling på grunn av sin lille størrelse, gjennomsiktighet, tilgjengelige verktøy og overlevelse uten fôring i opptil fem dager1,2. Det har i stor grad bidratt til forståelsen av nyreutvikling og bevaring mellom sebrafisk og pattedyr3,4,5. Nyrene spiller en viktig rolle i å opprettholde væske homeostase, filtrere blodet og skille ut avfall6. Nephron, den funksjonelle enheten av nyrene, består av et blodfilter koblet til en lang tubule. I sebrafisk dannes to nyrestrukturer gjennom hele livet. Pronephros (den midlertidige embryonale nyren) dannes først under tidlig utvikling. Den består av to nephrons som løper langs den fremre bakre aksen og blir funksjonell på rundt 2 dager etter befruktning (dpf). Nytten av pronephros ligger i sin enkelhet, og har bare to nephrons som for det meste er lineære og enkle å visualisere (selv om den proksimale konvoluterte tubule begynner å spole på tre dpf)3. Dette har lagt til rette for ikke bare studier av den tidlige utviklingen fra mellomliggende mesoderm, men også segmenteringsmønsteret og tubule reparasjon7,8.
Nytten av sebrafisk blir begrenset etter fem dpf, når eggeplommen er redusert og larvene er avhengige av fôring i vannsystemet9. Rundt 2 uker gammel gjennomgår larvene metamorfose til ungdommer, hvor nye vev dannes og gamle vev går tapt og / eller omorganiseres9. Dette er også når mesonephros (den permanente voksne nyre) danner10,11,12. Den første voksne nephron dannes nær den sjette somite, og smelter sammen med den distale tidlige tubule av pronephros. Ytterligere nephrons legges til bakre til denne posisjonen i utgangspunktet, men også mot fremre senere. De primære nephrons i denne første bølgesikringen til tubuliene til pronephros og deler en felles lumen for å deponere avfallet. Sekundære nephrons dannes i neste bølge og smelter til primære nephrons. Denne gjentakende prosessen skaper en mesonephros som er forgrenet, noe som ligner pattedyrets nyre. Antagelig mister de utsattephros til slutt sin tubule identitet og blir to store samlekanaler der alle nephrons drenerer avfallet13.
Før dannelsen av den første voksne nephron begynner enkle stamceller å vises i ~ 4 mm (total lengde) larver (~ 10 dpf). Disse cellene, som er merket i Tg (lhx1a-EGFP) transgene linjen, holder seg til pronephros og ser ut til å migrere til fremtidige steder av nefogenese. Enkeltcellene samles i klynger, som skiller seg ut i nye nephrons12. Det er uklart hvor disse cellene ligger eller hvilke gener de uttrykker før mesonephrogenesis.
Å forstå mesonephros utvikling gir innsikt i pattedyr nyre på måter som pronephros ikke kan. Disse inkluderer dannelsen av nephrogenic aggregater fra enkelt forfedre celler, funksjonell integrasjon av nye nephrons med eksisterende, og forgrening morphogenesis. Det er imidlertid begrensninger for å studere postembryonisk utvikling. Larvene er mindre gjennomsiktige på grunn av deres større størrelse og har pigmentering. Utviklingstidslinjen er ikke synkron blant enkeltdyr og er svært avhengig av miljøfaktorer som fôring og trengsel9,14. Selv om knockdown reagenser eksisterer, er de mindre effektive i larver sammenlignet med embryoer15. I denne protokollen beskrives en in situ hybridiseringsmetode for å bestemme genuttrykk under sebrafisk mesonephros utvikling. Flere trinn er optimalisert for å øke visualiseringen av mesonephros og penetrasjon og vasking av sonden og antistoffet. Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) brukes sammen med en sonde for EGFP for å merke enkle stamceller, nefrogene aggregater og de distale tubuliene av nascent nephrons. Denne metoden vil gi en dypere forståelse av mesonephros utvikling og innsikt i regenerative terapier.
In situ hybridiseringsmetoden beskrevet her er rettet mot å studere mesonephros utvikling. Det kan imidlertid brukes til å studere utviklingen av andre vev og organer under metamorfose, som tarm, nervesystem, skalaer og pigmentering14. Sonder kan genereres for endogene gener eller fluorescerende markører i transgene linjer.
Det er viktig for larvene å forbli intakte for å observere organer og vev i sin opprinnelige sammenheng. For å beholde vevsintegritet…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen ble gitt av Pennsylvania Academy of Science, og Commonwealth of Pennsylvania Biologists, og Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology, og Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) ble levert av Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh).
Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
Hatchfry encapsulation | Argent | ||
Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
Spirulina microfine powder | Argent | ||
SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |