Summary
Um protocolo detalhado é apresentado aqui para descrever um modelo organoide in vitro de células epiteliais nasais humanas. O protocolo tem opções de medições que requerem equipamentos de laboratório padrão, com possibilidades adicionais de equipamentos e softwares especializados.
Abstract
A terapia individualizada para pacientes com fibrose cística (CF) pode ser alcançada com um modelo de doença in vitro para entender a atividade e restauração do Regulador de Condutância de Fibrose Cística De base (CFTR) atividade e restauração de compostos de pequenas moléculas. Nosso grupo recentemente se concentrou em estabelecer um modelo organoide bem diferenciado diretamente derivado das células epiteliais nasais primárias (HNE). A histologia de organoides seccionados, coloração imunofluorescente de montagem total e imagem (utilizando microscopia confocal, microscopia imunofluorescente e campo brilhante) são essenciais para caracterizar organoides e confirmar a diferenciação epitelial na preparação para ensaios funcionais. Além disso, os organoides HNE produzem lúmens de tamanhos variados que se correlacionam com a atividade do CFTR, distinguindo entre organoides CF e não-CF. Neste manuscrito, a metodologia para a cultura de organoides de HNE é descrita em detalhes, com foco na avaliação da diferenciação utilizando as modalidades de imagem, incluindo a medição da área de lúmen de linha de base (método de medição da atividade cftr em organoides que qualquer laboratório com microscópio pode empregar) bem como a abordagem automatizada desenvolvida para um ensaio funcional (que requer equipamentos mais especializados).
Introduction
Introdução à técnica
Os ensaios ex-vivos baseados na cultura são uma ferramenta cada vez mais utilizada para a medicina de precisão e o estudo da fisiopatologia da doença. A cultura celular epitelial humana primária (HNE) tem sido utilizada em inúmeros estudos de fibrose cística 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , uma doença recessiva autossômica que afeta a função celular epitelial em múltiplos órgãos. A cultura HNE fornece uma fonte renovável de epitélia das vias aéreas que pode ser obtida prospectivamente e recapitula qualidades eletrofísicas e bioquímicas para testar a atividade do Regulador de Condutância Transmembrana de Fibrose Cística (CFTR). As células HNE podem ser amostradas com efeitos colaterais mínimos14, semelhantes aos cotonetes respiratórios virais comuns. Um trabalho de pesquisa descrevendo um modelo para estudo de fibrose cística derivado de biópsias de escova de HNE foi publicado recentemente11,13. Enquanto semelhante a outros modelos que utilizam hneprimário 2,3 e tecido intestinal 15,16,17,18,19, caracterização detalhada da diferenciação e imagem deste modelo são descritos aqui para uso em pesquisa cf e para auxiliar nos estudos de outras doenças das vias aéreas13 . O modelo organoide não é ilimitado como linhas celulares imortalizadas, mas pode ser expandido por reprogramação condicional (usando fibroblastos alimentadores irradiados e inativados e inibidores de Rho-kinase) para um estado mais parecido com células-tronco 20,21,22,23. O processamento de biópsias de escova de HNE usando este método produz um grande número de células epiteliais para uso em múltiplas aplicações a maior rendimento, mantendo ainda a capacidade de diferenciar totalmente. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido usando células alimentadoras, outras metodologias podem ser usadas por pesquisadores que desejam evitar a tecnologia de célulasalimentadoras 14,24.
Importância da técnica para a biologia pulmonar
Um estudo significativo tem sido dedicado a entender como a ausência de CFTR regular e funcional na membrana celular das células epiteliais resulta em disfunção nos pulmões, pâncreas, fígado, intestino ou outros tecidos. O transporte de íons epiteliais disfuncionais, particularmente o de cloreto e bicarbonato, resulta em um volume reduzido dos fluidos de revestimento epitelial e mudanças nas secreções mucosas, levando à estase mucosa e obstrução. Em outras doenças das vias aéreas, como a diskinesia ciliar primária, o movimento ciliar alterado prejudica o desembaraço mucociliar e leva à mucosa estase e obstrução25. Portanto, o atual modelo organoide do HNE foi desenvolvido para várias aplicações, dependendo do projeto experimental e recursos do pesquisador. Isso inclui imagens de células vivas usando manchas de células vivas; fixação e secção para caracterizar a morfologia; coloração de imunofluorescência com anticorpos e imagens confocal de montagem inteira para evitar a interrupção das estruturas intraluminais; e imagem de campo brilhante e tomografia de coerência micro-óptica para medições quantitativas de frequência de batida ciliar e transporte mucociliary13. Para facilitar a expansão para outros investigadores, foram utilizados reagentes e suprimentos disponíveis comercialmente para cultivo. Foi desenvolvido um ensaio funcional que utilizou técnicas comuns de microscópio e equipamentos mais especializados. No geral, enquanto o modelo atual foi projetado para avaliar a atividade do CFTR na linha de base ou em resposta à terapêutica, as técnicas descritas neste protocolo podem ser aplicadas a outras doenças que envolvam função celular epitelial, especialmente o transporte de fluidos celulares epiteliais.
Comparação com outras metodologias
Recentemente, a utilidade deste modelo organoide foi desenvolvida correlacionando respostas moduladoras in vitro CFTR dos organoides dos pacientes com sua resposta clínica11. Notavelmente, também é demonstrado que o modelo atual paralelamente às respostas de corrente de curto-circuito, o padrão-ouro atual para avaliar a função CFTR, nos mesmos pacientes. A corrente de curto-circuito difere do ensaio de inchaço porque o primeiro mede a função CFTR via transporte deíons 26. Em contrapartida, este ensaio mede um efeito mais a jusante com o transporte de fluidos, fornecendo informações adicionais sobre a função global da CFTR 27,28,29,30,31,32. As medições de corrente de curto-circuito continuaram a ser um método comum e confiável para determinar a atividadedo canal de cloreto de CFTR 1,33. Esses ensaios eletrofisiológicos exigem equipamentos especializados e caros, requerem muitas vezes mais células para cada replicação experimental do que o ensaio organoide, não podem ser facilmente automatizados, e não são capazes de escalar para aplicações de maior rendimento. Outro modelo organoide derivado da epitélia intestinal tem vantagens adicionais 15,16,17,18, como uma excelente capacidade replicativa, mas não é derivado de um tecido das vias aéreas nem está universalmente disponível. As escovações de HNE são obtidas com escovas de citologia baratas sem a necessidade de sedação e com risco mínimo. A escovação não requer um médico e pode ser realizada por coordenadores de pesquisa treinados e outras equipesde pesquisa 14. O modelo organoide do HNE pode ser cultivado por qualquer laboratório com capacidades primárias de cultura celular, e algumas das aplicações podem ser realizadas com técnicas padrão de microscopia. Ao todo, essas vantagens fornecem acesso adicional à tecnologia para avaliação da função epitelial das vias aéreas que, de outra forma, poderiam estar indisponíveis para alguns laboratórios. Além disso, os organoides de HNE podem ser utilizados para estudar outros estados da doença que afetam as vias aéreas, como a diskinesia ciliar primária25 ou infecção viral, que os organoides intestinais não podem.
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Protocol
Amostras de HNE foram coletadas no hospital Infantil do Alabama. Todos os procedimentos e métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade IRB do Alabama em Birmingham (UAB IRB #151030001). Para facilitar a expansão e melhorar a função das células epiteliais nasais humanas (HNEs), os métodos atuais de cultivo são adaptados do conhecido método de cultura de interface ar-líquido (ALI) 28,34. As HNEs foram inicialmente coletadas por biópsia de escova, como descrito anteriormente12,14, sendo a única diferença o uso de uma escova de citologia. Todas as etapas de processamento de amostras e cultura celular foram realizadas no gabinete de biossegurança.
1. Cultura celular e expansão de células epiteliais nasais
- Após a escovação, armazene a amostra de biópsia nasal em 8 mL de mídia RPMI em um tubo cônico de 15 mL no gelo e transfira-a para o laboratório dentro de 4h (não mais que 24 h).
- Dissociar a biópsia da escova nasal em 8 mL de mídia RPMI em um tubo cônico de 15 mL passando a escova de citologia através de uma ponta de pipeta de furo grande de 1 mL (corte a ponta) várias vezes até que a escova esteja livre do tecido.
- Centrifugar as células a 500 x g por 5 min a 4 °C, remover o supernasce e, em seguida, suspender novamente a pelota celular em 3 mL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) e incubar à temperatura ambiente por 16 minutos para digerir.
- Use 5 mL de mídia de expansão (Tabela 1) para lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione células a um frasco T75 pré-semeado com fibroblastos 3T3 irradiados e inativados22 (50%-60% de confluência) para co-cultivar as células e expandir-se na mídia de expansão por 7-14 dias (ver Figura 1 para a colônia apropriada). Antes do uso, teste os fibroblastos 3T3 irradiados para garantir que eles não possam se proliferar, o que influenciará negativamente a expansão das células epiteliais.
NOTA: Descarte as células se a confluência da célula epitelial nasal não atingir 70% dentro de 14 dias. - Para as células derivadas de pacientes com CF, introduza quatro antibióticos (100 μg/mL de tofilicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B, 100 μg/mL de ceftazidime, 100 μg/mL de vancomicina, ver Tabela de Materiais) na mídia de expansão para desinfecção das células nos primeiros 3 dias de cultura e, em seguida, substituir a mídia por mídia de expansão livre de antibióticos mudando a mídia a cada 2 dias.
NOTA: Este uso limitado de antibióticos destina-se a reduzir a perda de cultura devido à colonização bacteriana, ao mesmo tempo em que incentiva a proliferação após a retirada dos antibióticos adicionais. Esses antibióticos podem ser adaptados aos resultados específicos de microbiologia do paciente, com sensibilidades, se necessário. - Colher HNEs da cocultura usando o método de trippsinização dupla22 uma vez que as células atingem aproximadamente 80% de confluência. Este método garante que os fibroblastos 3T3 irradiados e inativados sejam removidos do frasco, e eles não contaminam a semeadura organoide subsequente.
- Lave as células com 1x DPBS e adicione 1,5 mL de 0,05% de trypsin-EDTA no frasco T75 por 4 min a 37 °C para remover o fibroblasto 3T3 irradiado e inativado da cultura.
- Enxágüe o frasco T75 com 1x DPBS duas vezes para lavar completamente todos os fibroblastos 3T3 restantes; adicionar 1,5 mL de 0,05% trypsin-EDTA no frasco T75 por 10 min a 37 °C para desacoplar HNEs.
- Neutralizar a trippsina com inibidor de trippsina de soja (ver Tabela de Materiais) em uma proporção de 1:1. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min, e depois remover o supernante. Depois de lavar as células com 5 mL de mídia de expansão uma vez, as células estão prontas para semeadura para cultivar organoides.
NOTA: Recomenda-se que hnes com um número de passagem de três sejam usados para outros experimentos.
2. Crescimento e diferenciação de organoides em slides e inserções culturais
- Descongele a matriz extracelular da cultura organoide (ECM) durante a noite a 4 °C. Dicas de pipeta frias para 4 °C e slides de angiogênese de 15 poços (ver Tabela de Materiais) durante a noite a 4 °C.
NOTA: O ECM deve ser colocado a 4 °C na noite anterior à colheita da célula. - Cubra os slides com 5 μL de frio 100% ECM no gelo (pipeta 5 μL de frio 100% ECM com uma ponta de pipeta fria em cada poço do escorregador de 15 poços), e, em seguida, coloque-os em uma incubadora de cultura celular a 37 °C por pelo menos 30 minutos para consolidação.
- Conte os HNEs colhidos da cocultura usando um hemocitômetro e dilua as células para 500 células/μL no número total com 20% de ECM diluído por meios de diferenciação (Tabela 2) no gelo. Em seguida, semente 5 μL da mistura célula fria/ECM em cada poço dos slides revestidos com ECM.
- Transfira imediatamente os slides para uma incubadora de cultura a 37 °C por 1 h para consolidar a mistura celular/ECM.
- Alimente as células em cada poço dos slides de angiogênese de 15 poços com 50 μL de mídia de diferenciação. Mude a mídia a cada dois dias até que os organoides estejam prontos para mais experimentos.
NOTA: Os organoides geralmente podem ser visualizados após 1-2 dias. Existem 20-90 organoides comumente formados em cada poço dos slides. Os organoides normalmente podem sobreviver por 40-60 dias em ECM com alimentação a cada dois dias quando mantidos em uma incubadora umidificada a 37 °C. - Cultura os organoides nas pastilhas de cultura (ver Tabela de Materiais) para maior quantidade para aplicações específicas (como secção para histologia ou imunofluorescência) conforme as etapas mencionadas abaixo.
- Para cultivar organoides nas pastilhas de cultura, prepare a cultura organoide ECM, pontas de pipeta e inserções como mencionado nas etapas 2.1-2.2. Cubra as pastilhas com 100 μL de ECM frio 100%.
- Semente 60 μL de mistura celular/ECM (500 células/μL com 20% de ECM em mídia de diferenciação) em cima do revestimento ECM na pastilha.
NOTA: Todas as outras etapas para a confecção de organoides nas pastilhas são as mesmas conduzidas nos slides, etapas 2.4-2.5. - Adicione 600 μL da mídia de diferenciação na parte inferior da inserção. Mude a mídia a cada dia alternado até que os organoides sejam usados para experimentos, normalmente de 2 a 3 semanas.
3. Preparação e isolamento de organoides para imunofluorescência de montagem integral
- Isolamento e fixação de organoides
- Pré-trate slides de câmara de 8 poços com adesivo de célula (ver Tabela de Materiais) por 30 minutos após a referência35. Depois de descartar a solução, seque os poços por 30 minutos.
- Para colher os organoides, remova a mídia da parte superior do ECM e, em seguida, adicione 50 μL de PBS frio 1x em cada poço dos slides de 15 poços no gelo (1:1 com volume ECM).
- Pipeta para cima e para baixo 3-5 vezes usando 200 μL da ponta de pipeta de furo grande, e, em seguida, dispensar a solução no centro de um poço dos slides de câmara de 8 poços.
- Remova imediatamente o excesso de líquido dos poços por uma pipeta de ponta fina. Em seguida, coloque a câmara deslizando em uma incubadora de 37 °C por 40 minutos para melhorar o organoide aderindo ao fundo do vidro.
- Depois de lavar suavemente com 1x PBS duas vezes, fixe os organoides com 300 μL de 4% de paraformaldeído em cada poço por 30 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Lave duas vezes com 1x PBS e armazene os organoides em 1x PBS a 4 °C para imunostaining por até 2 semanas.
- Coloração de imunofluorescência
- Para reduzir a auto-fluorescência, adicione 250 μL de 50 mM NH4Cl em 1x PBS em cada poço dos slides em RT por 30 min enquanto treme suavemente em um shaker a 20 rpm.
- Depois de lavar com 1x PBS duas vezes, permeabilize as células com Triton X-100 de 0,1% por 30 min no RT enquanto treme suavemente a 20 rpm.
- Depois de lavar com 1x PBS duas vezes, adicione 300 μL de solução de bloqueio, incluindo 5% BSA e 0,1% Triton X-100 em 1x PBS, em cada poço por 1 h na RT.
- Após a lavagem, adicione anticorpos primários nos poços apropriados seguidos por anticorpos secundários (ver Tabela de Materiais). Prepare soluções primárias e secundárias de anticorpos em 2% BSA e 0,3% Triton X-100 em 1x PBS. Incubar todos os anticorpos primários a 4 °C durante 2 dias e todos os anticorpos secundários a 4 °C durante 1 dia.
NOTA: As concentrações finais dependem da proteína desejada para o experimento. Verifique a concentração de estoque na ficha técnica do fabricante. Em seguida, calcule as concentrações finais com base nas diluições utilizadas na Tabela de Materiais. - Após a incubação, lave os poços bem com 1x PBS e adicione DAPI em 2% BSA e 0,3% Triton X-100 em cada poço para coloração nuclear.
- Imagem dos organoides usando um microscópio de varredura a laser confocal, com um objetivo de imersão em óleo de 20-60x (ver Tabela de Materiais). Use o modo Z-stack para definir os limites superiores e inferiores da imagem e use o tamanho ideal de etapa Z recomendado determinado pelo software confocal.
NOTA: Foram utilizados os seguintes quatro comprimentos de onda de excitação a laser confocal: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm e 637,9 nm.
4. Preparação e isolamento de organoides para secção histológica
- Para colher os organoides para estudos histológicos, remova a mídia da cultura e adicione 50 μL de PBS frio 1x em cada poço dos slides no gelo.
- Pipeta para cima e para baixo três a cinco vezes usando uma ponta de pipeta de 200 μL de furo grande, combine todas as soluções do slide de 15 poços ou inserções de cultura em um tubo cônico de 15 mL no gelo. Ajuste o volume total da solução no tubo para 10 mL adicionando PBS a frio adicional de 1x.
- Centrifugar o tubo a 4 °C, 300 x g por 5 min; aspirar o supernascer e adicionar 60 μL de histogel quente (ver Tabela de Materiais) para misturar com a pelota organoide usando um 200 μL da ponta de pipeta de grande furo.
- Transfira imediatamente a suspensão para um molde de histologia. Após a consolidação do histogel à temperatura ambiente, coloque o bloco de molde em 4% de paraformaldeído para fixação durante a noite a 4 °C.
- Depois de incorporar em parafina, corte o bloco de histogel em seções transversais de 5 μm (por exemplo, com um microtoma), fixe as seções em lâminas de vidro e manche usando hematoxilina e eosina (H&E) ou anticorpos rotulados por imunofluorescência. Faça imagens usando um microscópio de campo brilhante ou microscópio de epi-fluorescência invertido (ver Tabela de Materiais).
5. Imagem de organoides vivos
NOTA: As seguintes etapas são realizadas utilizando um sistema automatizado de imagem (ver Tabela de Materiais). Diferentes sistemas de imagem precisam adaptar essas etapas seguindo as instruções específicas do fabricante. Independentemente dos equipamentos utilizados, os organoides vivos de imagem requerem uma câmara ambiental controlada pela temperatura e umidificada com um controlador de gás CO2 acompanhado.
- Para monitorar a diferenciação de organoides antes de realizar um ensaio de inchaço funcional36, capture todas as imagens de slides manualmente com qualquer microscópio de campo brilhante ou com um sistema automatizado de imagem, conforme detalhado abaixo.
- Ligue a energia para o sistema de imagem automatizado e o controlador de gás CO2/O2 e permita que o sistema complete a calibração automatizada (~30 min).
- Após a conclusão, defina a temperatura do sistema de imagem para 37 °C; adicionar 15 mL de água estéril ao reservatório de umidificação, abrir as válvulas de CO2 , fechar as tampas e deixar o sistema de imagem pré-incubar por um mínimo de 30 minutos antes da imagem.
- Abra o software de imagem automatizado para configurar um protocolo de imagem e escolha o local para salvar os dados experimentais brutos.
NOTA: Um arquivo de protocolo de exemplo (Arquivo Suplementar 1), específico para o sistema de imagem, foi fornecido como um modelo para a imagem automatizada de organoides para monitorar a diferenciação organoide. - Uma vez atendidas as configurações ambientais, transfira imediatamente até dois slides de 15 poços com tampas para a câmara ambiental na inserção do suporte de slides do sistema de imagem automatizado (ver Tabela de Materiais).
- Selecione os poços a serem imagens e inicie a imagem para completar a imagem dos poços desejados.
NOTA: As configurações básicas recomendadas são: 4x e 10x de ar objetivo, canal de campo brilhante, montagem 2 x 2 para 4x objetivo para cobrir toda a área do poço, 4 x 4 montagem para um objetivo de 10x. Configurações de pilha Z: três a seis fatias de pilha Z, tamanho de etapa Z = 50-100 μm, uma a duas fatias abaixo do ponto de foco automático e três a cinco fatias acima.
- Para fotografar organoides vivos para uso em um ensaio de inchaço induzido por forskolina (FIS), use um microscópio com um estágio automatizado equipado com uma câmara de imagem ambientalmente controlada que permite temperatura e controle de CO2 .
- Comece com as etapas 5.1.1-5.1.4, substitua o arquivo de protocolo na etapa 5.1.3 com o fornecido no arquivo de protocolo de exemplo (Arquivo Complementar 2) contendo configurações específicas para a realização de um ensaio FIS.
- Antes de cada experimento, ajuste as configurações de exposição avaliando pelo menos três poços para cada slide (extrema esquerda, médio e extrema direita). Aplique os deslocamentos de coordenadas X e Y para garantir que o objetivo estará no centro do poço para todos os poços.
NOTA: As configurações básicas recomendadas são: 4x objetivo de ar, Canal 1 = Campo Brilhante, Canal 2 = DAPI, montagem 2 x 2 (quatro telhas de imagem). Configurações de pilha Z: três a quatro fatias de pilha Z, tamanho de etapa Z = 50-100 μm, uma fatia abaixo do ponto de foco automático e duas a três fatias acima. Tempo de aquisição de imagem: 8 h com intervalos de 20 minutos (Leituras totais = 25; Leia 1 é T = 0). - Uma vez que todas as configurações sejam adequadamente selecionadas, escolha os poços para imagem para ambos os slides ou selecione todos e comece a execução de acordo com as instruções do equipamento.
- Depois de executar, salve o experimento, feche o software de imagem e desligue o sistema de imagem37.
6. Medições de lúmen de linha de base
NOTA: Isso é feito usando software de análise de imagem manual (ver Tabela de Materiais). Uma metodologia semelhante pode ser seguida usando um software de código aberto38 ou qualquer software que possa medir a área de uma região em uma imagem.
- No software, abra o Painel de Medição Automatizado clicando com o botão direito do mouse na parte inferior da tela, selecione Medição e, em seguida, Resultados de Medição Automatizados. A área de cada região de interesse (ROI) medida aparecerá lá.
- Abra a imagem organoide no software e selecione 5-10 organoides com lúmens visíveis.
NOTA: Lúmens será uma área circular no meio do organoide que é visivelmente diferente da cor do resto do organoide (Figura 2A). - Usando o recurso de medição do ROI do polígono, mantenha o clique direito na imagem para abrir o menu e selecione ROI poligonal para delinear o organoide completo para obter a área total de superfície (TSA) do organoide. Em seguida, usando o mesmo recurso, delineie a área de lúmen (LA) (Figura 2B).
- Repita para os organoides restantes no poço e todos os poços do ensaio.
- Exporte os dados para se destacar. Divida o LA pela TSA e média de todos os organoides da amostra para obter a Taxa de Lumen de Linha de Base (BLR)11,13.
NOTA: Normalmente, ~87% dos organoides não CF terão um BLR acima de 0,6, e 97% serão mais de 0,5, enquanto apenas 14% dos organoides CF terão um BLR acima de 0,6, e 31% serão mais de 0,5.
7. Pré-tratamento e imagem automatizada de organoides HNE
NOTA: Todas as etapas de pré-tratamento são realizadas em um armário limpo de biossegurança. Pré-configure o sistema automatizado de imagem e o software para gravação do ensaio antes do passo 7.1. A incubação com DAPI é opcional, mas é recomendada como uma falha segura se a qualidade das imagens de campo brilhante for comprometida. Neste caso, o canal DAPI (377 nm) pode ser analisado.
- Pré-incubar os organoides em um poço de slides de 15 poços com 50 μL de mídia diferenciada contendo DAPI com ou sem 100 μM de CFTRinh-172 (ver Tabela de Materiais) em uma incubadora de 37 °C por 1 h. Enquanto os organoides incubam, realize a etapa 5.2.1 usando um protocolo personalizado de ensaio de inchaço após o Arquivo Complementar 2.
- Remova o meio de pré-incubação usando uma pipeta Pasteur de vidro com aspiração. Adicione 10 μM de forskolin e 100 μM de IBMX (coquetéis de estimulação) (ver Tabela de Materiais) para um volume total de 50 μL de mídia de diferenciação em cada poço.
NOTA: Certifique-se de que não são introduzidas bolhas nos poços. Bolhas nas imagens afetarão a análise automatizada. - Sem demora, inicie o protocolo de imagem FIS seguindo a etapa 5.2.2 a 5.2.4. Adquira imagens a cada 20 minutos em cada poço, com um tempo total de execução de 8h.
8. Análise automatizada do ensaio de inchaço induzido por forskolina em organoides HNE
- Abra o software automatizado de análise de imagens, encontre o experimento previamente salvo da etapa 7.3 e traga as imagens do experimento.
- Escolha a janela do vaso a ser avaliada e selecione a opção contendo as imagens processadas que foram costuradas e projetadas por Z. Esta etapa deve fornecer uma imagem de todo o poço com todos os organoides dentro do quadro de imagem para avaliação e medições de mascaramento.
- Escolha a imagem do poço para avaliar. Selecione Analisar. Repita este processo para outras imagens para garantir o mascaramento adequado para todas as imagens incluídas nas medidas automatizadas. Salve os parâmetros de configuração.
- Após concluir as configurações de análise, aplique as alterações. O software alterará as medições com base nas configurações.
NOTA: Após a conclusão do pré-processamento da imagem inicial, devem ser realizadas medidas de controle de qualidade (QC) para garantir uma mascaramento consistente. Estes incluem revisar manualmente todos os poços para garantir que os organoides estejam dentro do quadro de imagem, bolhas ou detritos não sejam mascarados inadequadamente e verificar a mascaramento em campos brilhantes e canais DAPI. - Exportar os dados para a análise sumária (incluindo gráficos e análises estatísticas).
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Representative Results
A expansão dos HNEs é essencial para uma cultura organoide próspera. Os HNEs de uma coleção de amostras bem sucedida devem expandir-se para mais de 70% de confluência em torno de 10 dias. Um exemplo de amostras bem sucedidas e mal sucedidas é mostrado na Figura 1A e Figura 1B, respectivamente. As células devem ser descartadas se não puderem atingir 70% de confluência até 14 dias após a cocultura com células 3T3 irradiadas. Quaisquer células contaminadas devem ser imediatamente descartadas se não forem capazes de resgatar com agentes antimicrobianos adicionais rapidamente.
O crescimento dos organoides foi comparado em slides de 15 poços e inserções culturais. As pastilhas de cultura são mais grossas e distantes do objetivo do que os slides otimizados opticamente, impactando a imagem e a resolução. Apesar disso, não foi observada diferença significativa na morfologia nesses dois métodos culturais, como mostra a Figura 2. Diferenças morfológicas podem ser observadas entre organoides não CF e CF, como mostrado na Figura 3A. Organoides não CF tendem a ter um lúmen maior contendo mais fluido dentro dele. Em contraste, os organoides cf geralmente têm um lúmen menor com menos fluido e às vezes são preenchidos com muco e detritos. O tamanho do lúmen foi medido manualmente (Figura 3B), e a razão lúmen da linha de base foi calculada e mostrada na Figura 3C. Os organoides transversais foram caracterizados por h&e e coloração de imunofluorescência. As imagens representativas são mostradas na Figura 4A,B. Marcadores epiteliais das vias aéreas como cília, muco e junção apertada são demonstrados em organoides por manchas imunofluorescentes de montagem total mostradas na Figura 5A-D. Dependendo da aplicação, a imunofluorescência seccionada ou integral pode ser empregada. O método de montagem total mantém a natureza tridimensional do organoide, mantendo o interior do organoide intacto, como mostrado no trabalho publicado anteriormente13.
A função CFTR foi avaliada pelo ensaio de inchaço induzido por forskolina (FIS) utilizando um sistema de imagem automatizado. Apenas slides de 15 poços são usados para ensaios funcionais devido à melhor resolução de imagem. Um experimento representativo de dose-resposta de forskolin de voluntários não-CF (n = 5 sujeitos) é mostrado na Figura 6A para ilustrar a lógica do tempo e análise otimizado da imagem. Os dados comparando respostas organoides não CF e CF estão detalhados em publicações anteriores11,13. Uma dose-resposta mostra a mudança incremental na atividade do CFTR para demonstrar a melhor abordagem das medições. Foram avaliadas a duração do ensaio de 1 h e 8 h (Figura 6B,C) bem como a análise utilizando alteração fracionária média (AFC) versus área sob a curva (AUC) nas Figuras 6C,D. Com base em nossa experiência anterior, o inchaço para a maioria dos sujeitos e condições planalto após 8h, e em alguns casos, resulta em estouro dos organoides ao longo desse tempo. Portanto, os ensaios foram limitados apenas a 8h. Neste comprimento de ensaio estendido, o inchaço torna-se não linear. O uso da AUC também considera tanto as mudanças de tamanho quanto a taxa de mudança. Por isso, utilizou-se o AUC acima de 8h para todos os ensaios fis na metodologia final.
Figura 1: Imagens de campo brilhante de HNEs na co-cultura. Os HNEs expandem-se em meios de expansão com fibroblastos 3T3 irradiados e inativados por 10 dias. Um microscópio de campo brilhante invertido é usado para a imagem das células. (A) Os HNEs crescem bem em um grande aglomerado (seta preta). Em contraste, em (B), os HNEs crescem mal em dois pequenos aglomerados (setas negras) ao redor de células 3T3 irradiadas. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Formação organoide de HNE em um slide de 15 poços e inserção de cultura. Imagens de campo brilhante de organoides foram capturadas usando um microscópio de campo brilhante invertido ao longo de 21 dias. Organoides no slide de 15 poços (A) têm imagens mais precisas e nítidas do que as da inserção de cultura (B). Não foi observada diferença morfológica entre os organoides cultivados no slide e na inserção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Tamanho de lúmen organoide (painel A) e medidas de lúmen (Painel B e C). (A) Organoides não CF normalmente têm um lúmen maior e mais fluidos do que os organoides CF (F508del/F508del). (B) Um método para medir manualmente a área total da superfície (TSA) indicada pelo contorno vermelho e área de lúmen (LA) indicada pelo contorno verde em um único organoide. (C) Um exemplo para o uso da área total da superfície e da área do lúmen para calcular a taxa de lumen de linha de base (LA: TSA) em organoides de um sujeito não CF vs. um cf. As barras de erro representam desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Seção transversal dos organoides embutidos na parafina. (A) Um exemplo de coloração de H&E em organoides de um sujeito não CF e CF (F508del/F508del). (B) Mancha imunofluorescente de cílio em um organoide. Verde é o cílio (seta branca) manchado com acetilado-tubulina e anticorpo secundário fitc, e azul é o núcleo rotulado com DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens confocal de imunofluorescência de montagem inteira em organoides. (A,C) Imagens máximas de projeção dos dois organoides representativos. (B,D) Imagens de reconstrução tridimensional de (A) e (C), respectivamente. Um slide de fundo de vidro de 8 poços foi instalado na plataforma de um microscópio confocal, e a lente 40x foi usada para criar os fotomicrógrafos. O software de análise de imagens foi aplicado para imagem e reconstrução das imagens. As setas brancas indicam muco (em B) e cílio (em C) dentro do lúmen dos organoides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Racionalidade para o comprimento do ensaio de inchaço e métodos de análise. Ensaio de inchaço induzido por forskolin (FSK) para testar a função CFTR nas células epiteliais primárias. Diferentes doses de forskolin indicadas nos números foram administradas em organoides de 21 dias de idade nos meios de diferenciação; o inchaço organoide foi imediatamente registrado com o imager automatizado por 8h. Após 8h, o inchaço é mostrado em (A) (n = 5, sujeitos não CF) utilizando alteração fracionária média (AFC). A dose-resposta fsk é comparada com a AFC em 1 h (B) vs. a 8 h (C), o que sugere que o ensaio de 8h pode produzir uma diferença de inchaço mais significativa entre diferentes doses de FSK do que aquelas em 1 h. AFC (C) vs. a área sob a curva, AUC (D) a 8h são comparadas, indicando que a AUC pode refletir uma pequena diferença de inchaço do que a AFC. O eixo X em painéis (B-D) representa as diferentes condições de tratamento correspondentes aos símbolos da legenda da figura. Todas as barras de erro nas figuras indicam desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Todos os componentes para a fabricação da mídia de expansão. As informações detalhadas sobre concentração de estoque de reagentes, armazenamento de estoque, quantidade de estoque para fazer uma mídia de 500 mL e concentração final foram descritas. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Todos os componentes para fazer mídia de diferenciação. As informações detalhadas sobre concentração de estoque de reagentes, armazenamento de estoque, quantidade de estoque para fazer uma mídia de 500 mL e concentração final foram descritas. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Arquivo suplementar 1: Um arquivo de protocolo de exemplo específico para o sistema de imagem é fornecido como um modelo para a imagem automatizada de organoides para monitorar a diferenciação organoide. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo complementar 2: Um arquivo de protocolo de exemplo contendo configurações específicas para a realização de um ensaio FIS. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Este manuscrito fornece metodologias detalhadas para imagens abrangentes ao vivo e fixas dos organoides epiteliais das vias aéreas derivados da biópsia da escova HNE. Descreve ensaios funcionais que podem determinar a atividade do CFTR em um indivíduo. Os HNEs fornecem um tecido primário minimamente invasivo para uma variedade de aplicações. As técnicas de expansão aqui oferecidas podem ser utilizadas para modelar doenças das vias aéreas, incluindo organoides. Organoides podem ser usados para abordagens terapêuticas de precisão e para monitorar a estabilidade de terapias baseadas em genes ou mRNA ao longo do tempo, para o design de teste de precisão e para ajudar na resolução de diagnósticos inconclusivos39. A pesquisa atual é sobre CF, mas esses modelos têm aplicações para outras doenças que afetam a função epitelial.
A expansão inicial do HNE após a biópsia é essencial. Observou-se que os pincéis de citologia produzem números celulares iniciais maiores e melhores resultados do que outras ferramentas de biópsia14. A partir de experiências anteriores, concluímos que a combinação de escovações de ambos os nares em uma única amostra e processamento dessa amostra dentro de 4h produz os melhores resultados. Outros investigadores têm usado prazos mais prolongados desde a biópsia até o processamento com sucesso3. A coleta inicial adequada de biópsias é vital para a expansão subsequente e semeadura como organoides. Fibroblastos irradiados e inativados de alta qualidade para cocultura são necessários, que são cultivados e tratados internamente em nosso laboratório, mas também podem ser comprados comercialmente. Os investigadores são avisados de que nem todos os fibroblastos 3T3 são da mesma linha celular e devem ser validados antes do uso.
Para espécimes não esperados com cultura bacteriana ou fúngica patogênica, o tratamento com antibióticos limita-se ao tratamento padrão de penicilina e estreptomicina para os experimentos descritos neste manuscrito. Para aqueles conhecidos por terem colonização crônica das vias aéreas superiores, um coquetel antibiótico descrito acima é utilizado por apenas 3 dias porque os antibióticos parecem retardar a expansão epitelial e produzir resultados mais fracos nos experimentos descritos aqui. Foram selecionados três dias para equilibrar o risco de contaminação, fornecendo uma taxa de expansão semelhante para espécimes CF e não-CF. Para indivíduos com patógenos incomuns, o tratamento antimicrobiano sob medida pode resgatar culturas contaminadas se reconhecido precocemente ou iniciado a priori. Para biópsias iniciais que são extraordinariamente lentas para crescer, os resultados normalmente serão ruins para estudos organoides. Os investigadores precisam monitorar a taxa de crescimento e a morfologia diariamente. Os meios de cultura internos e os reagentes usados são mais úteis para ensaios de inchaço funcional, mas outras mídias disponíveis comercialmente podem beneficiar outras aplicações 12,25,40,41, dependendo do design experimental. O tipo de ECM utilizado pode levar a diferentes morfologias e resultados diferentes, e os resultados reprodutíveis são críticos. Todos os reagentes usados neste protocolo são rotineiramente testados antes do uso para experimentos. Apesar dessa experiência, algumas culturas não conseguirão expandir ou gerar organoides por razões inexplicáveis. Os pesquisadores são encorajados a considerar esses fatores à medida que otimizam esse protocolo para suas aplicações.
Um tipo específico de slide de 15 poços é usado neste protocolo otimizado para imagens ópticas, utilizando volumes mínimos e maximizando réplicas enquanto reduz os custos. Estes slides têm uma câmara inferior e superior fixada em um deslizamento de cobertura de polímero que minimiza o menisco (que de outra forma prejudicaria a imagem) e também a substituição da mídia sem o risco de desalojar a matriz e destruir as culturas organoides. Estes slides tornam a imagem de campo brilhante e microscopia de manchas ao vivo simples, com semeadura inicial, crescimento e imagem no mesmo prato. Os organoides serão perdidos durante o processo de coleta, fixação e coloração, por isso devem ser tomados cuidados meticulosos durante cada etapa, e números iniciais suficientes devem ser obtidos para garantir o sucesso. O crescimento de organoides nas pastilhas culturais pode ajudar à medida que essas técnicas são desenvolvidas.
Técnicas de imagem que utilizam microscópios de laboratório comuns estão incluídas. No entanto, os ensaios funcionais automatizados usam um sistema de imagem complexo e requer um usuário bem treinado. Este protocolo foi desenvolvido para usuários com um nível básico de experiência usando este microscópio e seu software. Recomenda-se primeiro treinar os indivíduos sobre o uso primário do instrumento e o software por representantes do fabricante; essa mesma prática é seguida em nosso laboratório. Um mínimo de 4 semanas de treinamento foi necessário para usar este microscópio efetivamente para experimentos.
Como descrito acima, essa metodologia tem algumas limitações. São necessárias experiências em coleta de biópsia, tempo de processamento rápido e facilidade com fibroblastos alimentados para expandir e cultivar organoides HNE com sucesso. Este método foi desenvolvido utilizando reagentes e equipamentos específicos que podem não estar disponíveis universalmente. A metodologia tem se mostrado útil para pesquisas em fibrose cística 3,11,13 e pode não ser tão aplicável a outros processos da doença25. No entanto, outros métodos e equipamentos podem ser usados para desenvolver estratégias semelhantes.
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Disclosures
JSG é listado como inventor em um pedido de patente 20170242033 da Universidade da Carolina do Norte que descreve um modelo semelhante. Quando a tecnologia licenciada da UNC produz royalties, os inventores recebem uma parte da receita. Caso contrário, os autores não declaram conflitos de interesse. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, na coleta, análise ou interpretação dos dados, na redação do manuscrito ou na decisão de publicar os resultados.
Acknowledgments
Agradecemos as contribuições de todos os participantes que doaram biópsias de escovas de HNE para desenvolver este protocolo. Agradecemos à latona Kersh e à equipe da Unidade de Pesquisa Infantil por coordenar o recrutamento voluntário de estudos e coleções de amostras. Agradecemos a Lily Deng, Johnathan Bailey e Stephen Mackay, ex-estagiários do laboratório, por assistência técnica. Agradecemos a Zhong Liu e Rui Zhao por sua ajuda técnica. Steven M. Rowe, diretor do Centro de Pesquisa cf da UAB, fornece liderança e recursos, sem os quais este trabalho não seria possível. Também gostaríamos de agradecer a Sarah Guadiana da Biotek pela assistência com o treinamento de instrumentos, Robert Grabski pela assistência de microscopia confocal no Centro de Imagem de Alta Resolução da UAB, e Dezhi Wang por assistência histológica no Núcleo de Histologia da UAB. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH.) Grant K23HL143167 (para JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (para JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 e DK072482 e o CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], e o UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
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