该协议描述了一种通过用肺泡上皮2型细胞,成纤维细胞和内皮细胞重新填充去细胞化精密切割的肺切片来产生可重复的小规模工程肺组织的方法。
需要改进的三维(3D)肺模型,以概括天然肺泡 离体的结构和细胞复杂性。最近开发的类器官模型促进了肺上皮祖细胞 在体外的扩张和研究,但这些平台通常依赖于小鼠肿瘤来源的基质和/或血清,并且仅包含一个或两个细胞谱系。在这里,我们描述了一种基于去细胞化精密切割肺切片(PCLS)的多谱系再细胞化来生成工程肺组织(ELT)的方案。ELT含有肺泡样结构,包括肺泡上皮,间充质和内皮,位于细胞外基质(ECM)底物中,与天然肺非常相似。为了产生组织,用琼脂糖充气,切片成450μm厚的切片,切成条状,去细胞化。然后将所得的无细胞ECM支架与原代内皮细胞,成纤维细胞和肺泡上皮2型细胞(AEC2s)重新播种。AEC2s可在ELT培养中用无血清、化学定义的生长培养基维持至少7天。在整个组织制备和培养过程中,切片被夹入盒式系统中,该系统便于并行处理和标准化多个ELT的细胞接种。这些ELT代表了一个有机细胞培养平台,应该促进研究肺泡内的细胞 – 细胞和细胞 – 基质相互作用以及调节AEC2及其利基质的生化信号。
肺泡是远端肺的功能单元,由肺泡上皮1型细胞(AEC1s)和2型细胞(AEC2s)衬砌的气体交换空气空间网组成。上皮的下方是密集的毛细血管网络以及支撑间充质,所有这些都由细胞外基质(ECM)支架支撑,该支架为这些脆弱的气囊提供强度和柔韧性1。肺泡也是许多肺部病变的损伤部位,包括特发性肺纤维化2、急性呼吸窘迫综合征3 和严重冠状病毒病-19 (COVID-19)4。尽管过去十年的工作已经发现了肺上皮内显着的可塑性,但在某些环境中使远端肺修复的机制 – 以及排除其他环境修复的机制 – 仍然是一个需要深入研究的领域5。开发改进的 体外 平台来模拟肺泡将促进肺泡生物学,再生和治疗的研究。
AEC2s自我更新并分化为AECS1s,因此被认为是远端肺6,7,8的原代干细胞。然而,这些细胞对 体外 研究构成了特殊的挑战,因为与培养原代AEC2s相关的困难而没有表型9的损失。在传统的二维(2D)培养物中,AEC2s变平并采用AEC1样细胞10的一些特征。相比之下,3D培养策略(最常见的是类器官)支持维持原代AEC2s6,11,12 中的差异化特征,并允许长期培养多能干细胞(PSC)衍生的AEC2s13,14。类器官已被用于模拟远端肺发育15,病毒感染11,15和AEC2相关遗传病13,16,17,从而能够对AEC2生物学和再生进行重要见解。然而,这些培养模型通常仅包含一个或两个细胞谱系,并将细胞嵌入凝胶型基质中,这些基质无法概括天然肺泡的结构或ECM底物。
ECM是通过分子,拓扑和机械线索对细胞表型和行为进行的关键调节剂;包括调节干细胞命运的组织特异性生态位的关键组成部分;并作为调节局部分泌生长因子18,19,20,21的可用性的储库。因此,在天然ECM上培养细胞可以增加体外系统的预测能力,以模拟体内组织的生物学。脱细胞化是通过洗涤剂,酶或物理或其他方法从组织中去除细胞物质的过程,当仔细执行时,可以在很大程度上保留天然器官的ECM支架22,23。这种支架可以重新填充细胞以进行3D仿生培养。然而,虽然去细胞化支架广泛用于组织工程应用,但它们在常规细胞培养中的应用受到限制。以前的几项研究已经报道了肺切片或小肺组织节段的脱细胞化和再细胞化。除了概念验证研究24,25,26外,还使用重装肺切片来研究成纤维细胞 – 基质粘附27,28并研究患病肺基质对成纤维细胞表型27,29的影响。随着可用于产生精确切割的组织切片的改进技术,去细胞化的肺切片可以提供一个方便和小规模的平台来培养细胞,同时保留肺泡,气道和血管亚结构。结合多种细胞类型将能够在生理相关的3D环境中研究细胞 – 细胞相互作用。然而,需要改进的策略来促进整个培养过程中组织的处理,并确保具有已知细胞数量的组织的受控和可重复的接种。
在这里,我们提出了一种方案,通过用原代内皮细胞,AEC2s和成纤维细胞重新填充去细胞化精密切割肺切片(PCLS)来生成工程肺组织(ELT)。在我们先前描述的工程心脏组织系统30 和全肺脱细胞化 – 再细胞化策略22,31的改编中,我们描述了从大鼠肺中切割PCLS并将切片夹入可重复使用的组织培养盒中以简化和标准化下游操作的程序。将剪下的切片去细胞化以形成无细胞ECM支架,这些支架在定制的播种浴中重新填充。肺切片支架保留了关键的ECM组件和结构,并支持AEC2在多谱系肺泡样结构内的生长至少7天。ELT代表了生理学相关3D基质中的一种新型肺泡共培养系统,该系统应支持肺组织工程策略的发展,同时促进AEC2s和肺泡的基础生物学研究。
本文描述了使用去细胞化精密切割肺切片作为 在体外生成工程肺组织的平台,其包含多谱系肺泡样结构。通过将我们以前开发的用于重新填充用于整个肺工程的高保真无细胞ECM肺支架的策略22,31与我们用于培养小规模工程心脏组织30的强大系统相结合,该协议能够以可重复和中等通量的方式使用生理相关的肺ECM作为组织培养底物。
这里介绍的方法详细介绍了来自大鼠肺的ELT支架制备,这些方法很容易实现,可以整体提取,直接进入完整的气道进行琼脂糖充气,并且比小鼠肺大。然而,任何可以用琼脂糖充气并产生长度至少为9mm的切片的肺组织都可以在该系统中使用。无论组织来源如何,琼脂糖对肺组织的均匀充气是确保下游组织切片、夹落和组织处理成功的最关键步骤。充气不足的肺组织往往不能切开干净,而过度充气的组织在剪裁过程中可能会撕裂。琼脂糖凝胶化后,适当膨胀的组织区域是坚实的,但当用镊子轻轻按压时,可以提供一点给药。对于完整的大鼠肺,我们发现用空气预充气几次,然后在提取后尽快充气琼脂糖,导致最佳的切片结果和最佳质量的组织支架。琼脂糖的适当体积需要根据经验进行优化;对于大鼠肺,将肺充气至总肺活量所需的体积约为30 mL / kg动物质量(例如,350g大鼠的肺为10.5mL琼脂糖)。对于较大的切除肺组织,气道通路不那么直接(例如来自人类供体的肺组织),可能需要一些额外的故障排除来通过支气管使组织充气32。在随后的肺切片过程中,柱塞上组织的选择和取向是另一个重要步骤,1)确保切片足够大以产生可以夹入组织培养盒中的组织条,以及2)最大化实质(肺泡)组织面积,不包括大气道或血管。
最初,将PCLS夹入组织培养盒中可能是一个具有挑战性的步骤,但盒大大简化了去细胞化和接种过程中的组织处理。可能出现的两个潜在问题是组织撕裂(在剪削过程中,或在去细胞化过程中),或者在夹子中的组织定位导致下游播种不良(例如,没有播种,或仅在末端播种)。撕裂可能是琼脂糖过度充气,插入标签时组织过度拉伸,或在插入标签时留下太少的悬垂以提供足够的组织抓地力的结果。请注意,在一个夹子末端撕裂的切片可能成功播种,但是,由于组织不平坦,因此在培养过程中很难在显微镜下可视化它们。组织播种不良(如图 6C所示)可能是由于切片在两个夹子之间不平放,因此在倒置时与播种浴槽的基部接触不良。另一个可能的原因是将盒体正确安装在播种槽的底部。在剪裁方面,在放置第二个夹子时,在组织中施加稍微更大的张力,以帮助其平放。一些切片有轻微的凹陷;在这些情况下,将凸面朝上夹住切片。在实践中,我们通常会遇到少于2%切片的播种失败。
该协议的一个限制是需要一些专用设备- 激光切割机和3D打印机 – 来生成用于ELT制备的初始材料。然而,一旦创建了组织培养盒和播种槽,就不需要额外的特殊材料。ELT支架制备的肺切片和去细胞化步骤相当耗时;然而,这些步骤可以提前进行,也可以以足以同时准备多个实验的数量进行。许多PCLS(如果针对实质区域进行优化,则为>100)可以从单个肺中切除并快速冷冻以备后用。虽然单个冻融循环可能对ECM46造成轻微的超微结构损伤,但即使多次冻融循环也已被证明不会在ECM23,47中造成重大损失。PCLS也可以在实验前进行剪切和去细胞化,以便在一个月内使用。(值得注意的是,所描述的去细胞化方案可以在大约6小时内完成,这代表了比前面描述的需要一天或更长时间的方法27,28的显着优势。一旦支架准备就绪,细胞接种过程简单快捷,ELT的培养不需要专门的技术。
所描述的ELT方法的一个警告是缺乏区域特异性播种,即AEC2特异性递送到肺泡空间,或内皮细胞特异性地递送到血管空间。然而,尽管细胞只是简单地接种在组织支架的顶部,但再细胞化的模式是非随机的,具有一些肺泡样组织的外观,包括上皮环。我们怀疑细胞 – 细胞相互作用以及ECM组成和几何形状20,21的局部差异可能有助于观察到的再细胞化模式。为了支持这一假设,先前发表的一项研究(其中成纤维细胞非特异性地接种到去细胞化的肺切片上)表明,组织再造群体的模式和相关细胞表型因微观组织区域和ECM支架来源(例如,健康与患病)而显着变化27。还观察到成纤维细胞侵入间质 – 它们位于天然肺组织中的位置1,27。我们可以想象以真正的区域特异性方式在肺切片上培养细胞的主要替代方法需要通过气道31,48和血管室49,50接种完整的去细胞化肺,然后切片再生组织。然而,这种替代方案1)的成本,时间和资源密集程度要高得多;2)吞吐量较低;3)需要增加动物数量;和4)与由于全肺培养的挑战和随后的播种肺切片而增加的污染风险有关。虽然ELT平台没有概括天然细胞组织的各个方面,但它能够以更多实验室可以访问的方式在生理相关的ECM底物上进行肺细胞培养。
ELT系统的灵活性是该平台的主要优点,并且应该允许使用任意数量的组织支架,细胞或感兴趣的培养基进行小规模肺组织培养。使用来自病变组织或损伤模型的支架可以允许在疾病改变的ECM27,29,51的背景下研究细胞 – 细胞或细胞 – 基质相互作用。然而,请注意,脱细胞化方案可能需要进行调整,以解释物种52之间的基质差异。所描述的接种策略可用于任何细胞类型,并且培养时间线适应研究人员的需求。作为起点,每个支架1×106 个细胞应在培养后7天内产生高度细胞组织,而1×105 总细胞导致细胞性差。在时间轴的任何调整中,组织培养盒应在最后一次组织播种后24小时从播种浴中取出。在这里,为了模拟肺泡的一些细胞复杂性,我们描述了一种三培养再细胞化策略,该策略支持在肺泡样结构中维持分化的新生儿AEC2至少7天。我们的研究结果还证明了成纤维细胞和内皮细胞在ELT中的成功移植,强调了培养底物的广泛适用性及其对共培养研究的适用性。在ELT中接种成体细胞可能有助于模拟更静止的肺泡结构,而接种人类PSC衍生的AEC2,包括具有遗传修饰的AEC2,可以促进人类疾病的转化研究13,53。一般来说,ELT平台支持的自下而上的方法提供了研究特定细胞类型对感兴趣读数的贡献的机会 – 例如AEC2增殖或分化状态。
总之,该协议概述了一个强大的系统,用于生成工程肺组织,用于无细胞ECM肺切片支架内AEC2s,成纤维细胞和内皮细胞的共培养研究。ELT代表了一种针对原代AEC2的新型3D培养策略,迄今为止,AEC2通常依赖于生理性较差的凝胶型基质来维持分化良好的表型6,11,12。目前的平台建立在以前在去细胞化肺切片24,25,26,27,28,29的再造块工作的基础上,但提供了几个优点:1)组织培养盒系统,以促进脱细胞化,播种和培养过程中的ELT处理;2)定制的接种浴,以在每个切片支架上精确地接种已知数量的细胞;3)三培养再播种策略,使肺泡组织能够用上皮,间充质和内皮细胞再填充。因此,ELT代表了朝着创建可重复的体外模型迈出的重要一步,这些模型可以捕获天然肺泡和AEC2干细胞利基的细胞和底物复杂性。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢Lorenzo Sewanan和Jorge Nunez开发该协议中使用的组织培养盒设计的工作,Kaminski实验室使用他们的振动切片机,Maurizio Chioccioli和Jessica Nouws协助切肺,Allie LaRocco协助初步试点实验,以及Hong Qian仔细阅读方案。这项工作得到了NIH拨款F30HL143880(K.L.L.),医学科学家培训计划培训补助金T32GM136651(K.L.L.)和U01HL145567(L.E.N.)的支持;并由Humacyte Inc.(L.E.N.)提供的不受限制的研究礼物。
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |