Questo protocollo descrive un metodo per generare tessuti polmonari ingegnerizzati riproducibili su piccola scala, ripopolando fette polmonari decellularizzate tagliate con precisione con cellule epiteliali alveolari di tipo 2, fibroblasti e cellule endoteliali.
C’è bisogno di modelli polmonari tridimensionali (3D) migliorati che ricapitolino la complessità architettonica e cellulare dell’alveolo polmonare nativo ex vivo. Modelli organoidi sviluppati di recente hanno facilitato l’espansione e lo studio dei progenitori epiteliali polmonari in vitro, ma queste piattaforme si basano tipicamente sulla matrice e/o sul siero derivati dal tumore del topo e incorporano solo uno o due lignaggi cellulari. Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di tessuti polmonari ingegnerizzati (ELT) basato sulla ricellularizzazione multi-lineage di fette polmonari decellularizzate tagliate con precisione (PCLS). Gli ELT contengono strutture alveolari che comprendono epitelio alveolare, mesenchima ed endotelio, all’interno di un substrato di matrice extracellulare (ECM) molto simile a quello del polmone nativo. Per generare i tessuti, i polmoni di ratto vengono gonfiati con agarosio, affettati in fette spesse 450 μm, tagliati a strisce e decellularizzati. Gli scaffold ECM acellulari risultanti vengono quindi riseminati con cellule endoteliali primarie, fibroblasti e cellule epiteliali alveolari di tipo 2 (AEC2). Gli AEC2 possono essere mantenuti in coltura ELT per almeno 7 giorni con un terreno di crescita privo di siero e chimicamente definito. Durante il processo di preparazione e coltura dei tessuti, le fette vengono ritagliate in un sistema di cassette che facilita la manipolazione e la semina cellulare standardizzata di più PFU in parallelo. Questi PFU rappresentano una piattaforma di coltura organotipica che dovrebbe facilitare le indagini sulle interazioni cellula-cellula e cellula-matrice all’interno dell’alveolo, nonché i segnali biochimici che regolano gli AEC2 e la loro nicchia.
Gli alveoli sono le unità funzionali del polmone distale, che comprende una rete di spazi aerei a scambio di gas rivestiti da cellule epiteliali alveolari di tipo 1 (AEC1) e cellule di tipo 2 (AEC2). Alla base dell’epitelio c’è una fitta rete di capillari e mesenchima di supporto, il tutto sostenuto da un’impalcatura a matrice extracellulare (ECM) che fornisce forza e flessibilità a queste delicate sacche d’aria1. Gli alveoli sono anche il sito di lesioni in numerose patologie polmonari, tra cui la fibrosi polmonare idiopatica2, la sindrome da distress respiratorio acuto3 e la grave malattia da coronavirus-19 (COVID-19)4. Sebbene il lavoro dell’ultimo decennio abbia scoperto una notevole plasticità all’interno dell’epitelio polmonare, i meccanismi che consentono la riparazione polmonare distale in alcuni contesti – e che precludono la riparazione in altri – rimangono un’area di intensa indagine5. Lo sviluppo di piattaforme in vitro migliorate per modellare l’alveolo faciliterebbe gli studi di biologia alveolare, rigenerazione e terapia.
Gli AEC2 si auto-rinnovano e si differenziano in AEC1, e quindi sono considerati la cellula staminale primaria del polmone distale 6,7,8. Tuttavia, queste cellule rappresentano una sfida particolare per lo studio in vitro date le difficoltà associate alla coltura di AEC2 primari senza perdita di fenotipo9. Nella cultura convenzionale a 2 dimensioni (2D), gli AEC2 appiattiscono e adottano alcune caratteristiche delle celle simili ad AEC110. Al contrario, le strategie di coltura 3D, più comunemente organoidi, supportano il mantenimento di caratteristiche differenziate negli AEC2 primari 6,11,12 e consentono la coltura a lungo termine di AEC2 derivati da cellule staminali pluripotenti (PSC) 13,14. Gli organoidi sono stati utilizzati per modellare lo sviluppo polmonare distale15, l’infezione virale 11,15 e la malattia genetica correlata all’AEC2 13,16,17, consentendo importanti approfondimenti sulla biologia e la rigenerazione dell’AEC2. Tuttavia, questi modelli di coltura comprendono in genere solo uno o due lignaggi cellulari e incorporano le cellule in matrici di tipo gel che non riescono a ricapitolare né l’architettura né il substrato ECM dell’alveolo polmonare nativo.
L’ECM è un regolatore critico del fenotipo e del comportamento cellulare tramite segnali molecolari, topologici e meccanici; comprende una componente chiave delle nicchie tessuto-specifiche che regolano il destino delle cellule staminali; e funge da serbatoio che modula la disponibilità di fattori di crescita secreti localmente 18,19,20,21. La coltivazione di cellule su ECM nativo può quindi aumentare la capacità predittiva dei sistemi in vitro di modellare la biologia dei tessuti in vivo. La decellularizzazione, un processo che rimuove il materiale cellulare dai tessuti tramite detergenti, enzimi o metodi fisici o di altro tipo, può preservare in gran parte l’impalcatura ECM di un organo nativo, se eseguita con cura22,23. Tali scaffold possono essere ripopolati con cellule per la coltura biomimetica 3D. Tuttavia, mentre gli scaffold decellularizzati sono ampiamente utilizzati per applicazioni di ingegneria tissutale, il loro uso per la coltura cellulare di routine è stato limitato. Diversi studi precedenti hanno riportato la decellularizzazione e la ricellularizzazione di fette polmonari o piccoli segmenti di tessuto polmonare. Oltre agli studi proof-of-concept24,25,26, sono state utilizzate fette polmonari ripopolate per studiare l’adesione della matrice fibroblastica27,28 e per studiare l’effetto delle matrici polmonari malate sul fenotipo27,29 dei fibroblasti. Con le tecnologie migliorate disponibili per la generazione di fette di tessuto tagliate con precisione, le fette polmonari decellularizzate potrebbero offrire una piattaforma comoda e su piccola scala con cui coltivare le cellule, preservando al contempo le sottostrutture alveolari, delle vie aeree e vascolari. L’incorporazione di più tipi di cellule consentirebbe studi sulle interazioni cellula-cellula all’interno di un ambiente 3D fisiologicamente rilevante. Tuttavia, sono necessarie strategie migliorate per facilitare la manipolazione dei tessuti durante tutto il processo di coltura e per garantire la semina controllata e riproducibile di tessuti con un numero noto di cellule.
Qui, presentiamo un protocollo per generare tessuti polmonari ingegnerizzati (ELT) ripopolando fette polmonari decellularizzate a taglio di precisione (PCLS) con cellule endoteliali primarie, AEC2 e fibroblasti. In un adattamento del nostro sistema di tessuto cardiaco ingegnerizzato precedentemente descritto30 e delle strategie di decellularizzazione-ricellularizzazione dell’intero polmone22,31, descriviamo le procedure per tagliare PCLS dai polmoni di ratto e per agganciare le fette in cassette di coltura tissutale riutilizzabili che semplificano e standardizzano le manipolazioni a valle. Le fette tagliate vengono decellularizzate per formare scaffold ECM acellulari, che vengono ripopolati in bagni di semina personalizzati. Gli scaffold a fette polmonari preservano i componenti e l’architettura ECM critici e supportano la crescita di AEC2 all’interno di strutture alveolari multi-lineage per almeno 7 giorni. Gli ELT rappresentano un nuovo sistema di co-coltura alveolare all’interno di una matrice 3D fisiologicamente rilevante, che dovrebbe supportare lo sviluppo di strategie di ingegneria dei tessuti polmonari, facilitando al contempo gli studi biologici di base degli AEC2 e degli alveoli.
Questo documento descrive l’uso di fette polmonari decellularizzate tagliate con precisione come piattaforma per generare tessuti polmonari ingegnerizzati in vitro, che contengono strutture alveolari multi-lineage. Combinando le strategie che abbiamo precedentemente sviluppato per ripopolare gli scaffold polmonari ECM acellulari ad alta fedeltà per l’ingegneria polmonare intera22,31, con il nostro robusto sistema per la coltura di tessuti cardiaci ingegnerizzati su piccola scala30, questo protocollo consente l’uso di ECM polmonare fisiologicamente rilevante come substrato di coltura tissutale, in modo ripetibile e moderatamente produttivo.
I metodi qui presentati descrivono in dettaglio la preparazione dell’impalcatura del PFU dai polmoni di ratto, che sono facilmente raggiungibili, possono essere estratti in blocco con accesso diretto alle vie aeree intatte per il gonfiaggio dell’agarosio e sono di dimensioni maggiori rispetto al polmone di topo. Tuttavia, qualsiasi tessuto polmonare che può essere gonfiato con agarosio e produrre fette di almeno 9 mm di lunghezza può essere utilizzato all’interno di questo sistema. Indipendentemente dalla fonte tissutale, l’inflazione uniforme del tessuto polmonare con agarosio è il passo più critico per garantire il successo dell’affettamento, del taglio e della manipolazione dei tessuti a valle. Il tessuto polmonare sottogonfiato tende a non affettare in modo pulito, mentre il tessuto sovragonfiato può lacerarsi durante il clipping. Dopo la gelificazione dell’agarosio, le regioni tissutali opportunamente gonfiate sono sode ma forniscono un po ‘di dare quando vengono premute delicatamente con una pinza. Per i polmoni di ratto intatti, abbiamo scoperto che il pre-gonfiaggio dei polmoni estratti con l’aria più volte, seguito dal gonfiaggio dell’agarosio il prima possibile dopo l’estrazione, si traduce nei migliori risultati di affettamento e nella migliore qualità delle impalcature tissutali risultanti. Il volume appropriato di agarosio deve essere ottimizzato empiricamente; per un polmone di ratto il volume necessario per gonfiare il polmone alla capacità polmonare totale è di circa 30 ml/kg di massa animale (ad esempio, 10,5 mL di agarosio per i polmoni di un ratto da 350 g). Per i tessuti polmonari resecati più grandi con accesso alle vie aeree meno diretto (come quelli provenienti da donatori umani), potrebbe essere necessaria una risoluzione dei problemi aggiuntiva per gonfiare il tessuto attraverso un bronco32. Durante il successivo taglio polmonare, la selezione e l’orientamento del tessuto sullo stantuffo è un altro passo importante per 1) garantire che le fette siano abbastanza grandi da generare strisce di tessuto che possono essere ritagliate in cassette di coltura tissutale e 2) massimizzare l’area del tessuto parenchimale (alveolare), escluse le grandi vie aeree o vasi.
Il clip del PCLS in cassette di coltura tissutale può essere inizialmente un passo impegnativo, ma le cassette semplificano notevolmente la gestione dei tessuti durante la decellularizzazione e la semina. Due potenziali problemi che possono sorgere sono la lacerazione dei tessuti (durante il processo di ritaglio o durante la decellularizzazione) o il posizionamento dei tessuti nelle clip che si traduce in una scarsa semina a valle (ad esempio, nessuna semina o semina solo alle estremità). Lo strappo può essere il risultato di un’eccessiva inflazione di agarosio, di un eccessivo allungamento del tessuto durante l’inserimento della linguetta o di lasciare troppo poca sporgenza per fornire un’adeguata presa del tessuto durante l’inserimento delle linguette. Si noti che le fette che si strappano a un’estremità della clip possono essere seminate con successo, tuttavia, sono difficili da visualizzare al microscopio durante la coltura poiché il tessuto non è piatto. Una scarsa semina dei tessuti (come quella nella Figura 6C) è probabilmente il risultato della fetta che non giace piatta tra le due clip, e quindi fa scarso contatto con la base del bagno di semina bene quando capovolta. Un’altra possibile causa è la posizione impropria della cassetta sul fondo del pozzo del bagno di semina. In termini di clipping, applicare un po ‘più di tensione nel tessuto quando si posiziona la seconda clip per aiutarla a rimanere piatta. Alcune fette hanno una leggera concavità; in questi casi agganciare la fetta con il lato convesso verso l’alto. Con la pratica, in genere sperimentiamo la semina fallita con meno del 2% delle fette.
Una limitazione di questo protocollo è il requisito per alcune attrezzature specializzate – una taglierina laser e una stampante 3D – per generare i materiali iniziali per la preparazione del PFU. Tuttavia, una volta create le cassette di coltura dei tessuti e i bagni di semina, non sono necessari materiali speciali aggiuntivi. Le fasi di affettamento polmonare e decellularizzazione della preparazione dell’impalcatura del PFU sono moderatamente dispendiose in termini di tempo; tuttavia, questi passaggi possono essere eseguiti in anticipo o in numero sufficiente per prepararsi a più esperimenti contemporaneamente. Molti PCLS (>100 se ottimizzati per le regioni parenchimali) possono essere tagliati da un singolo polmone e congelati a scatto per un uso successivo. Mentre un singolo ciclo di congelamento-disgelo può causare danni ultrastrutturali minori all’ECM46, anche più cicli di congelamento-disgelo hanno dimostrato di non causare una perdita significativa in ECM 23,47. PCLS può anche essere tagliato e decellularizzato prima di un esperimento, da utilizzare entro un mese. (In particolare, il protocollo di decellularizzazione descritto può essere realizzato in circa 6 ore, il che rappresenta un vantaggio significativo rispetto ai metodi precedentemente descritti che richiedono un giorno o più27,28.) Una volta preparate le impalcature, il processo di semina cellulare è semplice e veloce e la coltura dei PFU non richiede tecniche specializzate.
Un avvertimento del metodo ELT descritto è la mancanza di semina specifica per regione, cioè la consegna di AEC2 specificamente allo spazio alveolare, o cellule endoteliali specificamente allo spazio vascolare. Tuttavia, sebbene le cellule siano semplicemente seminate sopra le impalcature tissutali, il modello di ricellularizzazione non è casuale, con una parvenza di organizzazione alveolare, compresi gli anelli epiteliali. Sospettiamo che le interazioni cellula-cellula, così come le differenze locali nella composizione e nella geometria dell’ECM20,21, contribuiscano probabilmente ai modelli di ricellularizzazione osservati. A sostegno di questa ipotesi, uno studio precedentemente pubblicato, in cui i fibroblasti sono stati seminati non specificamente su fette polmonari decellularizzate, ha dimostrato che il modello di ripopolamento dei tessuti e i fenotipi cellulari associati variavano significativamente in base alla regione tissutale microscopica e alla fonte di scaffold ECM (ad esempio, sano contro malato)27. I fibroblasti sono stati anche osservati invadere l’interstizio – la posizione in cui risiedono nel tessuto polmonare nativo 1,27. Il metodo alternativo primario che possiamo immaginare per coltivare cellule su fette polmonari in un modo veramente specifico per regione comporterebbe la semina di polmoni decellularizzati intatti attraverso le vie aeree31,48 e i compartimenti vascolari49,50, e quindi affettare il tessuto recellularizzato. Tuttavia, questa alternativa 1) è significativamente più costosa, dispendiosa in termini di costi, tempo e risorse; 2) è un throughput inferiore; 3) richiede un aumento del numero di animali; e 4) è associato ad un aumentato rischio di contaminazione a causa delle sfide dell’intera coltura polmonare e della successiva affettatura del polmone seminato. Pur non ricapitolando tutti gli aspetti dell’organizzazione cellulare nativa, la piattaforma ELT consente la coltura di cellule polmonari su un substrato ECM fisiologicamente rilevante, in un modo accessibile a molti più laboratori.
La flessibilità del sistema ELT è un grande vantaggio di questa piattaforma e dovrebbe consentire la coltura di tessuti polmonari su piccola scala con qualsiasi numero di scaffold, cellule o terreni di coltura di interesse. L’uso di scaffold derivati da tessuto malato o da modelli di lesioni può consentire lo studio delle interazioni cellula-cellula o cellula-matrice nel contesto di ECM 27,29,51 alterato dalla malattia. Tuttavia, si noti che potrebbe essere necessario adattare il protocollo di decellularizzazione per tenere conto delle differenze di matrice tra le specie52. La strategia di semina descritta può essere utilizzata per qualsiasi tipo di cellula e la tempistica di coltura adattata per soddisfare le esigenze del ricercatore. Come punto di partenza, 1 x 106 cellule per impalcatura dovrebbe produrre un tessuto altamente cellulare entro 7 giorni dalla coltura, mentre 1 x 105 cellule totali provocano una scarsa cellularità. In qualsiasi adattamento della linea temporale, le cassette di coltura tissutale devono essere rimosse dal bagno di semina 24 ore dopo l’ultima semina del tessuto. Qui, con l’obiettivo di modellare parte della complessità cellulare dell’alveolo polmonare, descriviamo una strategia di ricellularizzazione in tri-coltura che supporta il mantenimento di AEC2 neonatali ben differenziati in strutture alveolari per almeno 7 giorni. I nostri risultati dimostrano anche il successo dell’attecchimento sia dei fibroblasti che delle cellule endoteliali all’interno degli ELT, sottolineando l’ampia applicabilità del substrato di coltura e la sua idoneità per gli studi di co-coltura. La semina di cellule adulte in PFU può facilitare la modellazione di strutture alveolari più quiescenti, mentre la semina di AEC2 umani derivati da PSC, compresi quelli con modificazioni genetiche, potrebbe facilitare studi traslazionali di malattie umane13,53. In generale, l’approccio bottom-up abilitato dalla piattaforma ELT presenta l’opportunità di indagare i contributi di particolari tipi di cellule alle letture di interesse – come la proliferazione AEC2 o lo stato di differenziazione.
In sintesi, questo protocollo delinea un robusto sistema per la generazione di tessuti polmonari ingegnerizzati per studi di co-coltura di AEC2, fibroblasti e cellule endoteliali all’interno di scaffold acellulari di fette polmonari ECM. Gli ELT rappresentano una nuova strategia di coltura 3D per gli AEC2 primari, che fino ad oggi si sono tipicamente basati su matrici di tipo gel meno fisiologiche per mantenere un fenotipo 6,11,12 ben differenziato. L’attuale piattaforma si basa su precedenti lavori nel ripopolamento di fette polmonari decellularizzate 24,25,26,27,28,29, ma offre diversi vantaggi: 1) un sistema di cassette per colture tissutali per facilitare la gestione dei PFU durante la decellularizzazione, la semina e la coltura; 2) un bagno di semina personalizzato per seminare con precisione un numero noto di cellule su ogni impalcatura della fetta; e 3) una strategia di risemina tricoltura che consente il ripopolamento del tessuto alveolare con cellule epiteliali, mesenchimali ed endoteliali. Pertanto, gli ELT rappresentano un importante passo avanti verso la creazione di modelli riproducibili in vitro che catturano la complessità cellulare e del substrato dell’alveolo nativo e della nicchia delle cellule staminali AEC2.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Lorenzo Sewanan e Jorge Nunez per il loro lavoro di sviluppo del design della cassetta di coltura tissutale utilizzato in questo protocollo, il laboratorio Kaminski per l’uso del loro vibratoma, Maurizio Chioccioli e Jessica Nouws per l’assistenza con l’affettamento polmonare, Allie LaRocco per l’assistenza con gli esperimenti pilota iniziali e Hong Qian per l’attenta lettura del protocollo. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH F30HL143880 (K.L.L.), dal Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) e U01HL145567 (L.E.N.); e da un dono di ricerca senza restrizioni da Humacyte Inc. (L.E.N.).
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |