Este protocolo descreve um método para gerar tecidos pulmonares projetíveis, de pequena escala, repovoando fatias pulmonares descelularizadas cortadas com células epiteliais tipo 2 alveolares, fibroblastos e células endoteliais.
Há necessidade de modelos pulmonares tridimensionais (3D) melhorados que recapitulem a complexidade arquitetônica e celular do alvéolo-de-pulmão nativo ex vivo. Modelos organoides recentemente desenvolvidos facilitaram a expansão e o estudo de progenitores epiteliais pulmonares in vitro, mas essas plataformas normalmente dependem de matriz e/ou soro derivados de tumores do rato, e incorporam apenas uma ou duas linhagens celulares. Aqui, descrevemos um protocolo para geração de tecidos pulmonares projetados (ELTs) baseado na recelularização multi-linhagem de fatias pulmonares descelularizadas cortadas com precisão (PCLS). Os ELTs contêm estruturas alveolares que compreendem epitélio alveolar, mesenquime e endotélio, dentro de um substrato de matriz extracelular (ECM) que se assemelha intimamente ao do pulmão nativo. Para gerar os tecidos, os pulmões de ratos são inflados com agarose, fatiados em fatias de 450 μm de espessura, cortados em tiras e descelularizados. Os andaimes Acellular ECM resultantes são então ressegados com células endoteliais primárias, fibroblastos e células epiteliais alveolares tipo 2 (AEC2s). Os AEC2s podem ser mantidos na cultura ELT por pelo menos 7 dias com um meio de crescimento quimicamente definido e livre de soro. Durante todo o processo de preparação e cultura do tecido, as fatias são cortadas em um sistema de fita que facilita o manuseio e a semeadura celular padronizada de múltiplos ELTs em paralelo. Esses ELTs representam uma plataforma de cultura organotípica que deve facilitar investigações de interações célula-célula e matriz celular dentro do alveolus, bem como sinais bioquímicos que regulam os AEC2s e seu nicho.
Alvéolos são as unidades funcionais do pulmão distal, compreendendo uma malha de espaços aéreos de troca de gás forrados por células epiteliais alveolares tipo 1 (AEC1s) e células tipo 2 (AEC2s). Por trás do epitélio está uma densa rede de capilares, bem como apoiando mesenchyme, tudo apoiado por um andaime de matriz extracelular (ECM) que fornece força e flexibilidade a esses delicados sacos de ar1. Os alvéolos também são o local de lesão em inúmeras patologias pulmonares, incluindo fibrose pulmonaridiopática 2, síndrome de angústia respiratória aguda3 e doença coronavírus grave-19 (COVID-19)4. Embora o trabalho na última década tenha descoberto uma notável plasticidade dentro do epitélio pulmonar, os mecanismos que permitem a reparação pulmonar distal em alguns cenários – e que impedem a reparação em outros – permanecem uma área de intensa investigação5. O desenvolvimento de plataformas in vitro aprimoradas para modelar o alveolus facilitaria estudos de biologia alveolar, regeneração e terapêutica.
AEC2s auto-renovam e diferenciam-se em AEC1s, sendo, portanto, considerada a célula-tronco primária do pulmão distal 6,7,8. No entanto, essas células representam um desafio particular ao estudo in vitro, dadas as dificuldades associadas à cultura de AEC2s primários sem a perda do fenótipo9. Na cultura 2D convencional bidimensional(2D), os AEC2s achatam e adotam algumas características das células semelhantes a AEC110. Em contraste, as estratégias de cultura 3D, mais comumente organoides, apoiam a manutenção de características diferenciadas em AEC2sprimários 6,11,12 e permitem cultura de longo prazo de células-tronco pluripotentes (PSC) derivadas AEC2s 13,14. Os organoides têm sido usados para modelar o desenvolvimento pulmonar distal15, infecção viral11,15 e doença genética relacionada ao AEC2 13,16,17, permitindo insights importantes sobre a biologia e regeneração AEC2. No entanto, esses modelos de cultura normalmente compreendem apenas uma ou duas linhagens celulares, e incorporam as células em matrizes do tipo gel que não conseguem recapitular a arquitetura ou o substrato ECM do alvéolo pulmonar nativo.
O ECM é um regulador crítico do fenótipo celular e comportamento através de pistas moleculares, topológicas e mecânicas; compreende um componente-chave de nichos específicos do tecido que regulam o destino das células-tronco; e serve como um reservatório que modula a disponibilidade de fatores de crescimento secretos localmente 18,19,20,21. As células de cultivo no ECM nativo podem, assim, aumentar a capacidade preditiva de sistemas in vitro para modelar a biologia dos tecidos in vivo. A descelularização, processo que remove material celular de tecidos através de detergentes, enzimas ou métodos físicos ou outros, pode preservar em grande parte o andaime ECM de um órgão nativo, quando cuidadosamente realizado22,23. Esses andaimes podem ser repovoados com células para cultura biomimética 3D. No entanto, embora os andaimes descelularizados sejam amplamente utilizados para aplicações de engenharia de tecidos, seu uso para a cultura celular rotineira tem sido limitado. Vários estudos anteriores relataram a descelularização e recelularização de fatias pulmonares ou pequenos segmentos de tecido pulmonar. Além de estudos de prova de conceito 24,25,26, fatias pulmonares repovoadas têm sido utilizadas para estudar a adesão da matriz fibroblasto27,28 e investigar o efeito de matriz pulmonar doente no fenótipo27,29 do fibroblasto. Com tecnologias aprimoradas disponíveis para a geração de fatias de tecido cortadas com precisão, as fatias pulmonares descelularizadas poderiam oferecer uma plataforma conveniente e de pequena escala com a qual as células de cultura, preservando as subestruturas alveolares, as vias aéreas e vasculares. A incorporação de vários tipos de células permitiria estudos de interações célula-células dentro de um ambiente 3D fisiologicamente relevante. No entanto, estratégias aprimoradas são necessárias para facilitar o manuseio de tecidos durante todo o processo cultural, e para garantir a semeadura controlada e reprodutível de tecidos com número conhecido de células.
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar tecidos pulmonares projetados (ELTs) repovoando fatias pulmonares descelularizadas cortadas com precisão (PCLS) com células endoteliais primárias, AEC2s e fibroblastos. Em uma adaptação do nosso sistema de tecido cardíaco projetado anteriormente30 e estratégias inteiras de descelularizaçãopulmonar-recelularização pulmonar 22,31, descrevemos procedimentos para cortar o PCLS de pulmões de ratos e cortar as fatias em fitas de cultura de tecido reutilizável que simplificam e padronizam manipulações a jusante. As fatias cortadas são descelularizadas para formar andaimes ECM acelulares, que são repovoados em banhos personalizados de semeadura. Os andaimes de fatia pulmonar preservam componentes e arquitetura eCM críticos e suportam o crescimento de AEC2s dentro de estruturas alveolares de várias linhagens por pelo menos 7 dias. Os ELTs representam um novo sistema de cocultura alveolar dentro de uma matriz 3D fisiologicamente relevante, que deve apoiar o desenvolvimento de estratégias de engenharia de tecidos pulmonares, ao mesmo tempo em que facilita estudos biológicos básicos de AEC2s e alvéolos.
Este artigo descreve o uso de fatias pulmonares descelularizadas cortadas com precisão como uma plataforma para gerar tecidos pulmonares projetados in vitro, que contêm estruturas alveolares de várias linhagens. Ao combinar estratégias que desenvolvemos anteriormente para repovoar andaimes pulmonares Acellulares ECM de alta fidelidade para toda a engenharia pulmonar22,31, com nosso sistema robusto para cultivar tecidos cardíacos projetados em pequena escala30, este protocolo permite o uso de ECM pulmonar fisiologicamente relevante como um substrato de cultura tecidual, de forma repetível e moderadamente de rendimento.
Os métodos aqui apresentados detalham a preparação do andaime ELT de pulmões de ratos, que são facilmente alcançáveis, podem ser extraídos em bloco com acesso direto às vias aéreas intactas para a inflação de ágarose, e são de tamanho maior do que o pulmão do rato. No entanto, qualquer tecido pulmonar que possa ser inflado com agarose e produzir fatias de pelo menos 9 mm de comprimento pode ser usado dentro deste sistema. Independentemente da fonte de tecido, a inflação uniforme do tecido pulmonar com agarose é o passo mais crítico para garantir o sucesso do corte de tecido a jusante, recorte e manuseio de tecidos. O tecido pulmonar subinflado tende a não cortar limpo, enquanto o tecido superinflado pode rasgar durante o recorte. Após a gelação de agarose, regiões de tecido apropriadamente infladas são firmes, mas fornecem um pouco de dar quando suavemente pressionadas com fórceps. Para pulmões de ratos intactos, descobrimos que pré-inflar os pulmões extraídos com ar várias vezes, seguido pela inflação de agarose o mais rápido possível após a extração, resulta nos melhores resultados de corte e melhor qualidade dos andaimes de tecido resultantes. O volume adequado de agarose precisa ser otimizado empiricamente; para um pulmão de rato o volume necessário para inflar o pulmão para a capacidade pulmonar total é de aproximadamente 30 mL/kg de massa animal (por exemplo, 10,5 mL agarose para pulmões de um rato de 350 g). Para tecidos pulmonares ressecados maiores com acesso menos simples das vias aéreas (como os de doadores humanos), alguns problemas adicionais podem ser necessários para inflar o tecido através de um brônquio32. Durante o corte pulmonar subsequente, a seleção e orientação do tecido no êmbolo é outro passo importante para 1) garantir que as fatias sejam grandes o suficiente para gerar tiras de tecido que podem ser cortadas em de cultura tecidual e 2) maximizar a área de tecido parenchímal (alveolar), excluindo grandes vias aéreas ou vasos.
Cortar o PCLS em fitas de cultura tecidual pode ser um passo desafiador inicialmente, mas as fitas simplificam muito o manuseio de tecidos durante a descelularização e semeadura. Dois problemas potenciais que podem surgir são a ruptura tecidual (seja durante o processo de corte, ou durante a descelularização), ou o posicionamento tecidual nos clipes que resulta em má semeadura a jusante (por exemplo, sem semeadura ou semeadura apenas nas extremidades). Rasgar pode ser o resultado da superinflação agarose, alongamento excessivo do tecido durante a inserção da guia, ou deixar muito pouca saliência para fornecer aderência adequada do tecido ao inserir as abas. Note que fatias que rasgam em uma extremidade de clipe podem ser semeadas com sucesso, no entanto, elas são difíceis de visualizar sob o microscópio durante a cultura, pois o tecido não é plano. A semeadura de tecido ruim (como a da Figura 6C) é provavelmente o resultado da fatia não deitada plana entre os dois clipes, e assim fazendo contato ruim com a base do banho de semeadura bem quando virado de cabeça para baixo. Outra possível causa é o assento inadequado do no fundo do banho de semeadura. Em termos de recorte, aplique um pouco mais de tensão no tecido ao colocar o segundo clipe para ajudá-lo a ficar liso. Algumas fatias têm uma leve concavidade; nestes casos, corte a fatia com o lado convexo para cima. Com a prática, normalmente experimentamos semeaduras com menos de 2% de fatias.
Uma limitação deste protocolo é a exigência de que alguns equipamentos especializados – um cortador a laser e uma impressora 3D – gerem os materiais iniciais para a preparação do ELT. No entanto, uma vez que as fitas de cultura tecidual e banhos de semeadura são criados, nenhum material especial adicional é necessário. As etapas de corte e descelularização pulmonar da preparação do andaime ELT são moderadamente demoradas; no entanto, essas etapas podem ser realizadas com antecedência, ou em números suficientes para se preparar para múltiplos experimentos ao mesmo tempo. Muitos PCLS (>100 se otimizando para regiões parenchymal) podem ser cortados de um único pulmão e congelados por snap para uso posterior. Embora um único ciclo de congelamento possa causar pequenos danos ultraestruturais ao ECM46, mesmo vários ciclos de congelamento foram demonstrados para não causar uma perda significativa no ECM 23,47. O PCLS também pode ser cortado e descelularizado antes de um experimento, a ser usado dentro de um mês. (Notavelmente, o protocolo de descelularização descrito pode ser realizado em aproximadamente 6 horas, o que representa uma vantagem significativa em relação aos métodos descritos anteriormente que requerem um dia ou maisde 27,28.) Uma vez que os andaimes são preparados, o processo de semeadura celular é simples e rápido, e a cultura dos ELTs não requer técnicas especializadas.
Uma ressalva do método ELT descrito é a falta de semeadura específica da região, ou seja, a entrega de AEC2s especificamente ao espaço alveolar, ou células endoteliais especificamente ao espaço vascular. No entanto, embora as células sejam simplesmente semeadas em cima dos andaimes de tecido, o padrão de recelularização não é aleatório, com alguma aparência de organização alveolar, incluindo anéis epiteliais. Suspeitamos que as interações célula-célula, bem como diferenças locais na composição e geometria do ECM20,21, provavelmente contribuem para os padrões de recelularização observados. Em apoio a essa hipótese, um estudo publicado anteriormente, no qual os fibroblastos foram semeados não especificamente em fatias pulmonares descelularizadas, demonstrou que o padrão de repopulação tecidual e fenótipos celulares associados variaram significativamente por região de tecido microscópico e fonte de andaime ECM (por exemplo, saudável versus doente)27. Também foram observados fibroblastos para invadir o interstício – local onde residem no tecido pulmonar nativo 1,27. O método alternativo primário que podemos imaginar para cultivar células em fatias pulmonares de uma maneira verdadeiramente específica da região implicaria semear pulmões intactos descelularizados através das vias aéreas31,48 e compartimentos vasculares 49,50, e, em seguida, cortar o tecido recelularizado. No entanto, essa alternativa 1) é significativamente mais econômica, de tempo e de recursos; 2) é menor rendimento; 3) requer aumento do número de animais; e 4) está associada a um risco aumentado de contaminação devido aos desafios de toda a cultura pulmonar e posterior fatiamento do pulmão semeado. Embora não recapitulando todos os aspectos da organização celular nativa, a plataforma ELT permite a cultura das células pulmonares em um substrato ECM fisiologicamente relevante, de uma maneira acessível a muitos outros laboratórios.
A flexibilidade do sistema ELT é uma grande vantagem desta plataforma, e deve permitir a cultura de tecido pulmonar em pequena escala com qualquer número de andaimes de tecido, células ou meios de cultura de interesse. O uso de andaimes derivados de tecido doente ou de modelos de lesões pode permitir o estudo de interações célula-célula ou matriz celular no cenário de ECM alterado pela doença 27,29,51. No entanto, note que o protocolo de descelularização pode precisar ser adaptado para explicar as diferenças matricial entre as espécies52. A estratégia de semeadura descrita pode ser usada para qualquer tipo de célula, e a linha do tempo da cultura adaptada para atender às necessidades do pesquisador. Como ponto de partida, 1 x 106 células por andaime devem produzir um tecido altamente celular dentro de 7 dias de cultura, enquanto 1 x 105 células totais resultam em má celularidade. Em qualquer adaptação da linha do tempo, as fitas de cultura tecidual devem ser removidas do banho de semeadura 24 h após a última semeadura tecidual. Aqui, com o objetivo de modelar um pouco da complexidade celular do alvéolo pulmonar, descrevemos uma estratégia de recelularização tricultura que apoia a manutenção de AEC2s neonatais bem diferenciados em estruturas alveolares por pelo menos 7 dias. Nossos resultados também demonstram o enxerto bem-sucedido tanto de fibroblastos quanto de células endoteliais dentro dos ELTs, enfatizando a ampla aplicabilidade do substrato cultural e sua adequação para estudos de cocultura. A semeadura de células adultas em ELTs pode facilitar a modelagem de estruturas alveolares mais quiescentes, enquanto a semeadura de AEC2s derivadas de PSC humanos, incluindo aquelas com modificações genéticas, poderia facilitar estudos translacionais da doença humana13,53. Em geral, a abordagem de baixo para cima habilitada pela plataforma ELT apresenta a oportunidade de investigar as contribuições de determinados tipos de células para leituras de interesse – como o estado de proliferação ou diferenciação do AEC2.
Em resumo, este protocolo descreve um sistema robusto para a geração de tecidos pulmonares projetados para estudos de co-cultura de AEC2s, fibroblastos e células endoteliais dentro de andaimes de fatia pulmonar Acellular ECM. Os ELTs representam uma nova estratégia de cultura 3D para AEC2s primários, que até hoje dependem de matrizes menos fisiológicas do tipo gel para manter um fenótipo bem diferenciado 6,11,12. A plataforma atual baseia-se em trabalhos anteriores na repopulação de fatias pulmonares descelularizadas 24,25,26,27,28,29, mas oferece várias vantagens: 1) um sistema de de cultura tecidual para facilitar o manuseio de ELT durante a descelularização, semeadura e cultura; 2) um banho de semeadura personalizado para semear precisamente um número conhecido de células em cada andaime de fatia; e 3) uma estratégia de ressedação de três culturas que permite a repopulação do tecido alveolar com células epiteliais, mesenquimais e endoteliais. Assim, os ELTs representam um importante passo em frente para a criação de modelos in vitro reprodutíveis que capturam a complexidade celular e substrato do alvéolo nativo e do nicho de células-tronco AEC2.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Lorenzo Sewanan e Jorge Nunez por seu trabalho desenvolvendo o projeto de fita de cultura tecidual usado neste protocolo, o laboratório Kaminski para o uso de seu vibratome, Maurizio Chioccioli e Jessica Nouws por assistência com o corte pulmonar, Allie LaRocco para assistência com experimentos piloto iniciais, e Hong Qian para leitura cuidadosa do protocolo. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH F30HL143880 (K.L.L.), o Programa de Treinamento de Cientistas Médicos Grant T32GM136651 (K.L.L.) e U01HL145567 (L.E.N.); e por um presente de pesquisa irrestrito da Humacyte Inc. (L.E.N.).
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |