Ce protocole décrit une méthode pour générer des tissus pulmonaires modifiés reproductibles à petite échelle, en repeuplant des tranches pulmonaires décellularisées coupées avec précision avec des cellules épithéliales alvéolaires de type 2, des fibroblastes et des cellules endothéliales.
Il est nécessaire d’améliorer les modèles pulmonaires en 3 dimensions (3D) qui récapitulent la complexité architecturale et cellulaire de l’alvéole pulmonaire native ex vivo. Des modèles organoïdes récemment développés ont facilité l’expansion et l’étude des progéniteurs épithéliaux pulmonaires in vitro, mais ces plates-formes reposent généralement sur une matrice et/ou un sérum dérivés de tumeurs de souris et n’incorporent qu’une ou deux lignées cellulaires. Nous décrivons ici un protocole de génération de tissus pulmonaires modifiés (ELT) basé sur la recellularisation multi-lignée de tranches pulmonaires décellularisées coupées avec précision (PCLS). Les ELT contiennent des structures de type alvéolaire comprenant l’épithélium alvéolaire, le mésenchyme et l’endothélium, dans un substrat de matrice extracellulaire (ECM) ressemblant étroitement à celui du poumon natif. Pour générer les tissus, les poumons de rat sont gonflés avec de l’agarose, tranchés en tranches de 450 μm d’épaisseur, coupés en bandes et décellularisés. Les échafaudages ECM acellulaires résultants sont ensuite réensemencés avec des cellules endothéliales primaires, des fibroblastes et des cellules épithéliales alvéolaires de type 2 (AEC2). Les AEC2 peuvent être maintenus en culture ELT pendant au moins 7 jours avec un milieu de croissance sans sérum et chimiquement défini. Tout au long du processus de préparation et de culture des tissus, les tranches sont clipsées dans un système de cassette qui facilite la manipulation et l’ensemencement cellulaire normalisé de plusieurs ELT en parallèle. Ces ELT représentent une plateforme de culture organotypique qui devrait faciliter l’étude des interactions cellule-cellule et cellule-matrice au sein de l’alvéole ainsi que des signaux biochimiques régulant les AEC2 et leur niche.
Les alvéoles sont les unités fonctionnelles du poumon distal, comprenant un maillage d’espaces aériens échangeant des gaz bordés de cellules épithéliales alvéolaires de type 1 (AEC1) et de cellules de type 2 (AEC2). Derrière l’épithélium se trouve un réseau dense de capillaires ainsi que du mésenchyme de soutien, le tout soutenu par un échafaudage à matrice extracellulaire (ECM) qui fournit à la fois force et flexibilité à ces sacs aériens délicats1. Les alvéoles sont également le site de blessures dans de nombreuses pathologies pulmonaires, y compris la fibrose pulmonaire idiopathique2, le syndrome de détresse respiratoire aiguë3 et la maladie à coronavirus sévère-19 (COVID-19)4. Bien que les travaux de la dernière décennie aient révélé une plasticité remarquable dans l’épithélium pulmonaire, les mécanismes qui permettent la réparation pulmonaire distale dans certains contextes – et qui empêchent la réparation dans d’autres – restent un domaine d’investigation intense5. Le développement de plateformes in vitro améliorées pour modéliser l’alvéole faciliterait les études de biologie alvéolaire, de régénération et de thérapeutique.
Les AEC2 s’auto-renouvellent et se différencient en AEC1, et sont donc considérés comme la cellule souche primaire du poumon distal 6,7,8. Cependant, ces cellules posent un défi particulier à l’étude in vitro étant donné les difficultés associées à la culture d’AEC2 primaires sans perte de phénotype9. Dans la culture conventionnelle en 2 dimensions (2D), les AEC2 s’aplatissent et adoptent certaines caractéristiques des cellules de type AEC110. En revanche, les stratégies de culture 3D, le plus souvent des organoïdes, soutiennent le maintien de caractéristiques différenciées dans les AEC2 primaires 6,11,12 et permettent la culture à long terme d’AEC2s dérivés de cellules souches pluripotentes (PSC)13,14. Les organoïdes ont été utilisés pour modéliser le développement pulmonaire distal15, l’infection virale11,15 et la maladie génétique liée à l’AEC2 13,16,17, permettant ainsi d’obtenir des informations importantes sur la biologie et la régénération de l’AEC2. Cependant, ces modèles de culture ne comprennent généralement qu’une ou deux lignées cellulaires et intègrent les cellules dans des matrices de type gel qui ne parviennent pas à récapituler l’architecture ou le substrat ECM de l’alvéole pulmonaire native.
L’ECM est un régulateur critique du phénotype et du comportement cellulaires via des indices moléculaires, topologiques et mécaniques; comprend un élément clé des niches spécifiques aux tissus régulant le devenir des cellules souches; et sert de réservoir qui module la disponibilité des facteurs de croissance sécrétés localement 18,19,20,21. La culture de cellules sur ECM natif peut ainsi augmenter la capacité prédictive des systèmes in vitro à modéliser la biologie des tissus in vivo. La décellularisation, un processus qui élimine le matériel cellulaire des tissus via des détergents, des enzymes ou des méthodes physiques ou autres, peut préserver en grande partie l’échafaudage ECM d’un organe natif, lorsqu’elle est soigneusement effectuée22,23. De tels échafaudages peuvent être repeuplés avec des cellules pour la culture biomimétique 3D. Cependant, bien que les échafaudages décellularisés soient largement utilisés pour les applications d’ingénierie tissulaire, leur utilisation pour la culture cellulaire de routine a été limitée. Plusieurs études antérieures ont rapporté la décellularisation et la recellularisation de tranches pulmonaires ou de petits segments de tissu pulmonaire. En plus des études de preuve de concept 24,25,26, des tranches pulmonaires repeuplées ont été utilisées pour étudier l’adhésion de la matrice des fibroblastes 27,28 et pour étudier l’effet des matrices pulmonaires malades sur le phénotype de fibroblastes27,29. Grâce aux technologies améliorées disponibles pour générer des tranches de tissu découpées avec précision, les tranches pulmonaires décellularisées pourraient offrir une plate-forme pratique et à petite échelle avec laquelle cultiver des cellules, tout en préservant les sous-structures alvéolaires, des voies respiratoires et vasculaires. L’intégration de plusieurs types de cellules permettrait d’étudier les interactions cellule-cellule dans un environnement 3D physiologiquement pertinent. Cependant, des stratégies améliorées sont nécessaires pour faciliter la manipulation des tissus tout au long du processus de culture et pour assurer un ensemencement contrôlé et reproductible des tissus avec un nombre connu de cellules.
Ici, nous présentons un protocole pour générer des tissus pulmonaires modifiés (ELT) en repeuplant des tranches pulmonaires décellularisées coupées avec précision (PCLS) avec des cellules endothéliales primaires, des AEC2 et des fibroblastes. Dans une adaptation de notre système de tissu cardiaque30 et de nos stratégies de décellularisation-recellularisation des poumons entiers22,31, nous décrivons les procédures permettant de couper le PCLS des poumons de rats et de clipser les tranches dans des cassettes de culture tissulaire réutilisables qui simplifient et normalisent les manipulations en aval. Les tranches coupées sont décellularisées pour former des échafaudages ECM acellulaires, qui sont repeuplés dans des bains de semis personnalisés. Les échafaudages en tranches pulmonaires préservent les composants et l’architecture critiques de l’ECM et soutiennent la croissance des AEC2 dans des structures alvéolaires multi-lignées pendant au moins 7 jours. Les ELT représentent un nouveau système de co-culture alvéolaire au sein d’une matrice 3D physiologiquement pertinente, qui devrait soutenir le développement de stratégies d’ingénierie tissulaire pulmonaire, tout en facilitant les études biologiques de base des AEC2 et de l’alvéole.
Cet article décrit l’utilisation de tranches pulmonaires décellularisées coupées avec précision comme plate-forme pour générer des tissus pulmonaires modifiés in vitro, qui contiennent des structures alvéolaires multi-lignées. En combinant les stratégies que nous avons précédemment développées pour repeupler des échafaudages pulmonaires ECM acellulaires haute fidélité pour l’ingénierie pulmonaire entière22,31, avec notre système robuste pour la culture de tissus cardiaques modifiés à petite échelle30, ce protocole permet l’utilisation d’ECM pulmonaire physiologiquement pertinent comme substrat de culture tissulaire, de manière reproductible et à débit modéré.
Les méthodes présentées ici détaillent la préparation de l’échafaudage ELT à partir de poumons de rat, qui sont facilement accessibles, peuvent être extraites en bloc avec un accès direct aux voies respiratoires intactes pour l’inflation de l’agarose, et sont de plus grande taille que le poumon de souris. Cependant, tout tissu pulmonaire qui peut être gonflé avec de l’agarose et donner des tranches d’au moins 9 mm de longueur peut être utilisé dans ce système. Quelle que soit la source de tissu, le gonflage uniforme du tissu pulmonaire avec l’agarose est l’étape la plus critique pour assurer le succès du tranchage, de l’écrêtage et de la manipulation des tissus en aval. Le tissu pulmonaire sous-gonflé a tendance à ne pas trancher proprement, tandis que le tissu surgonflé peut se déchirer lors de la coupe. Après la gélification de l’agarose, les régions tissulaires gonflées de manière appropriée sont fermes, mais donnent un peu de répit lorsqu’elles sont pressées doucement avec une pince. Pour les poumons de rats intacts, nous avons constaté que le prégonflage des poumons extraits avec de l’air plusieurs fois, suivi d’une inflation de l’agarose dès que possible après l’extraction, donne les meilleurs résultats de tranchage et la meilleure qualité des échafaudages tissulaires résultants. Le volume approprié d’agarose doit être optimisé empiriquement; pour un poumon de rat, le volume nécessaire pour gonfler le poumon à la capacité pulmonaire totale est d’environ 30 mL/kg de masse animale (p. ex., 10,5 ml d’agarose pour les poumons d’un rat de 350 g). Pour les tissus pulmonaires réséqués plus gros avec un accès moins simple aux voies respiratoires (comme ceux de donneurs humains), un dépannage supplémentaire peut être nécessaire pour gonfler le tissu via une bronche32. Lors du tranchage ultérieur des poumons, la sélection et l’orientation du tissu sur le piston est une autre étape importante pour 1) s’assurer que les tranches sont suffisamment grandes pour générer des bandelettes de tissu qui peuvent être clipsées dans des cassettes de culture tissulaire et 2) maximiser la zone tissulaire parenchymateuse (alvéolaire), à l’exclusion des grandes voies respiratoires ou des vaisseaux.
Couper le PCLS dans des cassettes de culture tissulaire peut être une étape difficile au début, mais les cassettes simplifient considérablement la manipulation des tissus pendant la décellularisation et l’ensemencement. Deux problèmes potentiels qui peuvent survenir sont la déchirure des tissus (soit pendant le processus de coupe, soit pendant la décellularisation), ou le positionnement des tissus dans les clips qui entraîne un mauvais ensemencement en aval (par exemple, pas d’ensemencement ou ensemencement juste aux extrémités). La déchirure peut être le résultat d’une surinflation de l’agarose, d’un étirement excessif du tissu lors de l’insertion de la languette ou d’un surplomb trop faible pour fournir une adhérence adéquate des tissus lors de l’insertion des languettes. Notez que les tranches qui se déchirent à une extrémité du clip peuvent être ensemencées avec succès, cependant, elles sont difficiles à visualiser au microscope pendant la culture car le tissu n’est pas plat. Un mauvais ensemencement des tissus (comme celui de la figure 6C) est probablement le résultat du fait que la tranche ne se trouve pas à plat entre les deux clips et qu’elle entre donc mal en contact avec la base du bain d’ensemencement lorsqu’elle est retournée à l’envers. Une autre cause possible est une mauvaise assise de la cassette dans le fond du puits de bain d’ensemencement. En termes de coupe, appliquez un peu plus de tension dans le tissu lorsque vous placez le deuxième clip pour l’aider à rester à plat. Certaines tranches ont une légère concavité; dans ces cas, coupez la tranche avec le côté convexe vers le haut. Avec de la pratique, nous constatons généralement un ensemencement raté avec moins de 2% de tranches.
L’une des limites de ce protocole est l’exigence d’un équipement spécialisé – une découpeuse laser et une imprimante 3D – pour générer les matériaux initiaux pour la préparation elT. Cependant, une fois que les cassettes de culture tissulaire et les bains d’ensemencement sont créés, aucun matériau spécial supplémentaire n’est nécessaire. Les étapes de tranchage et de décellularisation des poumons de la préparation de l’échafaudage ELT prennent modérément du temps; cependant, ces étapes peuvent être effectuées à l’avance, ou en nombre suffisant pour préparer plusieurs expériences en même temps. De nombreux PCLS (>100 si l’optimisation pour les régions parenchymateuses) peuvent être coupés à partir d’un seul poumon et congelés pour une utilisation ultérieure. Bien qu’un seul cycle de gel-dégel puisse causer des dommages ultrastructuraux mineurs à l’ECM46, il a été démontré que même plusieurs cycles de gel-dégel ne causent pas de perte significative dans l’ECM 23,47. Le PCLS peut également être coupé et décellularisé avant une expérience, pour être utilisé dans un délai d’un mois. (Notamment, le protocole de décellularisation décrit peut être accompli en environ 6 heures, ce qui représente un avantage significatif par rapport aux méthodes décrites précédemment qui nécessitent un jour ou plus27,28.) Une fois les échafaudages préparés, le processus d’ensemencement cellulaire est simple et rapide, et la culture des ELT ne nécessite pas de techniques spécialisées.
Une mise en garde de la méthode ELT décrite est l’absence d’ensemencement spécifique à la région, c’est-à-dire l’administration d’AEC2 spécifiquement à l’espace alvéolaire ou de cellules endothéliales spécifiquement à l’espace vasculaire. Néanmoins, bien que les cellules soient simplement ensemencées au-dessus des échafaudages tissulaires, le modèle de recellularisation n’est pas aléatoire, avec un semblant d’organisation alvéolaire, y compris des anneaux épithéliaux. Nous soupçonnons que les interactions cellule-cellule, ainsi que les différences locales dans la composition et la géométrieecm 20,21, contribuent probablement aux modèles de recellularisation observés. À l’appui de cette hypothèse, une étude publiée précédemment, dans laquelle les fibroblastes ont été ensemencés non spécifiquement sur des tranches pulmonaires décellularisées, a démontré que le modèle de repeuplement tissulaire et les phénotypes cellulaires associés variaient considérablement selon la région tissulaire microscopique et la source d’échafaudage ECM (par exemple, sain ou malade)27. On a également observé que les fibroblastes envahissaient l’interstitium – l’endroit où ils résident dans le tissu pulmonaire natif 1,27. La principale méthode alternative que nous pouvons imaginer pour cultiver des cellules sur des tranches de poumon d’une manière vraiment spécifique à la région consisterait à ensemencer des poumons décellularisés intacts via les voies respiratoires31,48 et les compartiments vasculaires49,50, puis à trancher le tissu recellularisé. Cependant, cette solution de rechange 1) est beaucoup plus coûteuse, plus longue et plus coûteuse en ressources; 2) est un débit inférieur; 3) nécessite un nombre accru d’animaux; et 4) est associé à un risque accru de contamination en raison des défis liés à la culture pulmonaire entière et au tranchage ultérieur du poumon ensemencé. Bien qu’elle ne récapitule pas tous les aspects de l’organisation cellulaire native, la plate-forme ELT permet la culture de cellules pulmonaires sur un substrat ECM physiologiquement pertinent, d’une manière accessible à de nombreux autres laboratoires.
La flexibilité du système ELT est un avantage majeur de cette plate-forme et devrait permettre la culture de tissus pulmonaires à petite échelle avec un nombre illimité d’échafaudages tissulaires, de cellules ou de milieux de culture d’intérêt. L’utilisation d’échafaudages dérivés de tissus malades ou de modèles de blessures peut permettre d’étudier les interactions cellule-cellule ou cellule-matrice dans le cadre de l’ECM 27,29,51 altéré par la maladie. Cependant, notez que le protocole de décellularisation devra peut-être être adapté pour tenir compte des différences matricielles entre les espèces52. La stratégie d’ensemencement décrite peut être utilisée pour n’importe quel type de cellule et la chronologie de culture adaptée aux besoins du chercheur. Comme point de départ, 1 x 106 cellules par échafaudage devraient produire un tissu hautement cellulaire dans les 7 jours suivant la culture, tandis que 1 x 105 cellules totales entraînent une mauvaise cellularité. Dans toute adaptation de la chronologie, les cassettes de culture tissulaire doivent être retirées du bain d’ensemencement 24 heures après le dernier ensemencement tissulaire. Ici, dans le but de modéliser une partie de la complexité cellulaire de l’alvéole pulmonaire, nous décrivons une stratégie de recellularisation tri-culture qui soutient le maintien d’AEC2 néonatals bien différenciés dans des structures alvéolaires pendant au moins 7 jours. Nos résultats démontrent également la greffe réussie de fibroblastes et de cellules endothéliales dans les ELT, soulignant la large applicabilité du substrat de culture et sa pertinence pour les études de co-culture. L’ensemencement de cellules adultes dans des ELT peut faciliter la modélisation de structures alvéolaires plus reposantes, tandis que l’ensemencement d’AEC2 humains dérivés de PSC, y compris ceux présentant des modifications génétiques, pourrait faciliter les études translationnelles de la maladie humaine13,53. En général, l’approche ascendante permise par la plate-forme ELT offre la possibilité d’étudier les contributions de types de cellules particuliers à des lectures d’intérêt – telles que l’état de prolifération ou de différenciation AEC2.
En résumé, ce protocole décrit un système robuste pour générer des tissus pulmonaires modifiés pour des études de co-culture d’AEC2, de fibroblastes et de cellules endothéliales dans des échafaudages de tranches pulmonaires ECM acellulaires. Les ELT représentent une nouvelle stratégie de culture 3D pour les AEC2 primaires, qui jusqu’à présent se sont généralement appuyées sur des matrices de type gel moins physiologiques pour maintenir un phénotype 6,11,12 bien différencié. La plate-forme actuelle s’appuie sur des travaux antérieurs dans le repeuplement de tranches pulmonaires décellularisées 24,25,26,27,28,29, mais offre plusieurs avantages: 1) un système de cassette de culture tissulaire pour faciliter la manipulation de l’ELT pendant la décellularisation, l’ensemencement et la culture; 2) un bain d’ensemencement personnalisé pour ensemencer avec précision un nombre connu de cellules sur chaque échafaudage de tranches; et 3) une stratégie de réensemencement en trois cultures qui permet le repeuplement des tissus alvéolaires avec des cellules épithéliales, mésenchymateuses et endothéliales. Ainsi, les ELT représentent une étape importante vers la création de modèles in vitro reproductibles qui capturent la complexité cellulaire et du substrat de l’alvéole native et de la niche des cellules souches AEC2.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Lorenzo Sewanan et Jorge Nunez pour leur travail de développement de la conception de cassettes de culture tissulaire utilisée dans ce protocole, le laboratoire Kaminski pour l’utilisation de leur vibratome, Maurizio Chioccioli et Jessica Nouws pour l’aide au tranchage des poumons, Allie LaRocco pour l’aide aux expériences pilotes initiales et Hong Qian pour la lecture attentive du protocole. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH F30HL143880 (K.L.L.), la subvention de formation du programme de formation des scientifiques médicaux T32GM136651 (K.L.L.) et U01HL145567 (L.E.N.); et par un don de recherche sans restriction de Humacyte Inc. (L.E.N.).
3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
F12 | Gibco | 11765-054 | |
Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
PDMS – SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
Transferrin human | Sigma | T8158 | |
Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |