鸡重组肢体测定，以了解细胞分化的形态发生，图案化和早期步骤
Summary
重组肢体是一种强大的实验模型，可以研究细胞分化过程和胚胎信号影响下的模式生成。该协议提出了一种详细的方法，用于生成具有鸡肢 – 中胚层细胞的重组肢体，可适应从不同生物体获得的其他细胞类型。
Abstract
细胞分化是细胞承诺的微调过程，导致在发育中的组织和器官的建立过程中形成不同的特化细胞类型。这个过程在成年期得到积极维持。细胞分化是器官发育和体内平衡过程中的一个持续过程。了解细胞分化的早期步骤对于了解其他复杂的过程（如形态发生）至关重要。因此，重组鸡肢是一种实验模型，允许在胚胎模式化信号下研究细胞分化和模式生成。该实验模型模仿 体内 环境;它将重新聚集的细胞组装成从早期肢体芽获得的外胚层覆盖物。之后，外胚层被移植并植入雏鸡胚胎受体中以允许其发育。该测定主要用于评估中胚层肢体芽细胞;然而，它可以应用于来自其他生物体的其他干细胞或祖细胞。
Introduction
脊椎动物肢体是研究细胞分化，细胞增殖，细胞死亡，模式形成和形态发生1，2的强大模型。在发育过程中，四肢从来自侧板中胚层1的细胞中以凸起的形式出现。肢体芽由被外胚层覆盖的中胚层细胞的中央核心组成。从这个早期结构中，出现了一个完整的、形状良好的肢体。肢体萌芽后，识别三个轴：（1）近轴远端轴（[PD]肩部到手指），（2）背腹轴（[DV]从手背到手掌），以及（3）前后轴（[AP]拇指到手指）。近端-远端轴取决于顶端外胚层脊 （AER），即位于肢体芽远端的特殊外胚层。AER是生长，存活维持，增殖和接收信号的细胞的未分化状态2，3所必需的。另一方面，极化活动区（ZPA）控制前后模式4，而背侧和外胚层控制背动脉模式7，8。三维图案化的集成意味着这三个轴之间的复杂串扰5.尽管了解肢体发育过程中的分子途径，但关于控制模式和适当生长以形成整个肢体的机制的悬而未决的问题仍未得到解答。
Edgar Zwilling于1964年开发了重组肢体（RL）系统，以研究肢体间充质细胞与发育中的肢体外胚层之间的相互作用6。RL系统将解离 – 重新聚集的肢体芽中胚层组装到胚胎肢体外胚层中，将其移植到供体雏鸡胚胎的背侧部分。外胚层提供的信号以时空方式诱导分化基因和图案化基因的表达，从而诱导肢体样结构的形成，该结构可以概括肢体发育过程中发生的细胞程序7，8，9。
RL模型对于理解肢体成分的性质以及中胚层和外胚层细胞之间的相互作用具有价值6。RL可以被定义为由实验组装或重组肢体芽芽中胚层细胞在外胚层盖6内产生的肢体样结构。RL的形态发生取决于对外胚层图案化信号作出反应的中胚层细胞（或其他类型的）的特征。该实验系统的优点之一是其多功能性。该特征允许通过改变中胚层细胞的来源来创建多种组合，例如来自不同发育阶段的细胞，来自沿肢体的不同位置的细胞，或整个（未解离的）或重新聚集的细胞7，8，9，10。另一个例子是从鸡以外的物种获得胚胎外胚层的能力，例如，11，鹌鹑或小鼠12。
从这个意义上说，RL技术有助于从进化的角度研究肢体发育以及肢体间充质细胞和外胚层细胞之间的相互作用。该技术还具有通过利用胚胎外胚层12，13，14提供的信号来分析祖细胞的不同来源分化成肢体样结构的能力的巨大潜力。与体外培养相反，RL允许通过解释来自发育中的肢体的胚胎信号来评估细胞群的分化和形态发生潜力9，15。
在该协议中，提供了使用重新聚集的中胚层肢体芽细胞成功进行RL的分步指南，从而开辟了将此方案与不同来源的重新聚集细胞甚至不同的外胚层来源相适应的可能性。
Protocol
Representative Results
Discussion
一般来说，RL方案可分为五个步骤：（1）胚胎孵育，（2）获得肢体中胚层细胞以填充外胚层，（3）获得外胚层，（4）组装外胚层覆盖物内的中胚层细胞，以及（5）将填充的外胚层移植到宿主胚胎中。RL技术的主要局限性是冗长，详细的协议，它具有许多需要耐心才能正确执行的关键点。要成功完成协议，需要确定关键时刻。在中胚层细胞采购过程中，细胞的完整性和活力至关重要。细胞死亡会?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Estefania Garay-Pacheco 在图 2 中提供的图像，并感谢 Maria Valeria Chimal-Montes de Oca 的艺术作品。这项工作得到了墨西哥国立自治大学（DGAPA）[拨款编号IN211117和IN213314]和授予JC-M的全国科学与技术大会（CONACyT）[授予1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]的支持。JC M-L是国家科学与技术委员会（CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887）的博士后奖学金获得者。
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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