形態形成、パターニング、および細胞分化の初期段階を理解するためのニワトリ組換え四肢アッセイ
Summary
組換え四肢は、細胞分化の過程と胚シグナルの影響下でのパターンの生成を研究することを可能にする強力な実験モデルである。このプロトコルは、異なる生物から得られた他の細胞型に適応可能なニワトリ四肢 – 中胚葉系細胞を有する組換え四肢を生成するための詳細な方法を提示する。
Abstract
細胞分化は、発達中の組織および器官の確立中に異なる特殊な細胞型の形成につながる細胞コミットメントの微調整されたプロセスである。このプロセスは成人期に積極的に維持されます。細胞分化は、器官の発生および恒常性維持の間の進行中のプロセスである。細胞分化の初期段階を理解することは、形態形成などの他の複雑なプロセスを知るために不可欠です。したがって、組換えニワトリ四肢は、胚パターニングシグナル下での細胞分化およびパターン生成の研究を可能にする実験モデルである。この実験モデルは 、in vivo 環境を模倣しています。それは初期の四肢の芽から得られた外胚葉性のカバーに再凝集した細胞を組み立てる。その後、外胚葉は、その発達を可能にするために、ひよこの胚受容体に移植および移植される。このアッセイは、主に中胚葉性四肢芽細胞を評価するために使用された。しかし、それは他の生物からの他の幹または前駆細胞に適用することができる。
Introduction
脊椎動物の四肢は、細胞分化、細胞増殖、細胞死、パターン形成、および形態形成を研究するための手ごわいモデルである1,2。発生中、四肢は側板中胚葉1に由来する細胞から膨らみとして出現する。四肢芽は、外胚葉で覆われた中胚葉系細胞の中心核からなる。この初期の構造から、丸ごと整った四肢が出現する。四肢の蕾が生じた後、(1)近位 – 遠位軸([PD]肩から指へ)、(2)背腹側軸([DV]手の甲から手のひらまで)、および(3)前後軸([AP]親指から指へ)の3つの軸が認識される。近位 – 遠位軸は、四肢芽の遠位先端に位置する特殊な外胚葉である頂端外胚葉隆起(AER)に依存する。AERは、伸長、生存維持、増殖、およびシグナル2,3を受け取る細胞の未分化状態に必要である。一方、偏光活性ゾーン(ZPA)は前後パターニング4を制御し、背側および外胚葉は背側腹部パターニング7、8を制御する。3次元パターニングの統合は、これら3つの軸5間の複雑なクロストークを意味する。四肢の発達中の分子経路を理解しているにもかかわらず、四肢全体を形成するためのパターニングと適切な伸長を制御するメカニズムに関する未解決の疑問は未解決のままである。
Edgar Zwilling は 1964 年に組換え四肢 (RL) システムを開発し、発達中の四肢における四肢間葉系細胞と外胚葉との相互作用を研究しました6.RLシステムは、解離・再凝集した四肢芽中胚葉を胚性四肢外胚葉に組み立て、ドナーの雛胚の背部に移植する。外胚葉によって提供されるシグナルは、時空間的に分化遺伝子およびパターニング遺伝子の発現を誘導し、したがって、四肢発生中に起こる細胞プログラムを反復することができる四肢様構造の形成を誘導する7,8,9。
RLモデルは、四肢成分の性質および中胚葉系細胞と外胚葉系細胞との間の相互作用を理解するのに有用である6。RLは、外胚葉カバー6の内部で四肢芽中胚葉細胞を実験的に組み立てまたは再結合することによって作成された四肢様構造として定義することができる。RLの形態形成は、外胚葉系パターニングシグナルに応答する中胚葉系細胞(または他のタイプ)の特性に依存する。この実験システムの利点の1つは、その汎用性である。この特性は、異なる発生段階からの細胞、四肢に沿った異なる位置からの細胞、または全体(解離していない)または再凝集した細胞7、8、9、10などの中胚葉系細胞の供給源を変えることによって、複数の組み合わせの作成を可能にする。別の例は、ニワトリ以外の種、例えばカメ11、ウズラ、またはマウス12から胚性外胚葉を得る能力である。
この意味で、RL技術は、四肢の発達と四肢間葉系細胞と外胚葉系細胞との間の相互作用を進化的観点から研究するのに役立ちます。この技術はまた、胚性外胚葉12、13、14によって提供されるシグナルを利用して四肢様構造に分化する前駆細胞の異なる供給源の能力を分析するための大きな可能性を秘めている。インビトロ培養とは対照的に、RLは、発達中の四肢からの胚性シグナルを解釈することによって、細胞集団の分化および形態形成能を評価することを可能にする9,15。
このプロトコルでは、再凝集した中胚葉性四肢芽細胞を用いてRLを成功させるためのステップバイステップガイドが提供され、したがって、このプロトコルを異なる再凝集細胞源または異なる外胚葉源と適合させる可能性を開く。
Protocol
Representative Results
Discussion
一般に、RLプロトコルは、(1)胚のインキュベーション、(2)外胚葉を埋める四肢中胚葉細胞の取得、(3)外胚葉の取得、(4)外胚葉カバーの内部に中胚葉細胞を組み立てる、および(5)充填された外胚葉の宿主胚への移植の5つのステップに分けることができる。RL 手法の主な制限は、長くて詳細なプロトコルであり、適切に実行するために忍耐を必要とする多くの重要なポイントがあります。プロト?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
図2の画像についてはエステファニア・ガライ=パチェコに、アートワークについてはマリア・ヴァレリア・キマル=モンテス・デ・オカに感謝します。この研究は、JC-Mに授与されたメキシコ国立自治大学(DGAPA)と、JC-Mに授与されたConsejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [助成金番号1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]によって支援されました。JC M-Lは、Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)からポスドクフェローシップを授与されました。
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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