치킨 재조합 사지 분석은 모르포겐, 패터닝 및 세포 분화의 초기 단계를 이해하기 위한
Summary
재조합 팔다리는 배아 신호의 영향으로 세포 분화 과정과 패턴 생성을 연구 할 수있는 강력한 실험 모델입니다. 이 프로토콜은 상이한 유기체로부터 수득된 다른 세포 유형에 적응할 수 있는 닭 사지-중배엽 세포로 재조합 사지를 생성하는 상세한 방법을 제시한다.
Abstract
세포 분화는 조직 및 장기 발달 동안 다양한 특수 세포 유형의 형성으로 이어지는 세포 투입의 미세 조정 과정입니다. 이 과정은 성인기에 적극적으로 유지됩니다. 세포 분화는 장기의 발달 및 항상성 동안 진행중인 과정입니다. 세포 분화의 초기 단계를 이해하는 것은 형태 형성과 같은 다른 복잡한 과정을 아는 데 필수적입니다. 따라서, 재조합 닭 팔다리는 배아 패터닝 신호 하에서 세포 분화 및 패턴 생성의 연구를 허용하는 실험 모델이다. 이 실험 모델은 생체내 환경을 모방하고; 그것은 초기 사지 새싹에서 얻은 외배엽 덮개로 재결합 된 세포를 조립합니다. 나중에, 외배엽은 병아리 배아 수용체에 옮겨지고 이식되어 발달을 허용합니다. 이 분석은 주로 중배엽 사지 새싹 세포를 평가하기 위해 사용되었다; 그러나, 다른 줄기 또는 다른 유기체로부터의 전구 세포에 적용될 수 있다.
Introduction
척추동물 사지는 세포 분화, 세포 증식, 세포 사멸, 패턴 형성 및 형태형성 1,2를 연구하기 위한 강력한 모델이다. 발달 동안, 팔다리는 측방 플레이트 중배엽1에서 유래 된 세포로부터 팽창으로 나타난다. 사지 새싹은 외배엽으로 덮인 중배엽 세포의 중심 코어로 구성됩니다. 이 초기 구조에서 전체적으로 잘 형성된 팔다리가 나타납니다. 사지 새싹이 발생한 후, (1) 근위 원위 축 ([PD] 어깨에서 손가락까지), (2) 등 – 복부 축 ([DV]손등에서 손바닥까지), (3) 전방 – 후부 ([AP] 엄지 손가락에서 손가락까지)의 세 축이 인식됩니다. 근위 – 원위 축은 사지 새싹의 원위 끝에 위치한 정점 외배엽 능선 (AER)에 달려 있습니다. AER은 신호2,3을 수신하는 세포의 성장, 생존 유지, 증식 및 미분화 상태에 요구된다. 한편, 편광 활동 영역(ZPA)은 전후 패터닝(4)을 제어하고, 등쪽 및 외배엽은 등쪽 패터닝(7,8)을 제어한다. 입체 패터닝의 통합은 이 세 축 사이의 복잡한 누화를 의미한다5. 사지 발달 중 분자 경로를 이해했음에도 불구하고, 전체 사지를 형성하기 위해 패턴화와 적절한 성장을 조절하는 메커니즘에 대한 열린 질문은 여전히 답이 없습니다.
Edgar Zwilling 는 1964 년에 재조합 사지 (RL) 시스템을 개발하여 사지 중간엽 세포와 외배엽 사이의 상호 작용을 연구했습니다6. RL 시스템은 해리된 재응집된 사지 새싹 중배엽을 배아 사지 외배엽으로 조립하여 공여체 병아리 배아의 등쪽 부분으로 이식한다. 외배엽에 의해 제공되는 신호는 시공간 방식으로 분화 유전자 및 패터닝 유전자의 발현을 유도하고, 따라서 사지 발달 동안 발생하는 세포 프로그램을 재편성할 수 있는 사지 유사 구조의 형성을 유도한다 7,8,9.
RL 모델은 사지 성분의 특성과 중배엽 및 외배엽 세포 사이의 상호작용을 이해하는데가치가 있다6. RL은 외배엽 커버(6) 내부의 사지 새싹 중배엽 세포를 실험적으로 조립 또는 재결합함으로써 생성된 사지 유사 구조로서 정의될 수 있다. RL의 형태형성은 외배엽 패터닝 신호에 반응할 중배엽 세포(또는 다른 유형)의 특성에 의존한다. 이 실험 시스템의 장점 중 하나는 다재다능하다는 것입니다. 이 특성은 중배엽 세포의 공급원, 예를 들어 다른 발달 단계의 세포, 사지를 따라 다른 위치에서, 또는 전체 (해리되지 않은) 또는 재응집 된 세포 7,8,9,10을 변화시킴으로써 다중 조합의 생성을 허용한다. 또 다른 예는 닭 이외의 종, 예를 들어, 거북이11, 메추라기, 또는 마우스12로부터 배아 외배엽을 수득하는 능력이다.
이러한 의미에서, RL 기술은 진화론적 관점에서 사지 발달과 사지 중간엽과 외배엽 세포 사이의 상호작용을 연구하는 데 도움이 된다. 이 기술은 또한 배아 외배엽12,13,14에 의해 제공된 신호를 이용함으로써 사지 유사 구조로 분화하는 선조 세포의 상이한 공급원의 능력을 분석하는 데 큰 잠재력을 갖는다. 시험관내 배양과는 달리, RL은 발달하는 사지(9,15)로부터의 배아 신호를 해석함으로써 세포 집단의 분화 및 형태형성 잠재력을 평가할 수 있게 한다.
이 프로토콜에서, 재응집된 중배엽 사지 새싹 세포와 함께 성공적인 RL을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제공되고, 따라서 재응집된 세포의 상이한 공급원 또는 심지어 상이한 외배엽 공급원과 함께 이 프로토콜을 적응시킬 수 있는 가능성을 열어준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일반적으로, RL 프로토콜은 다섯 단계로 나눌 수 있다: (1) 배아 배양, (2) 외배엽을 채우기 위한 사지 중배엽 세포 획득, (3) 외배엽을 얻는 것, (4) 외배엽 덮개 내부에 중배엽 세포를 조립하는 것, 및 (5) 채워진 외배엽을 숙주 배아로 이식하는 것. RL 기술의 주요 한계는 길고 상세한 프로토콜이며, 이는 적절하게 수행하기 위해 인내심이 필요한 많은 중요한 포인트를 가지고 있습니다. 프로토콜을 성?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
그림 2의 이미지를 주신 Estefania Garay-Pacheco와 작품에 대한 Maria Valeria Chimal-Montes de Oca에게 감사드립니다. 이 작품은 Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [보조금 번호 IN211117 및 IN213314] 및 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [보조금 번호 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]가 JC-M에 수여했습니다. JC M-L은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)로부터 박사후 펠로우십을 받았다.
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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