Chicken Recombinant Limbs Assay, um Morphogenese, Musterung und frühe Schritte in der Zelldifferenzierung zu verstehen

Summary

Rekombinante Gliedmaßen sind ein leistungsfähiges experimentelles Modell, das es ermöglicht, den Prozess der Zelldifferenzierung und die Erzeugung von Mustern unter dem Einfluss embryonaler Signale zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung rekombinanter Gliedmaßen mit Mesodermalzellen von Hühnergliedmaßen vor, die an andere Zelltypen angepasst werden können, die aus verschiedenen Organismen gewonnen werden.

Abstract

Zelldifferenzierung ist der fein abgestimmte Prozess der Zellbindung, der zur Bildung verschiedener spezialisierter Zelltypen während der Etablierung von sich entwickelnden Geweben und Organen führt. Dieser Prozess wird im Erwachsenenalter aktiv aufrechterhalten. Die Zelldifferenzierung ist ein fortlaufender Prozess während der Entwicklung und Homöostase von Organen. Das Verständnis der frühen Schritte der Zelldifferenzierung ist unerlässlich, um andere komplexe Prozesse wie die Morphogenese zu kennen. Somit sind rekombinante Hühnergliedmaßen ein experimentelles Modell, das die Untersuchung der Zelldifferenzierung und Mustergenerierung unter embryonalen Mustersignalen ermöglicht. Dieses experimentelle Modell imitiert eine In-vivo-Umgebung ; Es setzt reaggregierte Zellen zu einer ektodermalen Hülle zusammen, die aus einer frühen Gliedmaßenknospe gewonnen wird. Später werden Ektoderme übertragen und in einen Kükenembryorezeptor implantiert, um seine Entwicklung zu ermöglichen. Dieser Assay wurde hauptsächlich verwendet, um mesodermale Gliedmaßenknospenzellen zu bewerten; Es kann jedoch auf andere Stamm- oder Vorläuferzellen aus anderen Organismen angewendet werden.

Introduction

Die Wirbeltierextremität ist ein beeindruckendes Modell zur Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation, des Zelltods, der Musterbildung und der Morphogenese ^1,2. Während der Entwicklung treten Gliedmaßen als Ausbuchtungen aus den Zellen aus, die aus dem lateralen Plattenmesoderm¹ stammen. Gliedmaßenknospen bestehen aus einem zentralen Kern mesodermaler Zellen, die von einem Ektoderm bedeckt sind. Aus dieser frühen Struktur entsteht ein ganzes und wohlgeformtes Gliedmaß. Nachdem die Gliedmaßenknospe entstanden ist, werden drei Achsen erkannt: (1) die proximo-distale Achse ([PD] Schulter zu den Fingern), (2) die dorso-ventrale Achse ([DV] vom Handrücken bis zur Handfläche) und (3) die vorder-hintere ([AP] Daumen zu Finger). Die proximale-distale Achse hängt vom apikalen ektodermalen Kamm (AER) ab, einem spezialisierten Ektoderm an der distalen Spitze der Gliedmaßenknospe. Die AER wird für das Auswachsen, die Überlebenserhaltung, die Proliferation und den undifferenzierten Zustand der Zellen, die Signale empfangen, benötigt ^2,3. Auf der anderen Seite steuert die Zone der Polarisationsaktivität (ZPA) die anteroposteriore Strukturierung⁴, während das dorsale und das Ektoderm die dorsoventrale Strukturierung^{steuern 7,8}. Die Integration dreidimensionaler Muster impliziert ein komplexes Übersprechen zwischen diesen drei Achsen⁵. Trotz des Verständnisses des molekularen Weges während der Gliedmaßenentwicklung bleiben offene Fragen über die Mechanismen, die die Musterung und das richtige Auswachsen steuern, um eine ganze Extremität zu bilden, unbeantwortet.

Edgar Zwilling entwickelte 1964 das System der rekombinanten Gliedmaßen (RL), um die Wechselwirkungen zwischen mesenchymalen Zellen der Gliedmaßen und dem Ektoderm bei der Entwicklung von Gliedmaßen^{zu untersuchen 6}. Das RL-System setzt das dissoziiert-reaggregierte Gliedmaßenknospen-Mesoderm in das embryonale Gliedmaßen-Ektoderm zusammen, um es in den dorsalen Teil eines Spender-Küken-Embryos zu transplantieren. Die vom Ektoderm bereitgestellten Signale induzieren die Expression von Differenzierungsgenen und Mustergenen auf räumlich-zeitliche Weise und induzieren so die Bildung einer gliedmaßenartigen Struktur, die die Zellprogramme, die während der Gliedmaßenentwicklung auftreten, rekapitulieren kann ^7,8,9.

Das RL-Modell ist wertvoll für das Verständnis der Eigenschaften von Gliedmaßenkomponenten und der Wechselwirkung zwischen mesodermalen und ektodermalen Zellen⁶. Eine RL kann als eine gliedmaßenartige Struktur definiert werden, die durch die experimentelle Zusammenstellung oder Rekombination von Mesodermalzellen der Gliedmaßenknospen innerhalb einer ektodermalen Hülle^{entsteht 6}. Die Morphogenese des RL hängt von den Eigenschaften der mesodermalen Zellen (oder anderer Typen) ab, die auf die ektodermalen Mustersignale reagieren. Einer der Vorteile dieses experimentellen Systems ist seine Vielseitigkeit. Diese Eigenschaft ermöglicht die Bildung von Mehrfachkombinationen durch Variation der Quelle von mesodermalen Zellen, wie Zellen aus verschiedenen Entwicklungsstadien, aus verschiedenen Positionen entlang der Extremität oder ganzen (undissoziierten) oder reaggregierten Zellen 7,8,9,10. Ein weiteres Beispiel ist die Fähigkeit, das embryonale Ektoderm von anderen Arten als Hühnern zu erhalten, zum Beispiel Schildkröte¹¹, Wachtel oder Maus¹².

In diesem Sinne hilft die RL-Technik, die Entwicklung der Gliedmaßen und die Wechselwirkungen zwischen mesenchymalen und ektodermalen Zellen der Gliedmaßen aus evolutionärer Sicht zu untersuchen. Diese Technik hat auch ein großes Potenzial für die Analyse der Fähigkeit verschiedener Quellen von Vorläuferzellen, sich in eine gliedmaßenartige Struktur zu differenzieren, indem die Signale des embryonalen Ektoderms^12,13,14 genutzt werden. Im Gegensatz zu In-vitro-Kulturen erlaubt die RL die Bewertung der Differenzierung und des morphogenetischen Potenzials einer Zellpopulation durch Interpretation embryonaler Signale von einem sich entwickelnden Glied ^9,15.

In diesem Protokoll wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung einer erfolgreichen RL mit reaggregierten mesodermalen Gliedmaßenknospenzellen bereitgestellt, wodurch die Möglichkeit eröffnet wird, dieses Protokoll mit verschiedenen Quellen von reaggregierten Zellen oder sogar verschiedenen Ektodermquellen anzupassen.

Protocol

Diese Forschung wurde vom Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals des Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexiko-Stadt, Mexiko) überprüft und genehmigt. Ein schematisches Flussdiagramm der allgemeinen Schritte dieses Protokolls ist in Abbildung 1A dargestellt. 1. Inkubation von Embryonen und Bestimmung der Lebensfähigkeit Befruchtete Hühnereier bei 3…

Representative Results

Erkennen einer gut funktionierenden rekombinanten ExtremitätNach der Transplantation wurden die manipulierten Embryonen in den Inkubator zurückgebracht, damit sich die RL entwickeln konnte. Die Inkubationszeit korrelierte mit den Anforderungen des Experiments. Dennoch kann die RL nach 12 h Implantation leicht unterschieden werden. Um festzustellen, ob die Implantation ausreichend war, wurde die RL als Protuberanzung beobachtet, die sicher an der mesodermalen Wand des Spenderembryos befestigt war (<…

Discussion

Im Allgemeinen kann das RL-Protokoll in fünf Schritte unterteilt werden: (1) Embryoneninkubation, (2) Gewinnung von Mesodermalzellen der Gliedmaßen zur Füllung der Ektoderme, (3) Gewinnung der Ektoderme, (4) Zusammenstellung mesodermaler Zellen in den ektodermalen Hüllen und (5) Transplantation der gefüllten Ektoderme in die Wirtsembryonen. Die Haupteinschränkung der RL-Technik ist das lange, detaillierte Protokoll, das viele kritische Punkte enthält, die Geduld erfordern, um angemessen zu funktionieren. Um das Pr…

Materials

Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Angled slit knife	Alcon	2.75mm DB
Blunt forceps	Fine Science Tools	11052-10
Collagenase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000069
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifuge	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA
Palladium wire	GoodFellow	7440 05-3
Petri dish	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin porcine	Merck	9002 07-7
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01