Summary
تحدد الطرق الموضحة هنا إجراء يستخدم لعكس اللدونة التي يسببها الكوكايين بصريا في دائرة ذات صلة سلوكيا في الفئران. يؤدي التحفيز البصري المستمر منخفض التردد لمشابك المهاد اللوزة إلى الاكتئاب على المدى الطويل (LTD). في الجسم الحي ، أدى LTD المستحث بصريا في الفئران ذات الخبرة في الكوكايين إلى التوهين اللاحق للبحث عن المخدرات بدافع جديلة.
Abstract
يوضح هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لاستخدام أدوات علم البصريات الوراثي لعكس اللدونة التي يسببها الكوكايين في دوائر المهاد اللوزة لتقليل سلوكيات البحث عن الكوكايين اللاحقة في الفئران. في بحثنا ، وجدنا أنه عندما تقوم الفئران بإعطاء الكوكايين عن طريق الوريد مقترنا بإشارة سمعية بصرية ، فإن نقاط الاشتباك العصبي التي تشكلت عند مدخلات من النواة الوراثية الإنسية للمهاد (MGN) على الخلايا العصبية الرئيسية في اللوزة الجانبية (LA) تصبح أقوى مع تعلم ارتباط الكوكايين. افترضنا أن عكس اللدونة التي يسببها الكوكايين في هذه المشابك من شأنه أن يقلل من سلوك البحث عن الكوكايين بدافع الإشارة. من أجل تحقيق هذا النوع من التعديل العصبي في الجسم الحي ، أردنا إحداث اكتئاب طويل الأجل متشابك (LTD) ، مما يقلل من قوة نقاط الاشتباك العصبي MGN-LA. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمنا علم البصريات الوراثي ، والذي يسمح بالتعديل العصبي لدوائر الدماغ باستخدام الضوء. تم التعبير عن opsin oChiEF المثير على محطات MGN قبل المشبكية في لوس أنجلوس عن طريق غرس AAV يحتوي على oChiEF في MGN. ثم تم زرع الألياف الضوئية في لوس أنجلوس وتم نبض ضوء الليزر 473 نانومتر بتردد 1 هرتز لمدة 15 دقيقة للحث على اللدونة التي يسببها الكوكايين LTD وعكسها. ينتج عن هذا التلاعب انخفاض طويل الأمد في قدرة الإشارات المرتبطة بالكوكايين على حث إجراءات البحث عن المخدرات.
Introduction
يعد تعاطي المخدرات مشكلة صحية عامة خطيرة للغاية في الولايات المتحدة وفي جميع أنحاء العالم. على الرغم من عقود من البحث المكثف ، هناك عدد قليل جدا من الخيارات العلاجية الفعالة 1,2. نكسة كبيرة للعلاج هي حقيقة أن تعاطي المخدرات المزمن يولد ذكريات ترابطية طويلة الأجل بين الإشارات البيئية والدواء نفسه. تؤدي إعادة التعرض للإشارات المتعلقة بالمخدرات إلى استجابات فسيولوجية وسلوكية تحفز استمرار تعاطي المخدرات والانتكاس3. تتمثل الإستراتيجية العلاجية الجديدة في سن علاجات قائمة على الذاكرة تهدف إلى التلاعب بالدوائر المشاركة في تنظيم ارتباطات إشارات الأدوية. في الآونة الأخيرة ، لوحظ أن نقاط الاشتباك العصبي في اللوزة الجانبية (LA) ، وتحديدا تلك الناشئة عن النواة التناسلية الإنسية (MGN) للمهاد ، يتم تعزيزها عن طريق الإدارة الذاتية المتكررة المرتبطة بالكوكايين ، وأن هذا التقوية يمكن أن يدعم سلوك البحث عن الكوكايين 4,5. لذلك ، تم اقتراح أنه يمكن تخفيف الإعادة التي يسببها جديلة عن طريق عكس اللدونة في نقاط الاشتباك العصبي MGN-LA.
كانت القدرة على استهداف اللدونة المشبكية بدقة لدائرة دماغية معينة تحديا كبيرا لهذا المجال. حققت الأدوات الدوائية التقليدية بعض النجاح في تقليل سلوكيات الانتكاس ، ولكنها محدودة بسبب عدم القدرة على التلاعب بنقاط الاشتباك العصبي الفردية. ومع ذلك ، فإن التطور الأخير في علم البصريات الوراثي في الجسم الحي قد وفر الأدوات اللازمة للتغلب على هذه القيود والتحكم في المسارات العصبية بدقة زمنية ومكانية6،7،8. من خلال التعبير عن الأوبسينات الحساسة للضوء في دائرة دماغية معينة ، يمكن بعد ذلك استخدام ضوء الليزر لتنشيط الدائرة أو تثبيطها. يمكن استخدام التحفيز البصري المعتمد على التردد لمعالجة اللدونة المشبكية للدائرة على وجه التحديد في يتصرف.
توضح هذه المخطوطة الإجراء المتخذ لمعالجة دائرة MGN-LA ذات الصلة سلوكيا باستخدام علم البصريات الوراثي في الجسم الحي . أولا ، تم التعبير عن opsin oChIEF المثير في MGN وتم زرع الألياف الضوئية بشكل ثنائي في لوس أنجلوس. ثم تم تدريب الحيوانات على إعطاء الكوكايين ذاتيا بطريقة تعتمد على الإشارات ، مما يعزز مسار MGN-LA. بعد ذلك ، تم استخدام التحفيز المستمر منخفض التردد مع ضوء ليزر 473 نانومتر لإنتاج LTD خاص بالدائرة. أدى عكس اللدونة الناجمة عن تعاطي الكوكايين إلى انخفاض طويل الأمد في قدرة الإشارات على إطلاق الإجراءات المرتبطة بسلوك البحث عن المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول متسقة مع الإرشادات التي وضعها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة بيتسبرغ. تم تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام فئران Sprague-Dawley البالغة والساذجة التي تزن 275-325 جم عند الوصول.
1. بناء غرسات الألياف البصرية وكابلات التصحيح
- تحضير غرسات الألياف البصرية باتباع البروتوكولات المنشورة مسبقا9. استخدمت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول 200 ميكرومتر من الألياف الأساسية (0.5 NA) و Ø1.25 مم متعدد الأوضاع LC / PC الطويق الخزفي ، حجم ثقب Ø230 μm.
- استخدم أداة Dremel لتسجيل الثلث السفلي من الطويق (الأقرب إلى النهاية المسطحة للحلقة). يساعد تسجيل الحلقات على البقاء ملتصقا بأسمنت الأسنان ، مما يزيد من احتمالية بقائهم آمنين طوال فترة التجريب.
- استخدم قواطع الأسلاك لقطع ~ 35 مم من الألياف. استخدم أداة تجريد الألياف لتجريد ~ 25 مم من الألياف ، وترك 10 مم غير مكشوفة.
- تحضير الايبوكسي القابل للمعالجة بالحرارة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حل 1 غرام من مسحوق الراتنج في 100 ملغ من مركب تصليب. قم بتوصيل إبرة قياس 25 بحقنة سعة 1 مل. املأ المحقنة بالإيبوكسي وأرفق طرف إبرة قياس 25.
- استخدم نائبا أو مشبكا لتثبيت الطويق بإحكام بحيث يكون الجانب المسطح متجها لأعلى والجانب المحدب متجها لأسفل. باستخدام المحقنة المملوءة بالإيبوكسي ، أضف قطرة واحدة من الإيبوكسي إلى الجانب المسطح من الطويق ، مع توخي الحذر لمسح الإيبوكسي الزائد من جوانب الطويق.
- أدخل الجزء المجرد من الألياف من خلال الطويق مما يسمح بتعريض 5 مم إضافية من الألياف المجردة. في حالة غرسات LA ، سيتم زرع الألياف 7.9 مم بطني إلى بريجما ، لذلك يجب أن يكون الطول المكشوف للألياف غير المجردة ~ 13 مم.
- عالج الإيبوكسي بمسدس حراري لمدة 30-40 ثانية حتى يتحول لونه إلى اللون الأسود / الكهرماني.
- سجل الألياف مباشرة في واجهة الطرف المحدب من الطويق بسكين الماس واستخدم إصبعك للاستفادة برفق من الألياف.
- قم بتلميع الطرف المحدب للحلقة عن طريق الإمساك بمرقئ ، والتأكد من تطبيق ضغط متساو ، وإجراء 20 دورة دائرية لكل منها على سلسلة من ورق التلميع (من الدرجة العالية إلى الدرجة المنخفضة ؛ 5 ، 3 ، 1 ، 0.3 ميكرومتر).
- قم بتأمين الألياف غير المجردة على الطاولة باستخدام الشريط والألياف المجردة ، مع ترك 2 مم إضافية خارج الإحداثيات البطنية (بالنسبة لغرسات LA ، الطول النهائي للألياف هو ~ 10 مم). استخدم مرقئ لسحب الطويق وكسر الألياف بالتساوي حيث تم تسجيلها. احرص على عدم قطع الألياف تماما عند التسجيل ، وإلا فسوف يتلف قلب الألياف.
- بناء كابلات التصحيح المتوافقة مع غرسات الألياف البصرية. تم شراء كابلات تصحيح مصممة خصيصا (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، يمكن إنشاء كبلات التصحيح باتباع البروتوكولات المنشورة مسبقا9.
ملاحظة: يجب أن يتطابق قطر و NA لألياف الطويق وألياف كابل التصحيح عند تقاطع التوصيل لمنع الفقد الزائد للضوء ، مما قد يؤدي إلى فشل في تحفيز النشاط العصبي بشكل كاف. - قم بقياس خرج الضوء من خلال كابل التصحيح وغرسات الألياف البصرية عن طريق توصيل كابل التصحيح / الألياف البصرية بمصدر ضوء ليزر مناسب (473 نانومتر ، خرج 1 ميجاوات) وقياس الإخراج باستخدام مستشعر الضوء. ستصدر الألياف التي تم إنشاؤها بنجاح دائرة متحدة المركز من الضوء ولن تفقد الضوء أكثر من 30٪.
2. القسطرة الوريدية للقوارض ، وتوصيل الفيروسات ، وزرع الألياف البصرية
- إعداد الحيوان للجراحة.
- تخدير الفئران بالكامل بمخدر من اختيارك بناء على المبادئ التوجيهية المؤسسية. أحد الخيارات هو كيتامين هيدروكلوريد (87.5-100 ملغم / كغم ، أي متر) وزيلازين هيدروكلوريد (5 ملغم / كغم ، أي متر). تأكد من تخدير الجرذ بالكامل عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.
تنبيه: الكيتامين مادة خاضعة للرقابة يجب التعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
ملاحظة: يستخدم الحقن العضلي للتخدير في هذه الدراسة لأنه أنتج تحريضا تخديريا أسرع وأكثر موثوقية من الحقن داخل الصفاق. راقب باستمرار تنفس الفئران واستجابتها وقدم الدعم الحراري طوال الجراحة. - حلق مساحة كبيرة من ظهر الجرذ (أعلى الظهر من أعلى لوحي الكتف مباشرة إلى منتصف الظهر) وكذلك منطقة الرقبة أسفل الطرف الأمامي الأيمن وفروة الرأس.
- ضع الجرذ في منطقة الجراحة وقم بتطبيق puralube (دموع اصطناعية) على العينين. حقن حجم وزن الجسم من كاربروفين (مسكن) تحت الجلد (s.c.) من خلال الجلد من الجزء العلوي من الظهر ، ثم حقن 5 مل من محلول Lactated Ringer s.c. من خلال جلد أسفل الظهر.
- تعقيم جميع المواقع الجراحية عن طريق ترطيب قطعة من الشاش المعقم بالبيتادين ومسحها أسفل المنطقة الجراحية المحلوقة باستخدام حركة دائرية. ثم كرر العملية مع 70 ٪ من الإيثانول. كرر هذه الدورة المتناوبة ثلاث مرات.
- تخدير الفئران بالكامل بمخدر من اختيارك بناء على المبادئ التوجيهية المؤسسية. أحد الخيارات هو كيتامين هيدروكلوريد (87.5-100 ملغم / كغم ، أي متر) وزيلازين هيدروكلوريد (5 ملغم / كغم ، أي متر). تأكد من تخدير الجرذ بالكامل عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.
- إجراء زرع القسطرة في الوريد وفقا للبروتوكولات المنشورة مسبقا4،10.
ملاحظة: لا يتم استخدام الستارة الجراحية أثناء هذه الجراحة لتجنب التهيج أثناء زرع القسطرة. تعقيم جميع الأدوات والمعدات قبل الاستخدام. استخدم قفازات معقمة وقم بتغيير القفازات إذا تم ملامسة أي سطح غير معقم. - مباشرة بعد زرع القسطرة ، قم بتأمين الجرذ في إطار مجسم لإجراء حقن AAV.
- إعطاء حقنة تحت الجلد (s.c) من 2٪ ليدوكائين (0.2-0.3 مل) إلى فروة الرأس كمخدر موضعي.
ملاحظة: لا يستخدم المخدر الموضعي أثناء زرع القسطرة الوريدية لتجنب التغييرات في النتائج الجراحية. - قم بتوصيل قنية حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ عيار 26 بحقنة هاملتون مملوءة ب 1 ميكرولتر من محلول AAV المركز: إما AAV5-hSyn-tdTomato أو AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
ملاحظة: oChIEF هو نوع مختلف من قناة الأوبسين الحساسة للضوء الأزرقرودوبسين (ChR2) ، والتي يمكن أن تستجيب لمجموعة واسعة من الترددات 8,11 ، وبالتالي فهي مفيدة لتجارب LTD منخفضة التردد التي تمت مناقشتها في هذا البروتوكول ، ولكن أيضا لتجارب LTP عالية التردد (لم تتم مناقشتها هنا). تم التبرع ببناء oChIEF من قبل الدكتور روجر تسيين ومعالجته للتغليف والتنقية بواسطة Duke Viral Vector Core. هناك حاجة إلى 3-4 أسابيع على الأقل بين يوم الحقن ويوم تحريض LTD للسماح بالتعبير الأمثل للفيروس في نهايات محور MGN.
تنبيه: بشكل عام ، يعتبر AAV ككائن من المستوى 1 للسلامة الأحيائية (BSL-1) ، مع انخفاض خطر الإصابة بالعدوى الذاتية ما لم يتم استخدام فيروس مساعد في إنتاجه. يتطلب استخدامه موافقة IACUC ويجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات وفقا للإرشادات المؤسسية للحد من التعرض غير الضروري. - باستخدام مشرط ، قم بعمل شق 0.5 مم من مقدمة الجمجمة إلى مؤخرتها ، وقم بإزالة الأنسجة العلوية لكشف سطح الجمجمة.
- قم بتسوية رأس الجرذ في المحور الأمامي / الخلفي والإحداثيات المجسمة الصفرية إلى bregma.
- حفر ثلاثة ثقوب صغيرة من خلال الجمجمة باستخدام أداة Dremel مجهزة مثقاب صغير. استخدم مفك البراغي لتركيب مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ (M2x4 965-A2) بإحكام في مكانها.
ملاحظة: البراغي ضرورية للربط السليم لأسمنت الأسنان وإنشاء أغطية رأس متينة وطويلة الأمد. يجب أن ينتشر موضع البراغي عبر المحور الأمامي الخلفي للجمجمة ، وبعيدا عن موقع حقن AAV. - حفر ثقوب ثنائية لحقن AAV بناء على الإحداثيات من أطلس دماغ الفئران (Watson و Paxinos)12 للجزء الإنسي من النواة التناسلية الإنسية (MGN) ؛ بالملليمتر من بريغما ، ا ف ب: -5.4 ؛ ML: ±3.0; DV: -6.6. خفض قنية الحقن ببطء (4 مم / دقيقة) حتى يتم وضعها في MGN. حقن محلول AAV المركز بمعدل 0.1 ميكرولتر / دقيقة.
- اترك قنية الحقن في مكانها لمدة 5 دقائق بعد اكتمال الحقن للسماح بالانتشار بعيدا عن القنية ثم اسحب القنية ببطء من الدماغ.
- إعطاء حقنة تحت الجلد (s.c) من 2٪ ليدوكائين (0.2-0.3 مل) إلى فروة الرأس كمخدر موضعي.
- مباشرة بعد حقن الفيروس ، استمر في زرع الألياف البصرية 4,9 التي تستهدف محطات MGN-LA.
- استخدم أداة Dremel لحفر ثقوب ثنائية لزراعة الألياف البصرية التي تستهدف اللوزة الجانبية (بالملليمتر من bregma ، AP: -3.0 ؛ مل ±5.1).
- استخدم الملقط للاستيلاء على حلقة غرسة الألياف البصرية وتثبيتها في المحولات المجسمة بحيث يتم تثبيتها بإحكام في مكانها.
- خفض الألياف ببطء بمعدل 2 مم / دقيقة ، حتى يستقر طرف الألياف في الجزء الظهري من LA (DV: -7.9 مم).
- قم بتثبيت الحلقات في الجمجمة أولا باستخدام طبقة رقيقة من لاصق Loctite الفوري متبوعا بأسمنت الأسنان وحلقات الغطاء بأكمام الطويق بقطر 1.25 مم وأغطية الغبار.
ملاحظة: يجب الموافقة على اختيار المادة اللاصقة لتأمين الحلقات إلى الجمجمة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المحلية أو المؤسسية. يستخدم Loctite لهذه الدراسة لتأمين الحلقات بشكل موثوق إلى الجمجمة بعد التجربة والخطأ مع مواد لاصقة متعددة. ومع ذلك ، يمكن النظر في البدائل المتاحة.
- بعد العمليات الجراحية ، الفئران المنزل بشكل فردي ، وتوفير حرية الوصول إلى الطعام والماء. توفير رعاية ما بعد الجراحة بما يتفق مع المبادئ التوجيهية المؤسسية. اغسل القسطرة يوميا بمحلول ملحي يحتوي على جنتاميسين (5 مجم / مل) وهيبارين (30 USP / مل) للحفاظ على المباح. بعد 5 أيام على الأقل من الجراحة و 24 ساعة قبل بدء التجارب السلوكية ، يقيد الطعام الفئران إلى ~ 90٪ من وزنها الحر.
3. الإدارة الذاتية للقوارض الكوكايين وانقراض رافعة مفيدة
ملاحظة: يتم إجراء جميع الإجراءات السلوكية في غرف تكييف قياسية ، ومجهزة برافعتين قابلتين للسحب على جدار واحد ، وضوء تحفيز فوق كل رافعة ، ومولد نغمة ، ومصباح منزل ، ومضخة تسريب.
- إخضاع الفئران لدورات تدريبية يومية على الإدارة الذاتية للكوكايين لمدة ساعة واحدة (2 مجم / مل) بموجب جدول FR1 للتعزيز.
- ضع الفئران في غرفة التشغيل كل يوم واسمح للفئران بالضغط على الرافعة. يؤدي الضغط على "الرافعة النشطة" المعينة (المتوازنة عبر الرافعات اليمنى واليسرى) إلى تسريب الكوكايين (1.0 مجم / كجم / تسريب) وعرض 10 ثوان لإشارة مركبة للضوء والنغمة. الضغط على "الرافعة غير النشطة" المعينة ليس له تأثيرات مبرمجة.
- استمر في تجارب الإدارة الذاتية لمدة 10 أيام على الأقل وحتى تكسب الفئران بنجاح ما لا يقل عن 8 دفعات / يوم على مدار 3 أيام متتالية. يؤدي الفشل في الوصول إلى معايير الاستحواذ بحلول اليوم 20 إلى الاستبعاد من الدراسة.
- بعد استيفاء معايير الاستحواذ بنجاح ، تخضع الفئران لجلسات انقراض مفيدة لمدة 1 ساعة لمدة 6-10 د.
- ضع الفئران في غرف فعالة واسمح للفئران بالضغط بحرية. ومع ذلك ، فإن الاستجابات على كل من الروافع النشطة وغير النشطة ليس لها عواقب مبرمجة.
- اجعل الفئران تستمر في الانقراض الفعال يوميا حتى يحدث ما معدله < 25 ضغطة رافعة على مدار يومين متتاليين.
4. في الجسم الحي تحريض البصريات الوراثية المحدودة
ملاحظة: تجري تجارب تثبيط البصريات الوراثية بعد 24 ساعة من اليوم الأخير من الانقراض الآلي.
- قم بتوصيل أسلاك التصحيح بصمام ليزر أزرق 473 نانومتر عبر مفصل دوار معلق فوق قفص إسكان قوارض قياسي نظيف مع إزالة الغطاء. يسمح هذا الإعداد للقوارض بالتحرك بحرية حول القفص أثناء التحفيز البصري الوراثي.
- قم بتشغيل صمام الليزر الثنائي وفقا لتعليمات التشغيل وقم بتوصيله بمولد النبض. ضبط الإعدادات ، بحيث عند تشغيل الفئران سوف تتلقى 900 نبضة 2 مللي ثانية من الضوء عند 1 هرتز.
تنبيه: يجب استخدام حماية العين المناسبة في جميع الأوقات أثناء تشغيل الليزر. - قم بقياس شدة الضوء من خلال سلك التصحيح باستخدام مستشعر الضوء. اضبط شدة الليزر بحيث يكون خرج الضوء عبر كابل التصحيح ~ 5-7 ميغاواط.
- ضع الفئران في قفص سكني نظيف. إزالة أغطية الغبار والأكمام الطويق ، وفضح الحلقات. قم بتوصيل أسلاك التصحيح بشكل ثنائي بغرسات الألياف البصرية. اسمح للفئران باستكشاف البيئة لمدة 3 دقائق قبل تحريض LTD.
- قم بتشغيل مولد النبض لبدء التحفيز البصري الوراثي.
ملاحظة: على الرغم من أنه من غير المحتمل ، إذا واجهت الفئران أي ردود فعل سلبية للتحفيز ، يتم إنهاء التجربة على الفور ، ويتم القتل الرحيم للفئران بشكل صحيح بناء على المبادئ التوجيهية المؤسسية. - بعد تحريض LTD ، احتفظ بالفئران في القفص لمدة 3 دقائق ، ثم ضعها مرة أخرى في أقفاصها المنزلية.
- بالنسبة لتجارب التحكم ، استخدم نفس إجراء التحفيز على الفئران التي تعبر عن فيروس التحكم AAV5-tdTomato . بالنسبة للتجارب الوهمية ، قم بتوصيل سلك تصحيح بالألياف البصرية للفئران التي تعبر عن فيروس AAV5-oChIEF ، ولكن لا يتم تقديم أي تحفيز خلال جلسة مدتها 15 دقيقة.
5. اختبار تأثير التحفيز البصري الوراثي على البحث عن الكوكايين الناجم عن جديلة
- بعد 24 ساعة من التحفيز البصري الوراثي في الجسم الحي ، ضع الفئران مرة أخرى في غرف تكييف فعالة. تخضع الفئران لجلسة إعادة قياسية مستحثة بالإشارة لمدة 1 ساعة لتقييم سلوك البحث عن الكوكايين.
ملاحظة: أثناء الإعادة المستحثة بالإشارة ، ينتج عن الاستجابة على الرافعة النشطة عرض تقديمي لمدة 10 ثوان للإشارة المرتبطة بالكوكايين ، ولكن بدون حقن الكوكايين. - إعطاء اختبار إعادة ثان على الأقل 1 أسبوع بعد الاختبار الأول لتحديد ما إذا كان تحريض OPTOGENETIC LTD يؤدي إلى قمع طويل الأمد للبحث عن الكوكايين
6. تلطيخ ، مضان ، والتصوير للتحقق النسيجي من التعبير الفيروسي ووضع الألياف البصرية
- اصنع 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) و 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). قم بتخزين كلا الحلين على الجليد. يعتمد الحجم الإجمالي على عدد الفئران في الدراسة (سيتم استخدام ~ 100 مل من PBS و 200 مل من PFA لكل فأر).
تنبيه: PFA مادة كيميائية سامة ومسرطنة معروفة. توخي الحذر المناسب لتجنب الاستنشاق وكذلك ملامسة الجلد. يجب أن يكون استخدامه والتخلص منه وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ، بما في ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة وغطاء التدفق الكيميائي. - قم بإعداد المضخة التمعجية بمعدل تدفق 20 مل / دقيقة. ملء أنابيب المضخة مع 1x PBS. قم بتوصيل إبرة قياس 20 بنهاية الأنبوب.
- تخدير الفئران بعمق باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغم / كغم ، أي ب). تأكد من عمق التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم قبل المضي قدما.
ملاحظة: يستخدم بنتوباربيتال الصوديوم لأن التروية هي إجراء نهائي. - استخدم المقص الجراحي لفتح تجويف البطن للفأر أسفل الحجاب الحاجز. قطع من خلال القفص الصدري بشكل دائري على طول الحواف الجانبية لفضح قلب الفئران. استخدم مرقئ لتثبيت الجزء المنقاري من القفص الصدري بعيدا عن القلب. اقطع أي أنسجة دهنية تحيط بالقلب.
- أدخل الإبرة الحادة عبر البطين الأيسر وصولا إلى الشريان الأورطي. اقطع ثقبا صغيرا في الأذين الأيمن لتصريف المحلول عند عودته إلى القلب.
- قم بأداء كل فأر مع 1x PBS لمدة 5 دقائق متبوعا ب 4٪ PFA ، درجة الحموضة 7.4 لمدة 10 دقائق.
- قطع رأس الفئران ، واستخراج الدماغ ، وإصلاحه في 4 ٪ PFA لمدة 24 ساعة. ثم نقل الدماغ إلى محلول السكروز 30 ٪ لمدة 2-3 د.
- قسم الأدمغة عند 50 ميكرومتر باستخدام cryostat.
- قم بتركيب جميع الشرائح التي تحتوي على LA أو MGN على شرائح زجاجية وغطاء غطاء.
- شرائح الصورة باستخدام مجهر فوق الفلورسنت للتحقق من تعبير AAV-oChIEF-tdTomato في MGN وإسقاطاته على LA ، بالإضافة إلى وضع الألياف البصرية فوق LA.
7. التروية وإعداد شريحة الدماغ الحادة لتجارب الفيزيولوجيا الكهربية
ملاحظة: يتم إجراء تجارب الفيزيولوجيا الكهربية على مجموعة فرعية من الحيوانات للتحقق من نجاح في الجسم الحي LTD.
- تحضير محاليل الفيزيولوجيا الكهربية باستخدام الكواشف المدرجة في الجداول 1-34،13. اضبط الرقم الهيدروجيني لجميع المحاليل على 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك واضبط الأسمولية على 300-310 مللي أوسم / كجم H2O. اجعل المحاليل طازجة قبل التجارب وخزنها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تشبع جميع المحاليل بالكاربوجين (95٪ O 2/5٪ CO2) في جميع الأوقات أثناء الاستخدام.
- باستخدام isoflurane وفقا لإرشادات رعاية واستخدام الحيوانات المحلية أو المؤسسية ، تخدير الفئران بعمق في غرفة القتل الرحيم المغلقة. تأكد من أن الحيوان قد تم تخديره بالكامل عن طريق منعكس قرصة إصبع القدم.
- املأ دورقا صغيرا ب 50 مل من محلول القطع بالثلج البارد. املأ أنبوب المضخة التمعجية بالمحلول واضبط معدل التدفق على 20 مل / دقيقة. قم بتوصيل إبرة قياس 20 بنهاية الأنبوب.
- افتح تجويف البطن (انظر الخطوتين 6.4 و 6.5) وقم بتغذية الفئران لفترة وجيزة بمحلول القطع (بحد أقصى 1-2 دقيقة).
- بعد التروية ، قطع رأس الفئران على الفور. قم بإزالة الدماغ وضعه في دورق صغير مملوء بمحلول قطع 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية -1 دقيقة.
- نقل العقول مع ملعقة وتثبيتها بسرعة إلى غرفة الاهتزاز. قم بإزالة الحنون باستخدام ملقط ناعم. املأ الحجرة بمحلول قطع 4 درجات مئوية وقم بإعداد شرائح إكليلية حادة (بسمك 250 ميكرومتر) من اللوزة بسرعة 0.37 مم / ثانية وتردد 70 هرتز.
- عند الحصول على الشرائح، توضع كل شريحة في حجرة مملوءة بمحلول التقطيع وتحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة. يمكن الحصول على حوالي 5-7 شرائح تحتوي على LA لكل.
- انقل الشرائح إلى دورق من محلول تثبيت بدرجة حرارة الغرفة (RT) واتركها تتعافى لمدة >30 دقيقة قبل التجربة.
ملاحظة: تظل الشرائح صحية بشكل عام مع الاحتفاظ بها في محلول لمدة 4-6 ساعات. نظرا لطبيعة الفلورسنت ل AAV ، يتم الاحتفاظ بالشرائح في ظروف الإضاءة المنخفضة.
8. تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية خارج الجسم الحي
- تحضير المحاليل داخل الخلايا باستخدام الكواشف المدرجة في الجداول 4-5.
ملاحظة: يجب عمل المحاليل داخل الخلايا قبل التجارب ويمكن تخزينها على المدى الطويل (3-12 شهرا) عند -80 درجة مئوية أو قصيرة الأجل (1-2 أشهر) عند -20 درجة مئوية. يتم ضبط الأس الهيدروجيني للمحاليل إلى 7.3 (مع CsOH للمحلول داخل الخلايا القائم على Cs ومع KOH للمحلول داخل الخلايا القائم على K). اضبط على الأسمولية النهائية البالغة 290-300 mOsm/kg H2O. - تحضير محلول مخزون بيكروتوكسين 500 مللي مول مذاب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
ملاحظة: يتم اقتباس مخزونات البيكروتوكسين وتخزينها عند -20 درجة مئوية. في يوم الاستخدام ، يتم إذابة القسمة وإضافتها إلى محلول التسجيل بتركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر.
تنبيه: البيكروتوكسين هو مضاد غير تنافسي لمستقبلات GABAA ، لذا فإن تسريب البيكروتوكسين له تأثير تحفيزي. وهو شديد السمية عن طريق الابتلاع عن طريق الفم أو امتصاص الجلد. يجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات عند العمل مع البيكروتوكسين. - انقل الشرائح إلى مجهر عمودي مصمم لتجارب الفيزيولوجيا الكهربية.
- أثناء التجارب ، قم بتسخين شرائح الصمامات باستمرار بمحلول التسجيل الذي يتم تسخينه إلى 31-33 درجة مئوية.
- قم بتكبير LA باستخدام هدف 4x. تحديد الخلايا العصبية الرئيسية عن طريق التشكل باستخدام عدسة غمر الماء 40x.
- استخدم ماصة زجاجية (3-5 MΩ) مملوءة إما بمحلول داخل الخلايا قائم على Cs (لتجارب مشبك الجهد) أو محلول داخل الخلايا قائم على K (لتجارب المشبك الحالي) للحصول على تسجيلات مشبك تصحيح الخلية الكاملة.
- تحديد الإسقاطات المحورية MGN المصابة ب AAV تحت التألق (باستخدام مرشح RFP). تحفيز الإسقاطات باستخدام ليزر DPSS ذو الضوء الأزرق (473 نانومتر) المتصل بمولد النبض.
تنبيه: للحد من التعرض لليزر ، يقترن ضوء الليزر الموازي بمنفذ فلورسنت على المجهر ويركز على الشريحة من خلال الهدف.
ملاحظة: في وضع مشبك الجهد ، يتم إثارة التيارات بعد المشبكية المثيرة (EPSCs) بصريا عند 0.1 هرتز. ستظهر الخلايا العصبية التي تتلقى مدخلات من الخلايا العصبية MGN المصابة ب AAV EPSCs موثوقة. - للحث على ex vivo LTD ، في وضع المشبك الحالي ، سجل خط أساس مستقر لإمكانات ما بعد المشبكي المثيرة (EPSPs) لمدة 10 دقائق على الأقل. بعد ذلك ، قم بتوصيل 900 نبضة 2 مللي ثانية من ضوء 473 نانومتر بتردد 1 هرتز (الوقت الإجمالي = 15 دقيقة). ثم سجل EPSPs باستمرار عند 0.1 هرتز لمدة ≥60 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 جدولا زمنيا يوضح ترتيب التجارب. خلال التجارب السلوكية ، يعمل عدد دفعات الكوكايين بالإضافة إلى عدد الاستجابات التي يتم إجراؤها على الرافعة النشطة كمقياس لشدة سلوك البحث عن الكوكايين. وخلال الأيام الأولى من تعاطي الكوكايين ذاتيا، ينبغي أن يزداد عدد الاستجابات النشطة تدريجيا خلال كل يوم اقتناء، قبل أن يستقر خلال الأسبوع الثاني. على العكس من ذلك ، يجب أن تظل استجابات الرافعة غير النشطة منخفضة طوال التجربة بأكملها (الشكل 2 أ). في اليوم الأول من الانقراض الفعال ، عادة ما تكون هناك زيادة في عدد استجابات الرافعة النشطة ، حيث يؤدي الغياب غير المتوقع للكوكايين إلى تصاعد سلوك البحث عن الكوكايين. ومع ذلك ، ستنخفض هذه الاستجابة تدريجيا مع الجلسات اللاحقة حيث تتعلم الفئران الطوارئ الجديدة ، مما يؤدي إلى عدد منخفض ومستقر من استجابات الرافعة النشطة في غضون 6-10 د (الشكل 2 ب). تتم إزالة الفئران التي تفشل في الوصول إلى معايير الاكتساب المحددة في مراحل الإدارة الذاتية أو الانقراض الفعال للتجربة من الدراسة ، ولا يتم تضمين البيانات في التحليل النهائي.
بعد الانقراض الفعال ، تؤدي إعادة التعرض للإشارات المرتبطة بالكوكايين إلى إعادة سلوك البحث عن الكوكايين ، مما يؤدي إلى زيادة عدد استجابات الرافعة النشطة. لوحظت هذه الزيادة في كلتا المجموعتين من تجارب التحكم: الفئران التي تم حقنها بالفيروس الذي يفتقر إلى oChIEF (مكافحة AAV) والفئران التي لم تتلق التحفيز بالليزر (مراقبة SHAM; الشكل 3 أ) ومع ذلك ، تسببت شركة invivo optogenetic LTD التابعة لمحطات MGN-LA في انخفاض في البحث اللاحق عن الكوكايين الناجم عن الإشارة. بعد 24 ساعة من تحريض OPTOGENETIC LTD ، تم تقليل عدد مكابس الرافعة النشطة بشكل كبير بالنسبة لكل من عناصر التحكم AAV وعناصر التحكم في SHAM (الشكل 3 أ). تم الحفاظ على هذا المستوى المنخفض من الاستجابة خلال اختبار إعادة التعيين اللاحق بعد 7 أيام (الذي تم إجراؤه في مجموعة فرعية من الفئران) (الشكل 3B) ، مما يشير إلى انخفاض مستمر في البحث عن الكوكايين بدافع جديلة عبر اختبارات إعادة متعددة.
أكدت تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية خارج الجسم الحي من الحيوانات المعرضة للتحفيز البصري أن التوهين في إعادة الوضع إلى ما كان يرجع بالفعل جزئيا على الأقل إلى تعديل اللدونة المشبكية MGN-LA. وقد تجلى ذلك من خلال انخفاض سعة EPSC المستثارة بصريا في الخلايا العصبية في لوس أنجلوس بعد التعرض ل LTD البصري (الشكل 4 أ). كان هذا التوهين في سعة EPSC خاصا بالخلايا العصبية التي تلقت تحفيزا بصريا ، حيث ظلت سعة EPSC دون تغيير في ضوابط SHAM. بالإضافة إلى ذلك ، لم يكن من الممكن توليد LTD في شرائح من الفئران التي تلقت بالفعل تحفيزا بصريا في الجسم الحي ، ولكن تم استحضارها بشكل موثوق في الخلايا العصبية من الفئران التي خضعت لتحفيز SHAM ، كما يتضح من الانخفاض المستمر في منحدر ارتفاع EPSP (الشكل 4 ب). وبالتالي ، يبدو أن التحفيز البصري في الجسم الحي يحجب المزيد من تحريض LTD في شريحة. أثناء التسجيل ، من المهم قياس مقاومة السلسلة خلال مدة التسجيل لضمان الحفاظ على صحة التصحيح. لا يتم قبول الخلايا ذات التغيير في مقاومة السلسلة التي تتجاوز 20٪ لتحليل البيانات. هذا مهم بشكل خاص لتجارب LTD التي تستمر >60 دقيقة ، حيث يمكن أن تؤثر التغييرات في مقاومة السلسلة على ديناميكيات المستقبلات والقناة. للتأكد من أن المواد التي يتم تحفيزها أثناء التسجيلات الكهربية تنشأ في MGN ، من المهم جمع الشرائح من خلال مدى المهاد. هذا بمثابة التحقق من أن أجسام الخلايا في MGN تعبر بالفعل عن AAV بشكل فلوري. بالإضافة إلى التأكيد البصري ، فإن التحقق الوظيفي ضروري أيضا. في ظل ظروف المشبك الحالي ، تطلق الخلايا العصبية MGN المصابة ب AAV-oChIEF إمكانات عمل استجابة لكل من الترددات العالية والمنخفضة لتحفيز الضوء 473 نانومتر (الشكل 4C).
اعتبرت جميع النتائج السلوكية مؤقتة حتى تم التحقق من التعبير الفيروسي وزرع الألياف البصرية نسيجيا وتم تأكيد الموضع المناسب (الشكل 5). تم استبعاد عدم وجود تعبير AAV في MGN أو LA و / أو تلك التي لم يتم فيها وضع الألياف البصرية بشكل صحيح داخل LA الظهري من التحليل التجريبي ، ولكن في بعض الحالات قد يتم تضمينها كعنصر تحكم تشريحي سلبي.
الشكل 1: الجدول الزمني للإجراء التجريبي. الخطوط العريضة للخطوات الحاسمة للبروتوكول ، بما في ذلك الدورة الزمنية المتسلسلة ومدة كل مرحلة تجريبية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: اقتناء وانقراض تعاطي الكوكايين ذاتيا. (أ) تظهر الحيوانات عددا متزايدا من دفعات الكوكايين واستجابات الرافعة النشطة عبر الاستحواذ ، ومستوى منخفض من استجابات الرافعة غير النشطة. (ب) بعد التعزيز الأولي في الضغط على الرافعة في اليوم 1 من الانقراض ، تقلل الحيوانات من الاستجابة على كل من الرافعات النشطة وغير النشطة إلى مستوى منخفض ومستقر. أشرطة الخطأ ، تعني ±SEM. تم تعديل هذا الرقم من Rich et al. 20194. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: في الجسم الحي البصريات LTD يخفف من الاستعادة التي يسببها جديلة. (أ) يتسبب Optical LTD في انخفاض كبير في مكابس الرافعة النشطة أثناء إعادة الوضع إلى ما كان عليه بالنسبة للحيوانات التي تلقت فيروس التحكم أو تحفيز التحكم في SHAM. ANOVA ثنائي الاتجاه ، التأثير الرئيسي للمجموعة (F (2,27) = 7.04 ، P = . 004) وتفاعل المجموعة في اليوم x (F (2,27) = 8.08 ، P = .002) ؛ تحليل بونفيروني اللاحق: ***p < .001. (ب) بعد 7 أيام ، خضعت الفئران لاختبار إعادة ثان ، مما كشف عن انخفاض كبير في ضغط الرافعة النشط في الحيوانات التي خضعت سابقا ل MGN-LA LTD بالنسبة لضوابط SHAM. ANOVA ثنائي الاتجاه ، التأثير الرئيسي للمجموعة (F (1،32) = 5.04 ، P = .032) ، تفاعل معنوي (F (1،32) = 7.69 ، P = .009) ؛ تحليل بونفيروني اللاحق ، ** p < .01. أشرطة الخطأ ، تعني ±SEM ، n في الأشرطة ، عدد الفئران. تم تعديل هذا الرقم من Rich et al. 20194. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: التحقق الوظيفي من التحفيز البصري الوراثي منخفض التردد في الجسم الحي (A) في نصف الكرة الأرضية المزدوج في الجسم الحي LTD من نقاط الاشتباك العصبي MGN-LA يخفف من سعة EPSC بالنسبة إلى عناصر التحكم الشامية (اختبار t غير المزاوج ، t (10) = 2.73 ، * P = .021). أقحم: متوسط آثار EPSC للعينة التي تم استثارتها عند Erev-70 mV. قضبان المقياس: 50 مللي ثانية ، 200 pA ، n في القضبان ، عدد الفئران (الخلايا العصبية). (ب) في الجسم الحي الحث البصري LTD يسد خارج الجسم الحي LTD. بعد 24 ساعة من الحث في الجسم الحي LTD ، تم تحضير شرائح اللوزة وتم تطبيق نفس بروتوكول التحفيز. تم تقليل منحدر ارتفاع EPSP في محطات MGN-LA عن طريق التحفيز البصري خارج الجسم الحي في الخلايا العصبية من الحيوانات التي تلقت تحفيز SHAM في الجسم الحي ، ولكن ليس في الخلايا العصبية من الحيوانات التي تلقت في الجسم الحي البصرية LTD. n بخط مائل ، عدد الخلايا العصبية. (ج) عينة من تسجيلات المشبك الحالية من الخلايا العصبية MGN المصابة ب AAV-oChIEF. تم استنباط إمكانات الفعل عن طريق تحفيز الضوء الأزرق (5-100 هرتز). قضبان الميزان: 100 مللي ثانية ، 40 مللي فولت. أشرطة الخطأ ، تعني ±SEM. تم تعديل هذا الرقم من Rich et al. 20194. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التحقق النسيجي من التعبير الفيروسي ومواضع الألياف البصرية. (أ ) صور مجهرية تمثيلية تظهر تعبير DAPI و AAV-oChIEF-tdTomato في LA (يسار) و MGN (يمين). شريط المقياس: 2 مم. ( B ) رسم تخطيطي يوضح حقن AAV-oChIEF-tdTomato وفي جميع أنحاء المدى الأمامي الخلفي ل LA (يسار) و MGN (يمين) ، ومواضع الألياف البصرية في لوس أنجلوس. يظهر التظليل الأحمر الداكن تمثيل أصغر انتشار مقبول للفيروس، ويظهر التظليل الوردي الفاتح تمثيل أكبر انتشار مقبول. تتوافق الدوائر الزرقاء مع وضع الألياف البصرية الناجح في نصفي الكرة الأرضية. تتوافق الدوائر السوداء مع وضع الألياف البصرية الناجح في نصف الكرة الأرضية واحد فقط. الأسود "X" يتوافق مع وضع الألياف غير الناجحة. ليتم تضمينها في التحليل النهائي ، تتطلب الفئران تعبيرا فيروسيا في نصف الكرة المزدوج في لوس أنجلوس بالإضافة إلى وضع الألياف بنجاح. الإحداثيات بالملليمتر ، الخلفي من بريغما. تم تعديل هذا الرقم من Rich et al. 20194. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| كيميائي | المليمتر | ميغاواط | جم / 1000 مل |
| N-ميثيل-د-جلوكامين | 92 | 195.215 | 17.96 |
| كلوريد البوتاسيوم | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| بيكربونات الصوديوم | 30 | 84.01 | 2.52 |
| هيبس | 20 | 238.301 | 4.77 |
| د-الجلوكوز | 25 | 180.16 | 4.5 |
| أسكوربات الصوديوم | 5 | 198.11 | 0.99 |
| ثيوريا | 2 | 76.12 | 0.15 |
| بيروفات الصوديوم | 3 | 110 | 0.33 |
| كبريتات المغنيسيوم | 10 | استخدم 5.0 مل من مخزون 2.0 M | |
| كلوريد الكالسيوم | 0.5 | استخدم 250 ميكرولتر من مخزون 2.0 م | |
| 1. للحصول على 1 لتر من المحلول ، أضف الأملاح بالترتيب المدرج في 850 مل ddH2O | |||
| 2. درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك المركز إلى 7.3-7.4 (NMDG يجعل الحل الأساسي) | |||
| 3. أكسجين لمدة 5-10 دقائق ثم أضف MgSO4 و CaCl2 | |||
| 4. أحضر volutme النهائي إلى 1 لتر مع ddH2O وتحقق مرة أخرى من الرقم الهيدروجيني النهائي | |||
| 5. تحقق من الأسمولية باستخدام مقياس الأسمومتر واضبط على 300-310 مللي أوزم / كجم H2O | |||
الجدول 1: قائمة مكونات محلول القطع خارج الخلية. المكونات والتعليمات المستخدمة لإعداد محلول القطع خارج الخلية القائم على NMDG.
| كيميائي | المليمتر | ميغاواط | جم / 1000 مل |
| N-ميثيل-د-جلوكامين | 86 | 195.215 | 5.03 |
| كلوريد البوتاسيوم | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| بيكربونات الصوديوم | 35 | 84.01 | 2.94 |
| هيبس | 20 | 238.301 | 4.77 |
| د-الجلوكوز | 25 | 180.16 | 4.5 |
| أسكوربات الصوديوم | 5 | 198.11 | 0.99 |
| ثيوريا | 2 | 76.12 | 0.15 |
| بيروفات الصوديوم | 3 | 110 | 0.33 |
| كبريتات المغنيسيوم | 1 | استخدم 500 ميكرولتر من مخزون 2.0 مليون | |
| كلوريد الكالسيوم | 2 | استخدم 1000 ميكرولتر من مخزون 2.0 مليون | |
| 1. للحصول على 1 لتر من المحلول ، أضف الأملاح بالترتيب المدرج في 850 مل ddH2O | |||
| 2. درجة الحموضة مع 1 N حمض الهيدروكلوريك أو KOH إلى 7.3-7.4 | |||
| 3. أكسجين لمدة 5-10 دقائق ثم أضف MgSO4 و CaCl2 | |||
| 4. أحضر volutme النهائي إلى 1 لتر مع ddH2O وتحقق مرة أخرى من الرقم الهيدروجيني النهائي | |||
| 5. تحقق من الأسمولية باستخدام مقياس الأسمومتر واضبط على 300-310 مللي أوزم / كجم H2O | |||
الجدول 2: قائمة مكونات محلول الاحتفاظ خارج الخلية. المكونات والتعليمات المستخدمة لإعداد محلول عقد خارج الخلية.
| كيميائي | المليمتر | ميغاواط | جم / 1000 مل |
| N-ميثيل-د-جلوكامين | 119 | 195.215 | 6.95 |
| كلوريد البوتاسيوم | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| بيكربونات الصوديوم | 26 | 84.01 | 2.18 |
| هيبس | 5 | 238.301 | 1.19 |
| د-الجلوكوز | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| كبريتات المغنيسيوم | 1 | استخدم 500 ميكرولتر من مخزون 2.0 مليون | |
| كلوريد الكالسيوم | 2 | استخدم 1000 ميكرولتر من مخزون 2.0 مليون | |
| 1. للحصول على 1 لتر من المحلول ، أضف الأملاح بالترتيب المدرج في 850 مل ddH2O | |||
| 2. درجة الحموضة مع 1 N حمض الهيدروكلوريك أو KOH إلى 7.3-7.4 | |||
| 3. أكسجين لمدة 5-10 دقائق ثم أضف MgSO4 و CaCl2 | |||
| 4. أحضر volutme النهائي إلى 1 لتر مع ddH2O وتحقق مرة أخرى من الرقم الهيدروجيني النهائي | |||
| 5. تحقق من الأسمولية باستخدام مقياس الأسمومتر واضبط على 300-310 مللي أوزم / كجم H2O | |||
الجدول 3: قائمة مكونات محلول التسجيل خارج الخلية. المكونات والتعليمات المستخدمة لإعداد حل التسجيل خارج الخلية.
| كيميائي | المليمتر | ميغاواط | ملغم / 50 مل |
| سيزيوم ميثان سلفونات | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| كلوريد السيزيوم | 15 | 168.36 | 126.3 |
| السيزيوم-EGTA | 0.4 | أضف 80 ميكرولتر من 250 مللي متر Cs-EGTA | |
| كلوريد الشاي | 5 | 165.705 | 41.4 |
| هيبس | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-Br | 1 | 343.31 | 17.2 |
| إل-جلوتاثيون | 1 | 307.323 | 15.4 |
| فوسفوكرياتين الصوديوم | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| ملغ-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. ابدأ ب 40-45 مل HPLC-grade H2O | |||
| 2. حافظ على الفوسفوكرياتين و ATP و GTP على الجليد في جميع الأوقات. | |||
| 3. أضف المكونات بالترتيب المدرج في الجدول | |||
| 4. الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 مع CsOH (حوالي 200 ميكرولتر من 2 M CsOH) | |||
| 5. استخدام الأسمولية للتحقق من الأسمولية. | |||
| 6. أضف H2O من الدرجة HPLC إلى الأسمولية النهائية بحوالي 285-290 مللي أسمتر / كجم H2O | |||
| 7. تحضير 500-1000 ميكرولتر من القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية | |||
الجدول 4: قائمة مكونات محلول الفيزيولوجيا الكهربية داخل الخلايا الميثان سلفونات السيزيوم. المكونات والتعليمات المستخدمة لإعداد محلول السيزيوم ميثان سلفونات داخل الخلايا.
| كيميائي | المليمتر | ميغاواط | ملغم / 50 مل |
| غلوكونات البوتاسيوم | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| كلوريد البوتاسيوم | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| كلوريد الصوديوم | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| ك-بابتا | 0.1 | أضف 80 ميكرولتر من K-BAPTA | |
| هيبس | 10 | 238.301 | 119.2 |
| إل-جلوتاثيون | 1 | 307.323 | 15.4 |
| فوسفوكرياتين الصوديوم | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| ملغ-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| تريس جي تي بي | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. ابدأ ب 40-45 مل HPLC-grade H2O | |||
| 2. حافظ على الفوسفوكرياتين و ATP و GTP على الجليد في جميع الأوقات. | |||
| 3. أضف المكونات بالترتيب المدرج في الجدول | |||
| 4. درجة الحموضة إلى 7.3 مع KOH (حوالي 200 ميكرولتر من 2 M KOH) | |||
| 5. استخدام الأسمولية للتحقق من الأسمولية. | |||
| 6. أضف H2O من الدرجة HPLC إلى الأسمولية النهائية بحوالي 285-290 مللي أسمتر / كجم H2O | |||
| 7. تحضير 500-1000 ميكرولتر من القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية | |||
الجدول 5: قائمة مكونات محلول الفيزيولوجيا الكهربية داخل الخلايا غلوكونات البوتاسيوم. المكونات والتعليمات المستخدمة لإعداد محلول غلوكونات البوتاسيوم داخل الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما هو موضح أعلاه ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة المهمة لتحقيق النتائج التجريبية المناسبة. من المحتمل أن يكون البروتوكول فعالا فقط في الحيوانات التي تحصل على الإدارة الذاتية للكوكايين بشكل صحيح ، وحتى الآن ، تم اختباره فقط باستخدام المعلمات الموضحة أعلاه. من الممكن تعديل جرعة الكوكايين وجدول التعزيز ومعلمات الإشارات مع تأثير ضئيل على النتائج السلوكية ، باستثناء أن جدول التعزيز من الدرجة الثانية قد يؤدي إلى البحث عن الكوكايين المستقل عن اللوزة الدماغية والذي يمكن أن يقلل من فعالية الإجراء ، على الرغم من أن هذا لم يتم اختباره مباشرة14 . هناك عدة نقاط في جميع أنحاء البروتوكول حيث سيساعد التحقق من صحة البناء السليم وعمل الألياف البصرية على ضمان التحفيز البصري الناجح. من الضروري تسجيل الحلقات بشكل صحيح لمنع الخسارة من غطاء الرأس ، وتلميع الألياف البصرية ، واختبار أن فقدان ناتج الضوء من خلال الغرسات لا يتجاوز 30٪ 9. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر معلمات التحفيز بالليزر من الاعتبارات المهمة. يجب تشغيل الليزر بطاقة منخفضة نسبيا (5-7 ميغاواط). يتم استخدام التحفيز المستمر منخفض التردد للحث على LTD ، ويمكن التحقق من صحة ذلك وظيفيا عن طريق قياس قوة متشابك MGN-LA باستخدام تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية. أخيرا ، أشارت النتائج إلى انخفاض كبير في الإعادة المستحثة بالإشارة مع n النهائي من 10 لكل مجموعة ، ومع ذلك ، يجب على المجربين توقع البدء ب n أكبر ، حيث من المحتمل أن تحتاج بعض الحيوانات إلى استبعادها من التحليل النهائي. من الأهمية بمكان التحقق من الموضع التشريحي الصحيح والتعبير عن الفيروسات والألياف الضوئية ، واستخدام البيانات فقط من الحيوانات التي تم التحقق من الأنسجة فيها.
على الرغم من التأثير السلوكي القوي على البحث عن الكوكايين الذي لوحظ مع هذا البروتوكول ، إلا أن هناك العديد من القيود التي يجب مراعاتها. أولا ، تم اختبار الطريقة فقط في الفئران التي تم تدريبها باستخدام إشارة سمعية بصرية واحدة مقترنة بالكوكايين. ليس من الواضح ما الذي سيحدث في سيناريو يتم فيه تكييف إشارات مختلفة متعددة ، والتي ستكون تمثيلا أكثر دقة للإدمان البشري ، حيث تصبح المحفزات البيئية المتعددة مرتبطة ارتباطا وثيقا بتعاطي المخدرات15،16،17. تشير الأدلة من مختبرنا إلى أن قدرة OPTOGENETIC LTD على الحد من البحث عن الأدوية ترجع إلى انخفاض في قوة المشبكي الذي يضعف الذكريات المرتبطة بالأدوية. ومع ذلك ، ليس من الواضح إلى أي مدى قد تتأثر الحيادية ، أو الذكريات غير المرتبطة بالإدارة الذاتية للكوكايين بهذا البروتوكول. علاوة على ذلك ، في حين أن الطريقة تؤثر فقط على القوة المشبكية في دائرة واحدة ، فقد تكون الدوائر الأخرى مهمة أيضا لتشفير الذاكرة و / أو قيادة سلوك البحث عن الكوكايين18،19،20. أخيرا ، تجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن تحفيز LTD إلا في نقاط الاشتباك العصبي حيث يتم التعبير عن الفيروس بشكل كاف ، ومن المحتمل أن يترك بعض الاتصالات المشبكية غير متأثرة ببروتوكول التحفيز ، مما قد يحد من التأثير السلوكي. علاوة على ذلك ، تشير الأدلة إلى أن مجموعات صغيرة فقط من الخلايا العصبية ونقاط الاشتباك العصبي تشارك في تشفير ذاكرة معينة ، مما يعطي مصداقية لفكرة أن تحريض LTD داخل منطقة الدماغ بأكملها ليس أفضل استراتيجية لإحداث تغيير سلوكي ، في حين توجد طرق أخرى لاستهداف مجموعات الخلايا العصبية النشطة في السياق أو سياقيا على وجه التحديد21 ، 22. على الرغم من ذلك ، فإن البروتوكول فعال في تخفيف البحث عن المخدرات بدافع جديلة ، على الأرجح لأن التحفيز البصري منخفض التردد يحد من تحريض LTD إلى نقاط الاشتباك العصبي التي تم تعزيزها سابقا عن طريق أزواج الكوكايين المتكررة4.
يوفر هذا البروتوكول تقدما كبيرا في الدراسات السلوكية البصرية الوراثية الأكثر استخداما حيث يتم تنشيط نشاط الخلايا العصبية أو تثبيطه أثناء قيام الحيوان بالسلوك في الوقت الفعلي19,23. بدلا من ذلك ، يتم استخدام علم البصريات الوراثي هنا كأداة عصبية لعكس اللدونة التي يسببها الكوكايين. ميزة هذه الطريقة هي أن التلاعب البصري الجيني مستقل عن الاختبار السلوكي ، مثل التأثيرات المربكة المحتملة لعلم البصريات الوراثي (على سبيل المثال ، تأثيرات الدائرة المحلية ، وفترة المقاومة بعد التحفيز الضوئي ، وتأثيرات التحفيز المضاد للدرومية ، إلخ. 24 لا ينبغي أن تؤثر على النتائج ، وبالتالي زيادة الثقة في أن الآلية العصبية المفترضة تتوسط في التغييرات في السلوك. لذلك يمكن استخدام هذه الطريقة في عدد من التطبيقات التي تبحث في كيفية ارتباط اللدونة المشبكية ، وخاصة زيادة القوة المشبكية كما يحدث مع LTP ، بالتغيرات في السلوك. قد تكون الأساليب المماثلة ذات صلة أيضا بالتطبيق السريري لتقنيات التحفيز العصبي حيث يمكن تقليل تنظيم الاتصالات غير الطبيعية في الدماغ التي تقود السلوك المختل. وبالمثل ، نظرا لأن البنية الفيروسية oChIEF تستجيب لكل من المحفزات منخفضة وعالية التردد ، فهناك تطبيقات محتملة لهذه الطرق خارج نطاق التجارب الموصوفة. على سبيل المثال ، قد يكون LTP المستحث بصريا مفيدا لعكس العجز في اللدونة الموجودة في مجموعة واسعة من الاضطرابات التنكسية العصبية والنمو العصبي25. علاوة على ذلك ، تم أيضا ربط اللدونة ثنائية الاتجاه في نقاط الاشتباك العصبي MGN-LA ارتباطا مباشرا بتنظيم السلوكيات ذات الصلة بالاضطرابات المرتبطة بالخوف8.
يعد تعديل الدوائر العصبية المحددة التي تدعم السلوكيات التي تحركها المخدرات أمرا ضروريا لإثبات الامتناع عن تعاطي المخدرات على المدى الطويل. يستخدم هذا البروتوكول تطورات جديدة في علم البصريات الوراثي في الجسم الحي لعكس مرونة الدائرة العصبية الدقيقة التي يتم تعزيزها من خلال الإدارة الذاتية المتكررة للكوكايين في وجود إشارات بيئية. نتيجة هذا التعديل العصبي المحدد هو انخفاض احتمال إعادة التعرض للإشارات اللاحقة لتحفيز استجابة البحث عن الكوكايين ، والتي قد يكون لها آثار مهمة على تطوير العلاجات المستقبلية لاضطرابات تعاطي المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء للإفصاح عنه.
Acknowledgments
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من منح USPHS K01DA031745 (MMT) و R01DA042029 (MMT) و DA035805 (YHH) و F31DA039646 (MTR) و T32031111 (MTR) ووزارة الصحة في ولاية بنسلفانيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
