Summary
本プロトコルは、電気生理学的研究に適した、成体、幼若、幼虫、および胚性ゼブラフィッシュ(Danio rerio)からの生存可能な心臓および血管平滑筋細胞の急性単離を記載している。
Abstract
ゼブラフィッシュは、心臓血管研究におけるモデル脊椎動物生物として長い間使用されてきました。ゼブラフィッシュの心血管組織から個々の細胞を単離することの技術的困難は、それらの電気生理学的特性を研究する上で制限されてきた。ゼブラフィッシュ心臓の解剖および心室心筋細胞の単離については、以前の方法が記載されている。しかしながら、電気生理学的特性評価のためのゼブラフィッシュ心房および血管筋細胞の単離は詳述されていなかった。この研究では、パッチクランプ実験に適した、単離された幼体および成体のゼブラフィッシュの心室および心房心筋細胞、ならびに球根状動脈からの血管平滑筋(VSM)細胞を日常的に提供する新規および修正された酵素プロトコルについて説明します。発生の胚および幼虫段階で分離されたゼブラフィッシュの心血管組織に関する電気生理学的研究の文献的証拠はありません。幼虫および胚の心臓からの個々の細胞に対するパッチクランプ実験を可能にする部分解離技術が実証されています。
Introduction
ゼブラフィッシュは小型硬骨魚類であり、長い間モデル脊椎動物として使用されてきました1、そして最近、遺伝子や薬物のハイスループットスクリーニングのための実行可能な脊椎動物システムとして目立つようになりました2,3。しかし、ゼブラフィッシュ組織の生理学的分析は十分に発達していません。心血管系では、ゼブラフィッシュ心臓4の解剖および心室心筋細胞5,6,7の単離のための方法が記載されている。心房筋細胞の効果的な単離に関する詳細な説明はほとんどなく、パッチクランプ研究のための血管平滑筋(VSM)製剤の報告もありません。.
現在の研究では、電気生理学的および機能的研究に実行可能なゼブラフィッシュの心臓および血管筋細胞の単離のための方法論について説明しています。このアプローチには、ゼブラフィッシュ心室筋細胞単離のための以前に報告されたプロトコルの変更が含まれ5,6、哺乳類VSM細胞分離8からの方法を適応させ、球根状動脈(BA)からのゼブラフィッシュ血管平滑筋細胞の単離を可能にします。このプロトコルにより、ゼブラフィッシュから単離された心房、心室、およびVSM細胞を効率的に取得でき、パッチクランプ試験で最大8時間9確実に使用できます。
完全に親生物の外で発達するほぼ透明な幼虫にもかかわらず、心血管発達の研究における有望な個体発生の可能性を探求することは、若い年齢で組織を抽出し分析する際の課題によって制限されてきました。現在の記事では、適応された公開された抽出方法10を使用して、受精後3日(dpf)に分離されたゼブラフィッシュの心臓のパッチクランプ実験を実証することにより、この制限に対処します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべてのゼブラフィッシュ(野生型AB株、オスとメスの両方)は、ワシントン大学施設動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って、実験のために飼育、維持、および取り扱われました。
1.成体、幼体、および仔魚のゼブラフィッシュからの心房、心室、および球根動脈の分離
- コールドショック、すなわち4°Cの水に浸して~10秒間魚を安楽死させます。
- 湾曲した鉗子を使用して、灌流バッファー(PB)(表1)を部分的に満たした大きなペトリ皿に魚を移し、解剖顕微鏡の下に置きます。
- はさみを使って、目のすぐ後ろの魚を斬首します。
- 湾曲した鉗子(仔魚用の細かい鉗子)を使用して、腹側を解剖スコープに向けて、魚を利き手ではない手で保持します。利き手の2組目の細鉗子(または仔魚の場合は極細鉗子)で、胸筋とひれをそっと引き裂いて、心血管(CV)組織(心房、心室、球根動脈、BA)を明らかにします(図1)。
- 細かい鉗子を利き手に置き、BAと腹側大動脈の交差する先端でBAをそっと引っ張ります。
注:BAと心臓は体腔から出てきます。- 鉗子をつまみ、複数の静脈枝が収束する心房の先端(洞静脈)を見つけて、BAを大動脈から慎重に分離します。細かい鉗子を使用して、副鼻腔静脈から心房の先端を「引き抜く」。これにより、CV組織が体の他の部分から分離されます(図1)。
2. 電気生理学的研究のための成体・幼体・仔魚ゼブラフィッシュの心筋細胞の解離
- 細かい鉗子を使用して、前のステップで分離されたCV組織から心房と心室を「引き抜く」。
注:このプロセスにより、相互汚染を最小限に抑えて各組織のきれいな解剖が可能になり、木から果物を摘むのに似ています。- 細かい鉗子を使用して心室に穏やかな裂け目を作り、心臓組織が真っ赤から淡いサーモン色に変わったときに確実にできる余分な血液を排出します。
- 単離された心房と心室を、灌流バッファー(PB; 1.5 mL)を含む別々の1.5 mL遠心チューブにプールします。
注:成体のゼブラフィッシュ心房心筋細胞(ACM)と心室心筋細胞(VCM)の解離を成功させるには、通常、4つの心房と3つの心室が必要です。幼若ゼブラフィッシュ(28〜90日)の場合、この数は2倍になります。- ゼブラフィッシュ仔魚の場合(14-28日)、~30匹の幼虫からできるだけ多くの組織を採取する。
- チューブ内のPBをそれぞれ750 μLの消化バッファー(DB)(表1)と交換し、チューブを37°Cおよび800rpmのサーモシェーカーに置きます。組織が半透明になるまで消化します(心房の場合は~30分、心室の場合は~40分)。
- ベンチトップミニ遠心分離機(周囲温度で2,000 x g )で組織を3〜5秒間静かに回転させて消化を終了し、上清DBをそれぞれ750 μLの停止バッファー(SB)と交換します(表1)。
注:この遠心分離ステップは、VCM分離ではオプションです。 - ペレット化した組織をSB中で周囲温度で15分間インキュベートします。
- SBをそれぞれ500〜750 μLのPBと穏やかに交換し(最終細胞の希望する密度に応じて)、火炎研磨されたパスツールピペットを使用して組織を粉砕(~30回)して細胞を分散させます。
注:心筋細胞(CM)は電気生理学的研究の準備が整い、室温で最大8時間保存されます。 - 均一なサンプリングを行うには、細胞を数回ゆっくりと上下にピペットで動かして再懸濁してから、対応する研究のために細胞を一滴加えます。
3. 電気生理学的研究のための成体および幼体ゼブラフィッシュの血管平滑筋(VSM)細胞の解離
- ステップ2.1と同じアプローチを使用してCV組織から球根状動脈症(BA)を摘み取り、5つの成人BAをS1バッファー(1.5 mL)を含む1.5 mL遠沈管にプールします(表2)。幼若ゼブラフィッシュの場合は10個のBAをプールし、2週間以上経過した幼虫の場合は30〜40個のBAをプールします。
注:2週間未満のゼブラフィッシュ幼虫からVSM細胞を単離することは実際には現実的ではありません。 - S1を400 μLのS2バッファー(表2)に置き換え、サーモシェーカーで37°C、800 rpmで~20分間、BAのパパイン( 材料表を参照)消化します。
- 部分的に消化されたBAを1分間落ち着かせ、上清S2をコラゲナーゼを含む500 μLのS3バッファー(表2)と交換します。組織をサーモシェーカーで37°C、800rpmで3〜5分間消化します。
- ベンチトップミニ遠心分離機(周囲温度で2,000 x g )で組織を3〜5秒間静かに回転させ、上清S3を500 μLのS1と交換して消化を終了します。
- ペレット化した組織を穏やかに粉砕し(~15回)、VSM細胞とプレートを適切なサイズのガラスカバースリップに分散させます。
注:カバーガラスのサイズは、パッチクランプ記録チャンバーのサイズによって決まります(この場合、5 x 5 mmが使用されました)。- カバーガラスを室温で30分間保持して、細胞が付着し、次の6時間以内に使用します。
4.電気生理学的研究のための胚性ゼブラフィッシュからの心臓の分離
- トリカイン(150 mg/L、100 mm x 20 mmペトリ皿あたり1 ml)を、インキュベーション条件から採取した~300個の胚(2-5 dpf)に加えます(図2A)。
- 麻酔をかけた胚をトランスファーピペットを使用して5 mL遠沈管に移し、遠沈管から余分な培地(E3)を除去して濃縮します(図2B)。
- 胚を3 mLの冷灌流バッファー(PB)で2回洗浄し、2 mLのPBに再懸濁します(図2B)。
- 胚性心臓隔離装置(図2C)を使用して、~1 mLの胚を注射針に引き込み、すぐにチューブに戻します。このプロセスをシリンジの動きごとに1秒の割合で30回繰り返します(図2C)。
- 断片化した胚を漏斗に入れた100 μmの細胞ストレーナーふるいに通し、ろ過した心臓を別の5 mL遠沈管に集めます。シリンジを1 mLのPBですすぎ、このリンスもふるいを通してチューブに集めます(図2C)。
- よく混合して1.5 mLの遠沈管に分離し、各チューブに1 mLの内容物を入れます。ベンチトップミニ遠心分離機ですべてのチューブを5秒間遠心分離し(周囲温度で2,000 x g )、上清を廃棄します。
- 1mLのPBを使用してチューブ内のペレットの連続再懸濁を実行する、すなわち、1mLのPBを使用してペレットを1つのチューブに再懸濁し、その再懸濁されたPBを使用してペレットを次のチューブに再懸濁する。
- 心臓を2回ゆっくりと上下にピペットで留めてから、対応する研究のために心臓を一滴加えます。
5. 単離された心血管細胞のパッチクランプ研究
注:単離された細胞からの裏返しおよび全細胞パッチクランプの記録は、ゼブラフィッシュ心血管系9のKATPチャネル電流について以前に報告されたように取得できます。
- 成体および若年性心筋細胞の場合、解離した細胞(ステップ2から)を懸濁液から直接記録チャンバーに追加します。VSMセルの場合は、メッキされたVSMセル(ステップ3から)を含むカバーガラスを記録チャンバーに入れます。
- 単離された無傷の胚性心臓(ステップ4から)を懸濁液からチャンバーに追加し、心外膜筋細胞からパッチクランプ記録を行います(図2D)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
上記のプロトコルは、野生型および変異ゼブラフィッシュの心血管系におけるATP感受性カリウム(KATP)チャネルの広範な研究で最近報告されたように、パッチクランプ研究に適した一貫した品質の十分な心臓および血管筋細胞を確実かつ日常的に提供します9。単離された心筋細胞からのこのようなKATPチャネル活性の記録の代表的な痕跡を図3A〜Cに示す。球根状動脈から単離された細胞の場合、血管平滑筋細胞はTg(tagln:egfp)式11,12によって確認された(図1)。胚の心臓から摘出したパッチで成功したシングルチャンネル記録(N = 5調製物からn = 8記録)が得られた(図3D)。活動電位は、単離された成体のゼブラフィッシュの心室筋細胞および心房筋細胞から、パッチクランプアンプと互換性のあるデジタイザーを使用して、全細胞の電流クランプモードで記録されました(材料の表を参照)。活動電位(AP)測定用の細胞外記録溶液は、NaCl(140mM)、KCl(4mM)、CaCl2(1.8mM)、MgCl2(1mM)、グルコース(10mM)、HEPES(10mM)、およびブレビスタチン(0.01mM、pH 7.4)を含んでいた。細胞内記録溶液は、KCl(120mM)、EGTA(5mM)、K2ATP(5mM)、MgCl2(5mM)、およびHEPES(10mM、pH7.2)を含んでいた。パッチピペットはソーダライムガラスから引き出され、細胞内溶液で満たされたときに3〜5MΩの抵抗を示した。心室筋細胞は安定した過分極膜電位を示し、活動電位はパッチピペットを介した電流注入によって刺激されましたが(図3E)、心房筋細胞は自発的な活動電位発火を示しました(図3F)。活動電位特性を表3にまとめた。
図1:心房、心室、および球根動脈細胞の分離。 心房(A)、心室(B)、および球根状動脈(C)細胞の単離を説明するための概略図。各単離された細胞タイプ(下)を描いた画像には、それぞれの場合にスケールバー= 50μmがあります。平滑筋細胞トランスジェニックレポーターゼブラフィッシュ株(Tg(tagln:egfp)11,12)から単離されたBA細胞は、緑色蛍光に対して陽性である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:胚性心臓の単離を説明するための概略図。 (A)受精胚を飼育槽から取り出し、E3水を入れたシャーレに入れ、28°Cで最長5日間維持する。(B)所望の年齢で、胚をトリカインを用いて その場 で麻酔し、解離のために5mL遠沈管内のPBに移す。(C)胚性心臓隔離装置は、ベンチスタンドの解離チューブの上に取り付けられた19G針に取り付けられた10mLシリンジで構成され、手で粉砕を行うことができます。(D)パッチクランプピペットに取り付けられた孤立した心臓(4日目)の画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単離されたゼブラフィッシュの心血管組織からの代表的なパッチクランプ記録。 (A、B)成体ゼブラフィッシュから単離された心房(A)および心室(B)心筋細胞の裏返し切除パッチクランプ記録からのATP感受性KATPチャネル。(C)成体ゼブラフィッシュから単離したVSM細胞の全細胞パッチクランプからKATPチャネルコンダクタンスを記録した。(D)ゼブラフィッシュ胚性心臓から摘出した膜パッチにおける単一K+チャネル活性(4 dpf)。すべての切除パッチ記録は、膜の両側に140 mM KCl、-50 mVの膜電位で行われました。全セル電流は、膜電位を-70mVにクランプして記録しました。(E)単離された心室筋細胞からの電流クランプ記録の例。活動電位は、以下に示すように電流注入によって刺激されました。(f)自発的な活動電位発火を示す単離された心房筋細胞からの電流クランプ記録の例。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 灌流バッファー(PB) | 10 mM HEPES、30 mM タウリン、5.5 mM グルコース、10 mM BDM。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で溶液を作り、pHを7.4に調整します | ||
| 消化バッファー(DB) | PB + 12.5 μM CaCl2 + 5 mg/mL コルII + 5 mg/mL コルIV + 5 ng/mL インスリン | ||
| バッファーの停止 (SB) | PB + 10% FBS + 12.5 μM CaCl2 + 10 mg/ml BSA + 5 ng/mL インスリン | ||
表1:ゼブラフィッシュ心筋細胞の単離のための溶液。
| S1 バッファ | 0.1% BSA (w/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM グルコース, 0.05 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaOH を用いてpH 7.4に調整 | ||
| S2 バッファ | 2 mL S1、4 mgパパイン、2 mg DTT | ||
| S3 バッファ | 2 mL S1、3 mgコラゲナーゼタイプH、2 mgトリプシン阻害剤、1 mgエラスターゼ | ||
表2:ゼブラフィッシュVSM細胞の単離のための溶液。
| 心室筋細胞(n = 3記録) | |||
| Vm (mV) | アパ (mV) | APD50 (ミリ秒) | |
| △75.7 ± 3.9 | △119.6 ± 3.8 | 329 ± 163 | |
| 心房筋細胞(n = 3記録) | |||
| AP レート(最小 1) | MDP (mV) | アパ (mV) | APD50 (ミリ秒) |
| 107.3 ± 32.6 | △71.2 ± 5.1 | 98.4±4.7 | 141 ± 12 |
表3:単離されたゼブラフィッシュ心筋細胞からの活動電位特性。電流クランプモードで記録されます。データは平均±S.D. Vm =膜電位として示されます。APA =活動電位振幅;APD50 =50%の再分極までの活動電位の持続時間。MDP =最大拡張期電位。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ゼブラフィッシュ心室筋細胞を単離する以前の方法5,6は、培養または電気生理学的研究のために筋細胞を生成することを目的としており、より低い収量の細胞を提供し、細胞の品質および生存率に悪影響を及ぼす複数回の遠心分離の長いステップを伴った。ここで説明するプロトコルは信頼性が高く、重要な心血管組織(心室、心房、およびVSM)のそれぞれをカバーし、重要なことに、生細胞の急性単離に非常に実用的です。BA13を介した心室のカニューレ挿入を含む分離アプローチは、心室心筋細胞の洗練された代替手段になる可能性がありますが、より高い器用さが必要であり、心房隔離に悪影響を与える可能性があります。現在のプロトコルに詳述されているアプローチは、シンプルで効率的な代替手段を提供します。
幼虫の心臓組織分離に関する追加の考慮事項は次のとおりです:(1)ステップ1.4では、魚の年齢と利用可能な倍率に応じて、胸筋を取り除く前でも組織が見える場合があり、その場合、組織は事前の手術なしで魚から直接「引き抜く」ことができ、その後、超微細鉗子を使用して非CV組織を取り除くことができます。(2)ステップ2.2では、14日未満の幼虫の場合、酵素解離を必要とせずに心臓を直接電気生理学的研究に使用できます。
上記のように、そして一般的に酵素解離法に典型的に当てはまるが、毎回新鮮な緩衝液および酵素を使用することが重要であることが証明されている。ただし、灌流バッファー(PB)とS1バッファーは事前に準備し、4〜8°Cで1か月間保存できます。
成功した組織分離時間は、魚あたり~90秒を超えてはならず、組織は空気にさらされてはなりません。解離に時間がかかると、細胞の質(すなわち生存率)が低下する。組織を粉砕するときは、気泡が発生しないように注意する必要があります。VSM細胞単離は、S3バッファー中のコラゲナーゼによる消化に敏感です。消化の最初の3分後、チューブを毎分サーモシェーカーから取り出し、浮遊拡張および半透明の組織について検査する必要があります。組織の断片化が明らかになったら、消化ステップを中止する必要があります。
これらのプロトコルは、収縮性研究に必要なカルシウム耐性心筋細胞の単離に広く最適化されていないことに注意することが重要です。しかしながら、図示されるように、心筋細胞活動電位の信頼性の高い記録は、生理的細胞外カルシウム濃度7、14の存在下で達成され得る。興奮および収縮を分離し、これらの実験においてギガオームシール形成および記録効率を改善するために含まれるブレビスタチンは、無傷のゼブラフィッシュ心臓におけるAPパラメータに有意に影響しないことが以前に示されている14。電気生理学では、細胞の絶対収量も日常的に律速ではありません。このプロトコルは、単離された細胞の生化学的研究に必要な場合のように、収量に対して最適化されていません。それでも、これらの方法で達成される収率は、電気生理学的研究およびおそらく他の複数のアプローチに非常に適しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
この作業は、NIHがCGNにHL140024を、CMCにHL150277を付与したことで支援されました。図 1 と図 2 は BioRender.com を使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
