Summary
Настоящий протокол описывает острую изоляцию жизнеспособных сердечных и сосудистых гладкомышечных клеток от взрослых, ювенильных, личиночных и эмбриональных рыбок данио (Danio rerio), пригодных для электрофизиологических исследований.
Abstract
Рыбки данио уже давно используются в качестве модели организма позвоночных в сердечно-сосудистых исследованиях. Технические трудности выделения отдельных клеток из сердечно-сосудистых тканей рыбок данио ограничивают изучение их электрофизиологических свойств. Предыдущие методы были описаны для рассечения сердца рыбок данио и выделения желудочковых сердечных миоцитов. Однако выделение предсердных и сосудистых миоцитов рыбок данио для электрофизиологической характеристики не было подробно описано. В этой работе описываются новые и модифицированные ферментативные протоколы, которые обычно обеспечивают изолированные ювенильные и взрослые желудочковые и предсердные кардиомиоциты рыбок данио, а также сосудистые гладкомышечные клетки (VSM) из луковичного артериоза, подходящие для экспериментов с зажимом пластырей. Литературных свидетельств электрофизиологических исследований сердечно-сосудистых тканей рыбок данио, выделенных на эмбриональной и личиночной стадиях развития, не имеется. Продемонстрированы методы частичной диссоциации, позволяющие проводить эксперименты с зажимом пластыря на отдельных клетках личиночного и эмбрионального сердец.
Introduction
Рыбки данио - это небольшие телеостные рыбы, которые долгое время использовались в качестве модельного организма позвоночных1 и недавно приобрели известность как жизнеспособная система позвоночных для высокопроизводительного скрининга генов и лекарств 2,3. Однако физиологический анализ тканей рыбок данио развит недостаточно. В сердечно-сосудистой системе описаны методы рассечения сердца рыбок данио4 и выделения желудочковых сердечных миоцитов 5,6,7. Существует несколько подробных описаний эффективного выделения предсердных миоцитов и нет сообщений о препаратах гладкой мускулатуры сосудов (VSM) для исследований зажимов.
В настоящей работе описана методология выделения сердечных и сосудистых миоцитов рыбок данио, жизнеспособных для электрофизиологических и функциональных исследований. Этот подход включает модификации ранее сообщенных протоколов выделения желудочковых миоцитов рыбок данио 5,6 и адаптирует методы из изоляции клеток VSM млекопитающих8, что позволяет выделять сосудистые гладкомышечные клетки рыбок данио из луковичного артериоза (БА). Протоколы приводят к эффективному выходу изолированных предсердных, желудочковых и VSM клеток рыбок данио, которые могут быть надежно использованы в исследованиях зажимов в течение 8 ч9.
Несмотря на их почти прозрачные личинки, которые развиваются полностью вне родительского организма, изучение их обещанного онтогенетического потенциала в изучении сердечно-сосудистого развития было ограничено проблемами в извлечении и анализе тканей в молодом возрасте. В настоящей статье рассматривается это ограничение путем демонстрации экспериментов с зажимом патча на сердцах рыбок данио, изолированных уже через 3 дня после оплодотворения (dpf), с использованием адаптированного, опубликованного метода экстракции10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все рыбки данио (штамм дикого типа AB, как мужской, так и женский) были выращены, поддержаны и обработаны для экспериментов в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных Вашингтонского университета (IACUC).
1. Выделение предсердий, желудочков и луковичных артериозов от взрослых, молодых и личиночных рыбок данио
- Усыпляйте рыбу с помощью холодного шока, т.е. погружаясь в воду с температурой 4 °C, на ~10 с.
- Используя изогнутые щипцы, переложите рыбу в большую чашку Петри, частично заполненную перфузионным буфером (ПБ) (таблица 1) и поместите под рассекающий микроскоп.
- Обезглавить рыбу только сзади от глаз, используя ножницы.
- Используя изогнутые щипцы (тонкие щипцы для личинок рыб), держите рыбу в недоминирующей руке вентральной стороной, обращенной к рассечению. Со второй парой тонких щипцов (или сверхтонких для личинок рыб) в доминирующей руке осторожно разорвите грудные мышцы и плавники, чтобы выявить сердечно-сосудистые (CV) ткани (предсердие, желудочек и луковичный артериоз, BA) (Рисунок 1).
- Поместив тонкие щипцы в доминирующую руку, осторожно потяните БА на пересекающемся кончике БА и вентральной аорты.
ПРИМЕЧАНИЕ: БА и сердце выйдут из полости тела.- Осторожно отделите БА от аорты, защемляя щипцы и располагая кончик предсердий, в который сходятся несколько венозных ветвей (синусовый венозус). Используя тонкие щипцы, «выщипните» кончик предсердия с синусового веноза. Это изолирует сердечно-сосудистые ткани от остальной части тела (рисунок 1).
2. Диссоциация кардиомиоцитов от взрослых, молодых и личинок рыбок данио для электрофизиологических исследований
- Используя тонкие щипцы, «выщипните» предсердие и желудочек из сердечно-сосудистой ткани, выделенной на более ранней стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс позволяет проводить чистое рассечение каждой ткани с минимальным перекрестным загрязнением и ощущается сродни выщипыванию плодов с дерева.- Сделайте нежный разрыв в желудочек, используя тонкие щипцы, чтобы слить лишнюю кровь, что может быть обеспечено, когда сердечная ткань станет бледно-лососевого цвета из ярко-красного.
- Объедините изолированные предсердия и желудочек в отдельные центрифужные трубки объемом 1,5 мл, содержащие перфузионный буфер (ПБ; 1,5 мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать успешную диссоциацию взрослых предсердных кардиомиоцитов (ACM) и желудочковых кардиомиоцитов (VCM), обычно необходимы четыре предсердия и три желудочка. В случае с молодью рыбок данио (28-90 дней) это число удваивается.- В случае личинок рыбок данио (14-28 дней) соберите как можно больше ткани из ~30 личинок.
- Замените ПБ в трубках на 750 мкл буфера пищеварения (DB) (таблица 1) каждая и поместите трубки на термообвал при 37 °C и 800 об/мин. Позвольте пищеварению тканей до тех пор, пока они не станут полупрозрачными (~ 30 мин для предсердий и ~40 мин для желудочков).
- Завершите пищеварение, осторожно раскручивая ткани в настольной мини-центрифуге (2000 х г при температуре окружающей среды) в течение 3-5 с и замените надводный DB на 750 мкл стоп-буфера (SB) каждый (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап центрифугирования является дополнительным для изоляции VCM. - Инкубировать гранулированные ткани в СБ при температуре окружающей среды в течение 15 мин.
- Осторожно замените SB на 500-750 мкл ПБ каждый (в зависимости от желаемой плотности конечных клеток) и тритурируйте ткани (~ 30 раз), используя огнеполированную пипетку Пастера для диспергирования клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кардиомиоциты (КМ) теперь готовы к электрофизиологическим исследованиям и хранятся при комнатной температуре до 8 ч. - Для равномерного отбора проб осторожно пипеткой клетки вверх и вниз пару раз, чтобы повторно суспендировать, прежде чем добавлять каплю их для соответствующих исследований.
3. Диссоциация клеток гладких мышц сосудов (VSM) от взрослых и молодых рыбок данио для электрофизиологических исследований
- Выщипните луковичный артериоз (БА) из тканей CV, используя тот же подход, что и на этапе 2.1, и объедините пять взрослых БА в центрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую буфер S1 (1,5 мл) (таблица 2). В случае молоди рыбок данио пул десять БА, а для личинок старше 2 недель - 30-40 БА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Практически невозможно выделить клетки VSM из личинок рыбок данио моложе 2 недель. - Замените S1 на 400 мкл буфера S2 (таблица 2) и разрешите папаин (см. Таблицу материалов) переваривать БА на термообвале при 37 °C и 800 об/мин в течение ~20 мин.
- Дайте частично переваренным БА отстояться в течение 1 мин и замените супернатант S2 500 мкл буфера S3 (таблица 2), содержащего коллагеназу. Переваривайте ткани на термошейкере при 37 °C и 800 об/мин в течение 3-5 мин.
- Завершите пищеварение, осторожно раскрутив ткани в настольной мини-центрифуге (2000 х г при температуре окружающей среды) в течение 3-5 с и заменив супернатант S3 на 500 мкл S1.
- Аккуратно протрите гранулированные ткани (~15 раз), чтобы диспергировать клетки VSM и пластину на стеклянные крышки соответствующего размера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер крышки определяется размером камеры записи патч-зажима, в данном случае использовалось 5 х 5 мм).- Держите крышки при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы клетки прикрепились и использовали их в течение следующих 6 часов.
4. Выделение сердец от эмбриональных рыбок данио для электрофизиологических исследований
- Добавьте трикаин (150 мг/л; 1 мл на чашку Петри 100 мм х 20 мм) к ~300 эмбрионам (2-5 dpf), собранным из условий их инкубации (рисунок 2A).
- Концентрируйте обезболенные эмбрионы, перенося их в центрифужную трубку объемом 5 мл с помощью трансферной пипетки, удаляя избыточную среду (E3) из трубки центрифуги (рисунок 2B).
- Дважды промыть эмбрионы 3 мл холодового перфузионного буфера (ПБ) и повторно суспендировать в 2 мл ПБ (рисунок 2B).
- Используя аппарат изоляции эмбрионального сердца (рисунок 2C), втяните ~ 1 мл эмбрионов в иглу шприца и немедленно выталкивайте их обратно в трубку. Повторите этот процесс 30 раз со скоростью 1 с на одно движение шприца (рисунок 2C).
- Пропустите фрагментированные эмбрионы через сито клеточного ситечка размером 100 мкм, помещенное в воронку, и соберите отфильтрованные сердца в другую трубку центрифуги объемом 5 мл. Промойте шприц 1 мл ПБ и соберите этот промывку в трубку через сито (рисунок 2C).
- Хорошо перемешайте и разделите на 1,5 мл центрифужные трубки, каждая из которых содержит 1 мл содержимого. Центрифугируйте все трубки на настольной мини-центрифуге в течение 5 с (2000 х г при температуре окружающей среды) и выбросьте супернатанты.
- Проводят последовательную ресуспензию гранул в трубах с использованием 1 мл ПБ, т.е. повторно суспендируют гранулу в одной трубке с использованием 1 мл ПБ и используют этот повторно суспендированный ПБ для повторного суспендирования гранулы в следующей трубе.
- Осторожно пипеткой сердца вверх и вниз два раза, прежде чем добавить каплю их для соответствующих исследований.
5. Патч-зажимные исследования изолированных сердечно-сосудистых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Из изолированных клеток могут быть получены записи с вывернутыми и цельноклеточными зажимами, как сообщалось ранее для течений канала KATP в кардиоваскулатурерыбок данио 9.
- Для взрослых и ювенильных кардиомиоцитов добавьте диссоциированные клетки (из шага 2) непосредственно в записывающую камеру из суспензии. Для ячеек VSM поместите крышку, содержащую покрытые ячейки VSM (из шага 3), в камеру записи.
- Добавьте изолированные интактные эмбриональные сердца (с этапа 4) в камеру из суспензии и сделайте записи зажимов из эпикардиальных миоцитов (рисунок 2D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вышеуказанные протоколы надежно и регулярно обеспечивают достаточное количество сердечных и сосудистых миоцитов постоянного качества, поддающихся исследованиям зажимов, о чем недавно сообщалось в обширных исследованиях АТФ-чувствительных калиевых (KATP) каналов в кардиовакулятуре дикого типа и мутантных рыбок данио9. Репрезентативные следы записи активности такого канала КАТФ от изолированных кардиомиоцитов показаны на рисунке 3А-С. В случае клеток, выделенных из луковичного артериоза, гладкомышечные клетки сосудов были подтверждены экспрессией Tg(tagln:egfp) 11,12 (Рисунок 1). Успешные одноканальные записи были получены (n = 8 записей из N = 5 препаратов) в пластырях, вырезанных из эмбриональных сердец (рисунок 3D). Потенциалы действия регистрировались у изолированных желудочковых и предсердных миоцитов взрослых рыбок данио в цельноклеточном режиме токового зажима с использованием усилителя патч-зажима вместе с совместимым дигитайзером (см. Таблицу материалов). Внеклеточный регистрирующий раствор для измерения потенциала действия (AP) содержал NaCl (140 мМ), KCl (4 мМ), CaCl2 (1,8 мМ), MgCl2 (1 мМ), глюкозу (10 мМ), HEPES (10 мМ) и Блеббистатин (0,01 мМ, рН 7,4); внутриклеточный регистрирующий раствор содержал KCl (120 мМ), EGTA (5 мМ),K2АТФ (5 мМ), MgCl2 (5 мМ) и HEPES (10 мМ, рН 7,2). Патч-пипетки вытягивались из натриево-известкового стекла и имели сопротивление 3 - 5 МОм при заполнении внутриклеточным раствором. Желудочковые миоциты демонстрируют стабильные гиперполяризованные мембранные потенциалы, и потенциалы действия стимулировались с помощью инъекции тока через пипетку пластыря (рисунок 3E), тогда как предсердные миоциты демонстрировали спонтанное возбуждение потенциала действия (рисунок 3F). Свойства потенциала действия обобщены в таблице 3.
Рисунок 1: Выделение предсердных, желудочковых и луковичных артериозных клеток. Схема, иллюстрирующая выделение предсердных (А), желудочковых (В) и луковичных артериозных (С) клеток. Изображения, изображающие каждый изолированный тип ячейки (внизу), имеют шкалу = 50 мкм в каждом случае. БА-клетки, выделенные из трансгенных репортерных линий рыбок данио гладкомышечных клеток (Tg(tagln:egfp)11,12), положительны на зеленую флуоресценцию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема, иллюстрирующая изоляцию эмбриональных сердец. (A) Оплодотворенные эмбрионы удаляют из резервуара для размножения и помещают в чашку Петри, содержащую воду E3, и поддерживают при температуре 28 °C в течение 5 дней. (B) В желаемом возрасте эмбрионы обезболивают in situ с использованием трицина и переносят в ПБ в центрифужных трубках объемом 5 мл для диссоциации. (C) Аппарат для изоляции эмбрионального сердца состоит из шприца объемом 10 мл, прикрепленного к игле 19 Г, установленной над диссоциационной трубкой на стенде, что позволяет рукам выполнять тритурацию. (D) Изображение изолированного сердца (день 4), прикрепленного к пипетке с зажимом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные записи патч-зажимов из изолированных сердечно-сосудистых тканей рыбок данио. (A, B) АТФ-чувствительныеK-каналы изнутри вырезанных записей патч-зажимов предсердных (A) и желудочковых (B) кардиомиоцитов, выделенных у взрослых рыбок данио. (C) Проводимость канала KATP была зарегистрирована при зажатии цельноклеточного пластыря клеток VSM, выделенных у взрослых рыбок данио. (D) Активность одного канала K+ в мембранных пятнах, вырезанных из эмбриональных сердец рыбок данио (4 dpf). Все вырезанные патч-записи были сделаны с 140 мМ KCl по обе стороны мембраны, при мембранном потенциале -50 мВ. Цельноклеточные токи регистрировались с мембранным потенциалом, зажатым при -70 мВ. (E) Пример записи тока-зажима из изолированного желудочкового миоцита. Потенциалы действия стимулировались текущей инъекцией, как показано ниже. (F) Пример записи тока-зажима из изолированного предсердного миоцита, показывающий спонтанное возбуждение потенциала действия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| ПЕРФУЗИОННЫЙ БУФЕР (ПБ) | 10 мМ HEPES, 30 мМ Таурин, 5,5 мМ Глюкоза, 10 мМ BDM. Сделайте раствор в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), отрегулируйте рН до 7,4 | ||
| БУФЕР ПИЩЕВАРЕНИЯ (DB) | ПБ + 12,5 мкМ CaCl2 + 5 мг/мл Col II + 5 мг/мл Col IV + 5 нг/мл инсулина | ||
| ОСТАНОВКА БУФЕРА (SB) | ПБ + 10% FBS + 12,5 мкМ CaCl2 + 10 мг/мл BSA + 5 нг/мл инсулина | ||
Таблица 1: Растворы для выделения кардиомиоцитов рыбок данио.
| S1 БУФЕР | 0,1% BSA (мас./об.), 145 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 10 мМ Глюкоза, 0,05 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, скорректированный на рН 7,4 с использованием NaOH | ||
| БУФЕР S2 | 2 мл S1, 4 мг папаина, 2 мг ДТТ | ||
| БУФЕР S3 | 2 мл S1, 3 мг коллагеназы типа H, 2 мг ингибитора трипсина, 1 мг эластазы | ||
Таблица 2: Растворы для выделения ВСМ клеток рыбок данио.
| Желудочковые миоциты (n = 3 записи) | |||
| Vm (мВ) | АПА (мВ) | APD50 (мс) | |
| -75.7 ± 3.9 | -119.6 ± 3.8 | 329 ± 163 | |
| Предсердные миоциты (n = 3 записи) | |||
| Скорость точки доступа (мин-1) | МДП (мВ) | АПА (мВ) | APD50 (мс) |
| 107.3 ± 32.6 | -71.2 ± 5.1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Таблица 3: Свойства потенциала действия изолированных кардиомиоцитов рыбок данио. Запись в режиме текущего зажима. Данные показаны как среднее ± S.D. Vm = мембранный потенциал; APA = амплитуда потенциала действия; APD50 = продолжительность действия потенциала до 50% реполяризации; MDP = максимальный диастолический потенциал.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие методы выделения желудочковых миоцитов рыбок данио 5,6, направленные на генерацию миоцитов для культуральных или электрофизиологических исследований, обеспечивали клетки с более низким выходом и включали длительные этапы множественных центрифугаций, что отрицательно сказывалось на качестве и жизнеспособности клеток. Описанные здесь протоколы надежны, охватывают каждую из значимых сердечно-сосудистых тканей (желудочек, предсердий и ВСМ), и, что важно, довольно практичны для острой изоляции живых клеток. Подходы к изоляции, включающие канюляцию желудочка через BA13, могут быть сложной альтернативой желудочковым кардиомиоцитам, но требуют более высокой степени ловкости и могут негативно повлиять на изоляцию предсердий. Подход, подробно описанный в текущем протоколе, обеспечивает простую и эффективную альтернативу.
Дополнительные соображения для выделения личиночной сердечной ткани: (1) На этапе 1.4, в зависимости от возраста рыбы и имеющегося увеличения, ткани могут быть видны еще до удаления грудных мышц, и в этом случае ткани могут быть непосредственно «вырваны» из рыбы без предварительной операции, а затем ткани, не связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями, могут быть удалены с помощью сверхтонких щипцов; (2) На этапе 2.2 для личинок моложе 14 дней сердца могут быть использованы непосредственно для электрофизиологических исследований без необходимости ферментативной диссоциации.
Как отмечалось выше и обычно верно для методов ферментативной диссоциации в целом, оказалось важным использовать свежие буферы и ферменты каждый раз. Однако перфузионный буфер (ПБ) и буфер S1 могут быть приготовлены заранее и храниться при 4-8 °C в течение 1 месяца.
Время успешного выделения тканей не должно превышать ~ 90 с на рыбу, и ткани не должны подвергаться воздействию воздуха. Когда диссоциация занимает больше времени, качество клеток (т.е. выживаемость) снижается. При тритурации тканей следует соблюдать осторожность, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, что также снижает качество клеток. Изоляция клеток VSM чувствительна к перевариванию коллагеназой в буфере S3. После первых 3 мин пищеварения трубку следует каждую минуту вынимать из термошейкера и осматривать на наличие плавающих расширенных и полупрозрачных тканей. Как только фрагментация тканей очевидна, этап пищеварения должен быть прекращен.
Важно отметить, что эти протоколы не оптимизированы для выделения кальций-толерантных кардиомиоцитов, как это потребовалось бы для исследований сократимости. Однако, как показано, достоверная регистрация потенциалов действия кардиомиоцитов может быть достигнута при наличии физиологических внеклеточных концентраций кальция 7,14. Ранее было показано, что блеббистатин, предназначенный для разъединения возбуждения и сокращения, а также для улучшения формирования гигаомомского уплотнения и эффективности регистрации в этих экспериментах, не оказывает существенного влияния на параметры AP в интактных сердцах рыбок данио14. Для электрофизиологии абсолютный выход клеток также обычно не ограничивает скорость. Этот протокол не был оптимизирован для выхода, что может быть необходимо для биохимических исследований изолированных клеток. Тем не менее, выход, достигнутый с помощью этих методов, хорошо подходит для электрофизиологических исследований и, вероятно, нескольких других подходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH HL140024 для CGN и HL150277 для CMC. Рисунки 1 и 2 были созданы с помощью BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
