Summary
Denne protokollen beskriver akutt isolering av levedyktige hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksen, juvenil, larve og embryonal sebrafisk (Danio rerio), egnet for elektrofysiologiske studier.
Abstract
Sebrafisk har lenge vært brukt som en modell vertebrate organisme i kardiovaskulær forskning. De tekniske vanskelighetene med å isolere individuelle celler fra sebrafiskens kardiovaskulære vev har vært begrensende for å studere deres elektrofysiologiske egenskaper. Tidligere metoder er beskrevet for disseksjon av sebrafiskhjerter og isolering av ventrikulære hjertemyocytter. Isoleringen av sebrafiskatrielle og vaskulære myocytter for elektrofysiologisk karakterisering var imidlertid ikke detaljert. Dette arbeidet beskriver nye og modifiserte enzymatiske protokoller som rutinemessig gir isolerte juvenile og voksne sebrafisk ventrikulære og atrielle kardiomyocytter, samt vaskulær glatt muskulatur (VSM) celler fra bulbous arteriosus, egnet for patch-clamp eksperimenter. Det har ikke vært noe litterært bevis på elektrofysiologiske studier på sebrafisk kardiovaskulært vev isolert ved embryonale og larvestadier av utvikling. Delvis dissosiasjonsteknikker som tillater patch-clamp eksperimenter på individuelle celler fra larve og embryonale hjerter er demonstrert.
Introduction
Sebrafisk er små teleostfisk som lenge har vært brukt som modellvirveldyrorganisme 1 og har nylig blitt fremtredende som et levedyktig virveldyrsystem for høy gjennomstrømningsscreening av gener og legemidler 2,3. Imidlertid er fysiologisk analyse av sebrafiskvev ikke godt utviklet. I hjerte- og karsystemet er det beskrevet metoder for disseksjon av sebrafiskhjerter4 og isolering av ventrikulære hjertemyocytter 5,6,7. Det er få detaljerte beskrivelser av effektiv isolering av atriemyocytter og ingen rapporter om vaskulære glatte muskelpreparater (VSM) for patch-clamp-studier.
Det nåværende arbeidet beskriver metodikk for isolering av sebrafisk hjerte- og vaskulære myocytter, levedyktig for elektrofysiologiske og funksjonelle studier. Denne tilnærmingen inkluderer modifikasjoner av tidligere rapporterte protokoller for sebrafisk ventrikulær myocyttisolasjon5,6 og tilpasser metoder fra pattedyrs VSM-celleisolasjoner8, noe som muliggjør isolering av sebrafisk vaskulære glatte muskelceller fra bulbous arteriosus (BA). Protokollene resulterer i effektive utbytter av isolerte atrielle, ventrikulære og VSM-celler fra sebrafisk som pålitelig kan brukes i patch-clamp-studier i opptil 8 timer9.
Til tross for deres nesten gjennomsiktige larver som utvikler seg helt utenfor foreldrenes organisme, har det å utforske deres lovede ontogenetiske potensial ved å studere kardiovaskulær utvikling vært begrenset av utfordringer med å trekke ut og analysere vev i ung alder. Den nåværende artikkelen adresserer denne begrensningen ved å demonstrere patch-clamp-eksperimenter på sebrafiskhjerter isolert så tidlig som 3 dager etter befruktning (dpf), ved hjelp av en tilpasset, publisert ekstraksjonsmetode10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All sebrafisk (villtype stamme AB, både mann og kvinne) ble hevet, vedlikeholdt og håndtert for forsøkene i henhold til retningslinjene fra Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Isolering av atrium, ventrikel og bulbøs arteriosus fra voksen, ung og larvesebrafisk
- Avliv fisk ved hjelp av kuldesjokk, dvs. ved å senke seg ned i 4 ° C vann, for ~ 10 s.
- Ved hjelp av buede tang overfører du fisk til en stor petriskål delvis fylt med perfusjonsbuffer (PB) (tabell 1) og legges under et dissekeringsmikroskop.
- Halshugg fisken like bak øynene, ved hjelp av en saks.
- Bruk buede tang (fin tang for larvefisk), hold fisken i den ikke-dominerende hånden med den ventrale siden vendt mot disseksjonsomfanget. Med det andre paret fine tang (eller superfine for larvefisk) i den dominerende hånden, riv forsiktig opp brystmusklene og finnene for å avsløre kardiovaskulære (CV) vev (atrium, ventrikel og bulbous arteriosus, BA) (figur 1).
- Plasser de fine tangene i den dominerende hånden, trekk BA forsiktig på den kryssende spissen av BA og ventral aorta.
MERK: BA og hjertet vil komme ut av kroppshulen.- Skill BA forsiktig fra aorta ved å klemme tangen og lokalisere atriumspissen der flere venøse grener konvergerer (sinus venosus). Bruk de fine tangene til å "plukke" tuppen av atriet av sinus venosus. Dette isolerer CV-vevet fra resten av kroppen (figur 1).
2. Dissosiasjon av kardiomyocytter fra voksen, juvenil og larvesebrafisk for elektrofysiologiske studier
- Bruk de fine tangene til å "plukke" atriumet og ventrikkelen ut av CV-vevet isolert i det tidligere trinnet.
MERK: Prosessen tillater ren disseksjon av hvert vev med minimal krysskontaminering og føles som å plukke frukt fra et tre.- Lag en mild tåre i ventrikkelen ved hjelp av fine tang for å tømme overflødig blod, noe som kan sikres når hjertevevet blir blek laksfarge fra lyse rødt.
- Samle det isolerte atrium og ventrikkel i separate 1,5 ml sentrifugerør som inneholder perfusjonsbuffer (PB; 1,5 ml).
MERK: For å garantere vellykket dissosiasjon av voksne sebrafisk atrielle kardiomyocytter (ACM) og ventrikulære kardiomyocytter (VCM), er det vanligvis nødvendig med fire atrier og tre ventrikler. Når det gjelder ung sebrafisk (28-90 dager), blir dette tallet doblet.- Når det gjelder larve sebrafisk (14-28 dager), samle så mye vev som mulig fra ~ 30 larver.
- Bytt ut PB i rørene med 750 μL fordøyelsesbuffer (DB) (tabell 1) hver og plasser rørene på en termoshaker ved 37 °C og 800 o / min. Tillat fordøyelsen av vevet til de blir gjennomsiktige (~ 30 min for atriene og ~ 40 min for ventriklene).
- Avslutt fordøyelsen ved å forsiktig spinne ned vevet i en stasjonær minisentrifuge (2000 x g ved omgivelsestemperatur) i 3-5 s og erstatt supernatant DB med 750 μL stoppbuffer (SB) hver (tabell 1).
MERK: Dette sentrifugeringstrinnet er valgfritt for VCM-isolasjon. - Inkuber pelleterte vev i SB ved omgivelsestemperatur i 15 minutter.
- Bytt forsiktig ut SB med 500-750 μL PB hver (avhengig av ønsket tetthet av de endelige cellene) og triturerer vevet (~ 30 ganger) ved hjelp av en flammepolert Pasteur-pipette for å spre cellene.
MERK: Kardiomyocyttene (CM) er nå klare for elektrofysiologiske studier og lagres ved romtemperatur i opptil 8 timer. - For jevn prøvetaking, pipette forsiktig cellene opp og ned et par ganger for å resuspendere før du legger til en dråpe av dem for tilsvarende studier.
3. Dissosiasjon av vaskulære glatte muskelceller (VSM) fra voksne og unge sebrafisk for elektrofysiologiske studier
- Plukk bulbøs arteriosus (BA) fra CV-vevet ved hjelp av samme tilnærming som trinn 2.1 og samle fem voksne BA i et 1,5 ml sentrifugerør som inneholder S1-buffer (1,5 ml) (tabell 2). Når det gjelder ung sebrafisk, basseng ti BA og, for larver eldre enn 2 uker, basseng 30-40 BAs.
MERK: Det er ikke praktisk mulig å isolere VSM-celler fra sebrafisklarver yngre enn 2 uker. - Erstatt S1 med 400 μL S2-buffer (tabell 2) og tillat papain (se materialtabell) fordøyelse av BA-ene på en termoshaker ved 37 ° C og 800 o / min i ~ 20 min.
- La de delvis fordøyede BA-ene slå seg ned i 1 minutt og erstatt supernatant S2 med 500 μL S3-buffer (tabell 2) som inneholder kollagenase. Fordøye vevet på en termoshaker ved 37 °C og 800 o/min i 3-5 min.
- Avslutt fordøyelsen ved å forsiktig spinne ned vevet i en stasjonær minisentrifuge (2000 x g ved omgivelsestemperatur) i 3-5 s og erstatte supernatant S3 med 500 μL S1.
- Triturerer forsiktig det pelleterte vevet (~ 15 ganger) for å spre VSM-celler og plate på glassdeksler av passende størrelse.
MERK: Dekselstørrelsen bestemmes av størrelsen på patch-clamp opptakskammeret, i dette tilfellet ble 5 x 5 mm brukt).- Hold dekslene i romtemperatur i 30 minutter slik at cellene kan festes og bruke dem i løpet av de neste 6 timene.
4. Isolering av hjerter fra embryonal sebrafisk for elektrofysiologiske studier
- Tilsett trikain (150 mg/l; 1 ml per 100 mm x 20 mm petriskål) til ~300 embryoer (2-5 dpf), samlet fra inkubasjonsbetingelsene (figur 2A).
- Konsentrer de bedøvede embryoene ved å overføre dem til et 5 ml sentrifugerør ved hjelp av en overføringspipette, og fjern overflødig media (E3) fra sentrifugerøret (figur 2B).
- Vask embryoene med 3 ml kald perfusjonsbuffer (PB) to ganger og resuspender i 2 ml PB (figur 2B).
- Bruk det embryonale hjerteisolasjonsapparatet (figur 2C), trekk ~1 ml av embryoene inn i sprøytenålen og fjern dem umiddelbart tilbake i røret. Gjenta denne prosessen 30 ganger, med en hastighet på 1 s per sprøytebevegelse (figur 2C).
- Pass de fragmenterte embryoene gjennom en 100 μm celle-silsil plassert i en trakt og samle de filtrerte hjertene i et annet 5 ml sentrifugerør. Skyll sprøyten med 1 ml PB og samle denne skyll også inn i røret gjennom silen (figur 2C).
- Bland godt og skill i 1,5 ml sentrifugerrør, hvor hvert rør inneholder 1 ml av innholdet. Sentrifuge alle rørene på en stasjonær minisentrifuge i 5 s (2000 x g ved omgivelsestemperatur) og kast supernatantene.
- Utfør seriell resuspendering av pellets i rørene ved hjelp av 1 ml PB, dvs. resuspendere pelleten i ett rør ved hjelp av 1 ml PB og bruk den resuspenderte PB til å resuspendere pelleten i neste rør.
- Pipette hjertene forsiktig opp og ned to ganger før du legger til en dråpe av dem for tilsvarende studier.
5. Patch-clamp studier på isolerte kardiovaskulære celler
MERK: Innvendige og helcellede patch-klemmeopptak fra de isolerte cellene kan oppnås som tidligere rapportert for KATP-kanalstrømmer i sebrafiskkardiovaskulatur9.
- For voksne og juvenile kardiomyocytter, tilsett de dissosierte cellene (fra trinn 2) direkte til opptakskammeret fra suspensjon. For VSM-celler plasserer du dekselet som inneholder de belagte VSM-cellene (fra trinn 3) i opptakskammeret.
- Tilsett isolerte intakte embryonale hjerter (fra trinn 4) til kammeret fra suspensjon, og gjør patch-clamp-opptak fra epikardiale myocytter (figur 2D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovennevnte protokoller gir pålitelig og rutinemessig tilstrekkelige hjerte- og vaskulære myocytter av konsistent kvalitet som er egnet for patch-clamp-studier som nylig rapportert i omfattende studier av ATP-sensitive kalium (KATP) kanaler i villtype og mutant sebrafisk kardiovaskulatur9. Representative spor av registreringer av slik KATP-kanalaktivitet fra isolerte kardiomyocytter er vist i figur 3A-C. For celler isolert fra bulbøs arteriosus ble de vaskulære glatte muskelcellene bekreftet ved Tg(tagln:egfp)-uttrykk11,12 (figur 1). Vellykkede enkeltkanalopptak ble oppnådd (n = 8 opptak fra N = 5 preparater) i flekker skåret ut fra embryonale hjerter (figur 3D). Aksjonspotensialer ble registrert fra isolerte voksne sebrafisk ventrikulære og atrielle myocytter i helcelle, strømklemmemodus, ved hjelp av en patch-klemmeforsterker sammen med en kompatibel digitaliseringsenhet (se Materialtabell). Den ekstracellulære opptaksløsningen for målinger av aksjonspotensial (AP) inneholdt NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl 2 (1,8 mM), MgCl2 (1 mM), glukose (10 mM), HEPES (10 mM) og Blebbistatin (0,01 mM, pH 7,4); den intracellulære opptaksløsningen inneholdt KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K 2 ATP (5 mM), MgCl 2 (5 mM) og HEPES (10 mM, pH7,2). Plasterpipetter ble trukket fra sodakalkglass og hadde motstand på 3-5 MΩ når de var fylt med intracellulær oppløsning. Ventrikkelmyocytter utviser stabile hyperpolariserte membranpotensialer, og aksjonspotensialer ble stimulert via strøminjeksjon gjennom plasterpipetten (figur 3E), mens atriemyocytter viste spontan aksjonspotensialavfyring (figur 3F). Egenskaper for tiltakspotensial er oppsummert i tabell 3.
Figur 1: Isolering av atrielle, ventrikulære og bulbøse arteriosusceller. Skjematisk for å illustrere isoleringen av atrielle (A), ventrikulære (B) og bulbøse arteriosus (C) celler. Bildene som viser hver isolerte celletype (nederst) har skalastenger = 50 μm i hvert tilfelle. BA-celler isolert fra glatte muskelceller transgene reporter sebrafisklinjer (Tg (tagln: egfp) 11,12) er positive for grønn fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk for å illustrere isolering av embryonale hjerter. (A) Befruktede embryoer fjernes fra avlstanken og legges i en petriskål som inneholder E3-vann og opprettholdes ved 28 °C i opptil 5 dager. (B) Ved ønsket alder bedøves embryoer in situ ved bruk av tricain og overføres til PB i 5 ml sentrifugerør for dissosiasjon. (C) Embryonalt hjerteisolasjonsapparat består av en 10 ml sprøyte festet til en 19 G nål montert over dissosiasjonsrøret på et benkstativ, slik at hendene kan utføre triturasjonen. (D) Bilde av det isolerte hjertet (dag 4) festet til en patch-clamp pipette. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative patch-clamp opptak fra isolert sebrafisk kardiovaskulært vev. (A, B) ATP-sensitive KATP-kanaler fra innsiden ut utskårne patch-clamp opptak av atrielle (A) og ventrikulære (B) kardiomyocytter isolert fra voksen sebrafisk. (C) K ATP-kanalkonduktans ble registrert fra helcelleplastklemming av VSM-celler isolert fra voksen sebrafisk. (D) Enkel K + kanalaktivitet i membranplaster skåret ut fra sebrafisk embryonale hjerter (4 dpf). Alle utskårne patchopptak ble gjort med 140 mM KCl på begge sider av membranen, ved -50 mV membranpotensial. Helcellestrømmer ble registrert med membranpotensialet klemt fast ved -70 mV. (E) Eksempel strømklemmeopptak fra isolert ventrikulær myocytt. Aksjonspotensialer ble stimulert ved nåværende injeksjon som vist nedenfor. (F) Eksempel på strømklemmeopptak fra isolert atriemyocytt som viser spontan virkningspotensialavfyring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| PERFUSJONSBUFFER (PB) | 10 mM HEPES, 30 mM Taurin, 5,5 mM Glukose, 10 mM BDM. Lag løsningen i fosfatbufret saltvann (PBS), juster pH til 7,4 | ||
| FORDØYELSESBUFFER (DB) | PB + 12,5 μM CaCl2 + 5 mg/ml kol II + 5 mg/ml kol IV + 5 ng/ml insulin | ||
| STOPPE BUFFER (SB) | PB + 10% FBS + 12,5 μM CaCl2 + 10 mg/ml BSA + 5 ng/ml insulin | ||
Tabell 1: Løsninger for isolering av sebrafiskkardiomyocytter.
| S1-BUFFER | 0,1 % BSA (u/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glukose, 0,05 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, justert til pH7,4 ved bruk av NaOH | ||
| S2-BUFFER | 2 ml S1, 4 mg smerter, 2 mg DTT | ||
| S3-BUFFER | 2 ml S1, 3 mg kollagenase type H, 2 mg trypsinhemmer, 1 mg elastase | ||
Tabell 2: Løsninger for isolering av sebrafisk VSM-celler.
| Ventrikulære myocytter (n = 3 opptak) | |||
| Vm (mV) | TFO (mV) | APD50 (ms) | |
| -75,7 ± 3,9 | -119,6 ± 3,8 | 329 ± 163 | |
| Atrielle myocytter (n = 3 opptak) | |||
| AP-pris (min-1) | MDP (mV) | TFO (mV) | APD50 (ms) |
| 107,3 ± 32,6 | -71.2 ± 5.1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Tabell 3: Aksjonspotensialegenskaper fra isolerte sebrafiskkardiomyocytter. Innspilt i gjeldende klemmemodus. Data vist som gjennomsnittlig ± S.D. Vm = membranpotensial; APA = handlingspotensial amplitude; APD50 = virkningspotensialets varighet til 50 % repolarisering; MDP = maksimalt diastolisk potensial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere metoder for å isolere sebrafisk ventrikulære myocytter5,6, med sikte på å generere myocytter for kultur eller elektrofysiologiske studier, ga celler med lavere utbytte og involverte lange trinn med flere sentrifugeringer som påvirket cellekvaliteten og levedyktigheten negativt. Protokollene beskrevet her er pålitelige, dekker hvert av de signifikante kardiovaskulære vevene (ventrikel, atria og VSM), og viktigere er ganske praktiske for akutt isolering av levende celler. Isoleringstilnærminger som involverer kanylering av ventrikkelen via BA13 kan være et sofistikert alternativ for ventrikulære kardiomyocytter, men krever en høyere grad av fingerferdighet og kan påvirke atrieisolasjonen negativt. Tilnærmingen beskrevet i gjeldende protokoll gir et enkelt og effektivt alternativ.
Ytterligere hensyn for larvens hjertevevsisolering er: (1) I trinn 1.4, avhengig av fiskens alder og forstørrelse tilgjengelig, kan vevet være synlig selv før du fjerner brystmusklene, i så fall kan vevet "plukkes" direkte ut av fisken uten forutgående kirurgi, og deretter kan ikke-CV-vevet fjernes ved hjelp av superfine tang; (2) I trinn 2.2, for larver yngre enn 14 dager, kan hjertene brukes direkte til elektrofysiologiske studier uten behov for enzymatisk dissosiasjon.
Som nevnt ovenfor, og typisk sant for enzymatiske dissosiasjonsmetoder generelt, har det vist seg viktig å bruke friske buffere og enzymer hver gang. Perfusjonsbuffer (PB) og S1 buffer kan imidlertid fremstilles på forhånd og oppbevares ved 4-8 °C i 1 måned.
Vellykket vevsisoleringstid bør ikke overstige ~ 90 s per fisk, og vev bør ikke utsettes for luft. Når dissosiasjon tar lengre tid, reduseres cellekvaliteten (dvs. overlevelse). Ved triturering av vev bør det tas hensyn til å unngå å generere luftbobler, noe som også reduserer cellekvaliteten. VSM-celleisolasjon er følsom for fordøyelsen ved kollagenase i S3-buffer. Etter de første 3 minuttene av fordøyelsen, bør røret tas ut av termoshakeren hvert minutt og undersøkes for flytende dilatert og gjennomsiktig vev. Når vevfragmentering er tydelig, bør fordøyelsestrinnet opphøre.
Det er viktig å merke seg at disse protokollene ikke er omfattende optimalisert for å isolere kalsiumtolerante kardiomyocytter, som det ville være nødvendig for kontraktilitetsstudier. Som vist kan imidlertid pålitelig registrering av kardiomyocyttvirkningspotensialer oppnås i nærvær av fysiologiske ekstracellulære kalsiumkonsentrasjoner 7,14. Blebbistatin, inkludert for å koble fra eksitasjon og sammentrekning, og forbedre giga-Ohm tetningsdannelse og registreringseffektivitet i disse forsøkene, har tidligere vist seg å ikke påvirke AP-parametrene i intakte sebrafiskhjerter14. For elektrofysiologi er det absolutte utbyttet av celler heller ikke rutinemessig hastighetsbegrensende. Denne protokollen er ikke optimalisert for utbytte, noe som kan være nødvendig for biokjemiske studier av isolerte celler. Likevel er utbyttet oppnådd med disse metodene godt egnet for elektrofysiologiske studier og sannsynligvis flere andre tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd HL140024 til CGN og HL150277 til CMC. Figur 1 og figur 2 ble opprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
