Summary
Detta protokoll beskriver den akuta isoleringen av livskraftiga hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviska och embryonala zebrafiskar (Danio rerio), lämpliga för elektrofysiologiska studier.
Abstract
Zebrafisk har länge använts som en modell ryggradsdjur organism i kardiovaskulär forskning. De tekniska svårigheterna att isolera enskilda celler från zebrafiskens kardiovaskulära vävnader har varit begränsande för att studera deras elektrofysiologiska egenskaper. Tidigare metoder har beskrivits för dissektion av zebrafiskhjärtan och isolering av ventrikulära hjärtmyocyter. Isoleringen av zebrafiskförmaks- och vaskulära myocyter för elektrofysiologisk karakterisering var emellertid inte detaljerad. Detta arbete beskriver nya och modifierade enzymatiska protokoll som rutinmässigt tillhandahåller isolerade juvenila och vuxna zebrafiskkammare och förmakskardiomyocyter, liksom vaskulära glattmuskelceller (VSM) från bulbous arteriosus, lämpliga för patch-clamp-experiment. Det har inte funnits några litterära bevis för elektrofysiologiska studier på zebrafiskens kardiovaskulära vävnader isolerade vid embryonala och larvala utvecklingsstadier. Partiella dissociationstekniker som möjliggör patch-clamp-experiment på enskilda celler från larv- och embryonala hjärtan demonstreras.
Introduction
Zebrafisk är små teleostfiskar som länge har använts som modell ryggradsdjurorganism1 och har nyligen blivit framträdande som ett livskraftigt ryggradsdjursystem för screening med hög genomströmning av gener och läkemedel 2,3. Fysiologisk analys av zebrafiskvävnader är emellertid inte välutvecklad. I hjärt-kärlsystemet har metoder beskrivits för dissektion av zebrafiskhjärtan4 och isolering av ventrikulära hjärtmyocyter 5,6,7. Det finns få detaljerade beskrivningar av den effektiva isoleringen av förmaksmyocyter och inga rapporter om vaskulära glattmuskelpreparat (VSM) för patch-clamp-studier.
Det aktuella arbetet beskriver metodik för isolering av zebrafiskhjärtade och vaskulära myocyter, livskraftiga för elektrofysiologiska och funktionella studier. Detta tillvägagångssätt inkluderar modifieringar av tidigare rapporterade protokoll för zebrafiskventrikelmyocytisolering5,6 och anpassar metoder från däggdjurs VSM-cellisoleringar8, vilket möjliggör isolering av zebrafiskvaskulära glattmuskelceller från bulbous arteriosus (BA). Protokollen resulterar i effektiva utbyten av isolerade förmaks-, ventrikulära och VSM-celler från zebrafiskar som på ett tillförlitligt sätt kan användas i patch-clamp-studier i upp till 8 h9.
Trots deras nästan transparenta larver som utvecklas helt utanför föräldraorganismen har utforskandet av deras utlovade ontogenetiska potential för att studera kardiovaskulär utveckling begränsats av utmaningar med att extrahera och analysera vävnader i ung ålder. Den aktuella artikeln behandlar denna begränsning genom att demonstrera patch-clamp-experiment på zebrafiskhjärtan isolerade så tidigt som 3 dagar efter befruktning (dpf), med hjälp av en anpassad, publicerad extraktionsmetod10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla zebrafiskar (vild stam AB, både hane och hona) föddes, underhålls och hanterades för experimenten enligt riktlinjerna från Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Isolering av atrium, ventrikel och bulbous arteriosus från vuxen, juvenil och larv zebrafisk
- Avliva fisk med kallchock, dvs genom att nedsänka i 4 °C vatten, i ~ 10 s.
- Använd böjda pincett och överför fisk till en stor petriskål delvis fylld med perfusionsbuffert (PB) (tabell 1) och placera under ett dissekerande mikroskop.
- Halshugga fisken strax bakom ögonen med en sax.
- Använd böjda pincett (fina pincett för larvfisk), håll fisken i den icke-dominerande handen med den ventrala sidan vänd mot dissektionsomfånget. Med det andra paret av fina pincett (eller superfin för larvfisk) i den dominerande handen, riv försiktigt upp bröstmusklerna och fenorna för att avslöja kardiovaskulära (CV) vävnader (atrium, ventrikel och bulbous arteriosus, BA) (Figur 1).
- Placera de fina tångarna i den dominerande handen, dra försiktigt BA vid den skärande spetsen av BA och den ventrala aortan.
OBS: BA och hjärta kommer ut ur kroppshålan.- Separera försiktigt BA från aortan genom att klämma fast tången och lokalisera atriumets spets i vilken flera venösa grenar konvergerar (sinus venosus). Använd de fina tångarna och "plocka" spetsen av förmaket från sinus venosus. Detta isolerar CV-vävnaderna från resten av kroppen (figur 1).
2. Dissociation av kardiomyocyter från vuxen, juvenil och larvzebrafisk för elektrofysiologiska studier
- Med hjälp av de fina tångarna "plockar" förmaket och ventrikeln ur CV-vävnaden som isolerades i det tidigare steget.
OBS: Processen möjliggör ren dissektion av varje vävnad med minimal korskontaminering och känns som att plocka frukt från ett träd.- Gör en mild riva in i ventrikeln med fina pincett för att tömma överflödigt blod, vilket kan säkerställas när hjärtvävnaden blir blek laxfärg från ljusröd.
- Slå samman det isolerade atriumet och ventrikeln i separata 1,5 ml centrifugrör som innehåller perfusionsbuffert (PB; 1,5 ml).
OBS: För att garantera framgångsrik dissociation av vuxna zebrafiskar förmakskardiomyocyter (ACM) och ventrikulära kardiomyocyter (VCM) behövs vanligtvis fyra förmak och tre ventriklar. När det gäller juvenil zebrafisk (28-90 dagar) fördubblas detta antal.- När det gäller larvzebrafisk (14-28 dagar), samla så mycket vävnad som möjligt från ~ 30 larver.
- Byt ut PB i rören mot 750 μL digestionsbuffert (DB) (tabell 1) vardera och placera rören på en termoshaker vid 37 °C och 800 rpm. Tillåt matsmältning av vävnaderna tills de blir genomskinliga (~ 30 min för förmaken och ~ 40 min för ventriklarna).
- Avsluta matsmältningen genom att försiktigt snurra ner vävnaderna i en minicentrifug på bänkskivan (2 000 x g vid omgivningstemperatur) i 3–5 s och ersätt supernatanten DB med 750 μl stoppbuffert (SB) vardera (tabell 1).
OBS: Detta centrifugeringssteg är valfritt för VCM-isolering. - Inkubera de pelleterade vävnaderna i SB vid omgivningstemperatur i 15 minuter.
- Byt försiktigt ut SB med 500-750 μL PB vardera (beroende på önskad densitet hos de slutliga cellerna) och triturate vävnaderna (~ 30 gånger) med en flampolerad Pasteur-pipett för att sprida cellerna.
OBS: Kardiomyocyterna (CM) är nu redo för elektrofysiologiska studier och förvaras vid rumstemperatur i upp till 8 timmar. - För enhetlig provtagning, pipettera försiktigt cellerna upp och ner ett par gånger för att återsuspendera innan du lägger till en droppe av dem för motsvarande studier.
3. Dissociation av vaskulära glattmuskelceller (VSM) från vuxna och juvenila zebrafiskar för elektrofysiologiska studier
- Plocka bulbous arteriosus (BA) från CV-vävnaderna med samma tillvägagångssätt som steg 2.1 och slå samman fem vuxna BA i ett 1,5 ml centrifugrör som innehåller S1-buffert (1,5 ml) (tabell 2). När det gäller juvenil zebrafisk, slå samman tio BA och, för larver äldre än 2 veckor, slå samman 30-40 BA.
OBS: Det är inte praktiskt möjligt att isolera VSM-celler från zebrafisklarver yngre än 2 veckor. - Byt ut S1 mot 400 μL S2-buffert (tabell 2) och tillåt papain (se materialförteckning) uppslutning av BAs på en termoshaker vid 37 °C och 800 rpm i ~20 min.
- Låt de delvis smälta BA:erna sätta sig i 1 min och ersätt supernatanten S2 med 500 μl S3-buffert (tabell 2) som innehåller kollagenas. Smält vävnaderna på en termoshaker vid 37 °C och 800 rpm i 3-5 min.
- Avsluta matsmältningen genom att försiktigt snurra ner vävnaderna i en minicentrifug på bänkskivan (2 000 x g vid omgivningstemperatur) i 3–5 s och ersätta supernatant S3 med 500 μl S1.
- Triturate försiktigt de pelleterade vävnaderna (~ 15 gånger) för att sprida VSM-celler och plåt på glasöverdrag av lämplig storlek.
OBS: Täckglasets storlek bestäms av storleken på patch-clamp-inspelningskammaren, i detta fall användes 5 x 5 mm).- Håll täckglasen i rumstemperatur i 30 minuter så att cellerna kan fästa och använda dem inom de närmaste 6 timmarna.
4. Isolering av hjärtan från embryonala zebrafiskar för elektrofysiologiska studier
- Tillsätt trikain (150 mg/l; 1 ml per 100 mm x 20 mm petriskål) till ~300 embryon (2-5 dpf), uppsamlade från inkubationsförhållandena (figur 2A).
- Koncentrera de bedövade embryona genom att överföra dem till ett 5 ml centrifugrör med hjälp av en överföringspipett och avlägsna överflödiga medier (E3) från centrifugröret (figur 2B).
- Tvätta embryona med 3 ml kall perfusionsbuffert (PB) två gånger och återsuspendera i 2 ml PB (figur 2B).
- Använd den embryonala hjärtisoleringsapparaten (figur 2C) och dra ~ 1 ml av embryona i sprutnålen och tryck omedelbart tillbaka dem i röret. Upprepa denna process 30 gånger, med en hastighet av 1 s per sprutrörelse (figur 2C).
- För de fragmenterade embryona genom en 100 μm cellsilsil sikt placerad i en tratt och samla de filtrerade hjärtan i ytterligare ett 5 ml centrifugrör. Skölj sprutan med 1 ml PB och samla upp sköljningen i röret genom sikten (figur 2C).
- Blanda väl och separera i 1,5 ml centrifugrör, där varje rör innehåller 1 ml av innehållet. Centrifugera alla rör på en minicentrifug på bänkskivan i 5 s (2 000 x g vid omgivningstemperatur) och kassera supernatanterna.
- Utför seriell resuspension av pellets i rören med användning av 1 ml PB, dvs. återsuspendera pelleten i ett rör med 1 ml PB och använd det återsuspenderade PB för att återsuspendera pelleten i nästa rör.
- Pipettera försiktigt hjärtan upp och ner två gånger innan du lägger till en droppe av dem för motsvarande studier.
5. Patch-clamp-studier på isolerade kardiovaskulära celler
OBS: Inifrån och ut och helcelliga patch-clamp-inspelningar från de isolerade cellerna kan erhållas som tidigare rapporterats för KATP-kanalströmmar i zebrafiskkardiovaskulatur9.
- För vuxna och juvenila kardiomyocyter, tillsätt de dissocierade cellerna (från steg 2) direkt till inspelningskammaren från suspension. För VSM-celler, placera täckbladet som innehåller de pläterade VSM-cellerna (från steg 3) i inspelningskammaren.
- Lägg till isolerade intakta embryonala hjärtan (från steg 4) till kammaren från suspension och gör patch-clamp-inspelningar från epikardiella myocyter (figur 2D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovanstående protokoll tillhandahåller på ett tillförlitligt och rutinmässigt tillräckligt med hjärt- och vaskulära myocyter av konsekvent kvalitet som är mottagliga för patch-clamp-studier som nyligen rapporterats i omfattande studier av ATP-känsliga kaliumkanaler (KATP) i vildtyp och mutant zebrafisk kardiovaskulatur9. Representativa spår av inspelningar av sådan KATP-kanalaktivitet från isolerade kardiomyocyter visas i figur 3A-C. När det gäller celler isolerade från bulbous arteriosus bekräftades de vaskulära glattmuskelcellerna med Tg(tagln:egfp) uttryck11,12 (figur 1). Framgångsrika enkanalsinspelningar erhölls (n = 8 inspelningar från N = 5 preparat) i fläckar som skärs ut från embryonala hjärtan (figur 3D). Åtgärdspotentialer registrerades från isolerade vuxna zebrafiskkammar- och förmaksmyocyter i helcelligt, strömklämläge, med hjälp av en patch-klämförstärkare tillsammans med en kompatibel digitaliserare (se Materialförteckning). Den extracellulära registreringslösningen för mätningarna av åtgärdspotential (AP) innehöll NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl2 (1,8 mM), MgCl2 (1 mM), Glukos (10 mM), HEPES (10 mM) och Blebbistatin(0,01 mM, pH 7,4); Den intracellulära inspelningslösningen innehöll KCl (120 mM), EGTA (5 mM),K2ATP (5 mM), MgCl2 (5 mM) och HEPES(10 mM, pH 7,2). Patchpipetter drogs från sodakalkglas och hade motstånd på 3 - 5 MΩ när de fylldes med intracellulär lösning. Ventrikulära myocyter uppvisar stabila hyperpolariserade membranpotentialer, och åtgärdspotentialer stimulerades via ströminjektion genom plåstretpipetten (figur 3E), medan förmaksmyocyter uppvisade spontan åtgärdspotentialbränning (figur 3F). Åtgärdspotentialegenskaper sammanfattas i tabell 3.
Figur 1: Isolering av förmaks-, ventrikulära och bulbösa arteriosusceller. Schematisk för att illustrera isoleringen av förmaksceller (A), ventrikulära (B) och bulbous arteriosus (C). Bilderna som visar varje isolerad celltyp (nederst) har skalstreck = 50 μm i varje fall. BA-celler isolerade från glattmuskelcellstransgena reporterzebrafisklinjer (Tg(tagln:egfp)11,12) är positiva för grön fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk för att illustrera isoleringen av embryonala hjärtan. A) Befruktade embryon avlägsnas från avelstanken och placeras i en petriskål som innehåller E3-vatten och hålls vid 28 °C i upp till 5 dagar. (B) Vid önskad ålder bedövas embryon in situ med tricaine och överförs till PB i 5 ml centrifugrör för dissociation. C) Apparaten för hjärtisolering av embryon består av en spruta på 10 ml som är fäst vid en 19 G-nål monterad ovanför dissociationsröret på ett bänkstativ, så att händerna kan utföra triturationen. (D) Bild av det isolerade hjärtat (dag 4) fäst vid en patch-klämpipett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa patch-clamp-inspelningar från isolerade zebrafisk kardiovaskulära vävnader. (A, B) ATP-känsliga KATP-kanaler inifrån och ut utskurna patch-clamp-inspelningar av förmaks- (A) och ventrikulära (B) kardiomyocyter isolerade från vuxna zebrafiskar. (C) K ATP-kanalkonduktans registrerades från helcellspatch-fastspänning av VSM-celler isolerade från vuxna zebrafiskar. (D) Enkel K+-kanalaktivitet i membranplåster som skärs ut från zebrafiskens embryonala hjärtan (4 dpf). Alla utskurna patchinspelningar gjordes med 140 mM KCl på båda sidor av membranet, med -50 mV membranpotential. Helcellsströmmar registrerades med membranpotentialen fastklämd vid -70 mV. (E) Exempel på inspelning av strömklämma från isolerad ventrikulär myocyt. Åtgärdspotentialer stimulerades av aktuell injektion som visas nedan. (F) Exempel på registrering av strömklämmor från isolerad förmaksmyocyt som visar spontan åtgärdspotentialavfyrning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PERFUSIONSBUFFERT (PB) | 10 mM HEPES, 30 mM Taurin, 5,5 mM Glukos, 10 mM BDM. Gör lösningen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), justera pH till 7,4 | ||
| RÖTNINGSBUFFERT (DB) | PB + 12,5 μM CaCl2 + 5 mg/ml Col II + 5 mg/ml Col IV + 5 ng/ml insulin | ||
| STOPPA BUFFERT (SB) | PB + 10% FBS + 12,5 μM CaCl2 + 10 mg/ml BSA + 5 ng/ml Insulin | ||
Tabell 1: Lösningar för isolering av zebrafiskkardiomyocyter.
| S1-BUFFERT | 0,1% BSA (w/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glukos, 0,05 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, justerat till pH7,4 med NaOH | ||
| S2-BUFFERT | 2 ml S1, 4 mg Papain, 2 mg DTT | ||
| S3-BUFFERT | 2 ml S1, 3 mg kollagenas typ H, 2 mg trypsinhämmare, 1 mg elastas | ||
Tabell 2: Lösningar för isolering av zebrafisk VSM-celler.
| Ventrikulära myocyter (n = 3 inspelningar) | |||
| Vm (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) | |
| -75,7 ± 3,9 | -119.6 ± 3.8 | 329 ± 163 | |
| Förmaksmyocyter (n = 3 inspelningar) | |||
| AP-kurs (min-1) | MDP (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) |
| 107,3 ± 32,6 | -71,2 ± 5,1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Tabell 3: Åtgärdspotentialegenskaper från isolerade zebrafiskkardiomyocyter. Inspelad i aktuellt klämläge. Data som visas som medelvärde ± S.D. Vm = membranpotential; APA = åtgärdspotentialamplitud; APD50 = varaktighet av åtgärdspotential till 50% repolarisering; MDP = maximal diastolisk potential.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare metoder för att isolera zebrafiskkammarmyocyter5,6, som syftade till att generera myocyter för odling eller elektrofysiologiska studier, gav celler med lägre utbyte och involverade långa steg med flera centrifugeringar som påverkade cellkvaliteten och livskraften negativt. Protokollen som beskrivs här är tillförlitliga, täcker var och en av de signifikanta kardiovaskulära vävnaderna (ventrikel, atria och VSM), och viktigare är ganska praktiska för akut isolering av levande celler. Isoleringsmetoder som involverar kanylering av ventrikeln via BA13 kan vara ett sofistikerat alternativ för ventrikulära kardiomyocyter men kräver en högre grad av fingerfärdighet och kan påverka förmaksisoleringen negativt. Det tillvägagångssätt som beskrivs i det nuvarande protokollet ger ett enkelt och effektivt alternativ.
Ytterligare överväganden för isolering av larvhjärtvävnad är: (1) I steg 1.4, beroende på fiskens ålder och tillgängliga förstoring, kan vävnaderna vara synliga redan innan bröstmusklerna tas bort, i vilket fall vävnaderna direkt kan "plockas" ur fisken utan föregående operation, och sedan kan vävnaderna som inte är CV avlägsnas med superfina pincett; (2) I steg 2.2, för larver yngre än 14 dagar, kan hjärtan användas direkt för elektrofysiologiska studier utan behov av enzymatisk dissociation.
Som nämnts ovan, och vanligtvis sant för enzymatiska dissociationsmetoder i allmänhet, har det visat sig viktigt att använda färska buffertar och enzymer varje gång. Perfusionsbuffert (PB) och S1-buffert kan dock beredas i förväg och lagras vid 4-8 °C i 1 månad.
Framgångsrik vävnadsisoleringstid bör inte överstiga ~ 90 s per fisk, och vävnader bör inte utsättas för luft. När dissociationen tar längre tid reduceras cellkvaliteten (dvs. överlevnaden). Vid triturering av vävnader bör man se till att undvika att generera luftbubblor, vilket också minskar cellkvaliteten. VSM-cellisolering är känslig för matsmältningen genom kollagenas i S3-buffert. Efter de första 3 minuterna av matsmältningen ska röret tas ut ur termoshakern varje minut och undersökas för flytande dilaterade och genomskinliga vävnader. När vävnadsfragmentering är uppenbar bör matsmältningssteget upphöra.
Det är viktigt att notera att dessa protokoll inte är omfattande optimerade för att isolera kalciumtoleranta kardiomyocyter, vilket skulle krävas för kontraktilitetsstudier. Som visat kan emellertid tillförlitlig registrering av kardiomyocytverkanspotentialer uppnås i närvaro av fysiologiska extracellulära kalciumkoncentrationer 7,14. Blebbistatin, inkluderat för att frikoppla excitation och sammandragning, och förbättra giga-Ohm-tätningsbildning och registreringseffektivitet i dessa experiment, har tidigare visat sig inte signifikant påverka AP-parametrarna i intakta zebrafiskhjärtan14. För elektrofysiologi är det absoluta utbytet av celler inte heller rutinmässigt hastighetsbegränsande. Detta protokoll har inte optimerats för avkastning, vilket kan vara nödvändigt för biokemiska studier av isolerade celler. Ändå är utbytet som uppnås med dessa metoder väl lämpat för elektrofysiologiska studier och sannolikt flera andra tillvägagångssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag HL140024 till CGN och HL150277 till CMC. Figur 1 och figur 2 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
