Summary
本文报道了通过腹部手术和睾丸注射GSK923295对CENP-E的 体内 抑制，这是男性减数分裂的宝贵模型。使用免疫荧光，流式细胞术和透射电子显微镜测定，我们发现CENP-E抑制导致小鼠精子细胞中的染色体错位和基因组不稳定。
Abstract
在真核生物中，减数分裂对于有性生殖的基因组稳定性和遗传多样性至关重要。睾丸中精子细胞的实验分析对于研究男性减数分裂中的纺锤体组装和染色体分离至关重要。小鼠精子细胞是减数分裂机制研究的理想模型，然而，缺乏分析精子细胞的有效方法。本文报道了一种实用有效的小鼠精子细胞体内抑制驱动蛋白-7 CENP-E的方法。介绍了在3周龄小鼠中通过腹部手术GSK923295睾丸注射特定抑制剂的详细程序。此外，这里描述的是一系列用于组织收集和固定、苏木精-伊红染色、免疫荧光、流式细胞术和透射电子显微镜的方案。在这里，我们提出了一种通过腹部手术和睾丸注射的体内抑制模型，这可能是研究男性减数分裂的强大技术。我们还证明，在减数分裂I期间，CENP-E抑制导致原代精细胞的染色体错位和中期停滞。我们的体内抑制方法将促进减数分裂的机制研究，作为雄性生殖系遗传修饰的有用方法，并为未来的临床应用提供启示。
Introduction
减数分裂是真核生物中最重要、高度刚性、进化保守的事件之一，对配子发生、有性生殖、基因组完整性和遗传多样性至关重要1,2,3。在哺乳动物中，生殖细胞在单轮DNA复制后经历两次连续的细胞分裂，即减数分裂I和II。与有丝分裂中的姐妹染色单体不同，重复的同源染色体在减数分裂I 4,5期间配对并分离成两个子细胞。在减数分裂II中，姐妹染色单体拉开并分离形成单倍体配子，没有DNA复制6。两个减数分裂中的任何一个的错误，包括纺锤体组装缺陷和染色体偏置，都可能导致配子丢失、不育或非整倍体综合征 7,8,9。
越来越多的研究表明，驱动蛋白家族马达在有丝分裂和减数分裂细胞的染色体排列和分离、纺锤体组装、细胞分裂和细胞周期进展的调节中起着至关重要的作用10,11,12。Kinesin-7 CENP-E（着丝粒蛋白E）是染色体分裂13,14,15,16,17,18中染色体聚集，染色体运输和对齐以及纺锤体组装检查点调节所需的正端导向动粒马达。在减数分裂过程中，特异性抑制剂GSK923295的CENP-E抑制导致生精细胞的细胞周期停滞，染色体错位，纺锤体紊乱和基因组不稳定19。CENP-E在分裂精子细胞着丝粒处的定位模式和动力学表明，在减数分裂I20,21期间，CENP-E与动粒蛋白相互作用，以实现着丝粒的顺序组装。在卵母细胞中，CENP-E是染色体排列和减数分裂I13,22,23完成所必需的。抗体或吗啉基注射CENP-E导致小鼠和果蝇卵母细胞中的染色体错位，运动体方向异常和减数分裂I停滞23。与CENP-E在有丝分裂中的重要作用相比，CENP-E在减数分裂中的功能和机制在很大程度上仍然未知。CENP-E在雄性减数分裂细胞染色体聚集和基因组稳定性中的详细机制仍有待阐明。
精子发生是一个复杂而持久的生理过程，涉及顺序精子增殖、减数分裂和精子发生。因此，整个过程在哺乳动物和其他物种中体外复制是非常困难的24,25。在体外厚皮期后诱导精子细胞分化是不可能的。对男性减数分裂的研究一般仅限于早期减数分裂前期25,26的实验分析。尽管有许多技术努力，包括精子细胞的短期培养27,28和器官培养方法25，但研究男性减数分裂的有效方法很少。此外，必需基因的基因缺失通常会导致发育停滞和胚胎致死。例如，缺乏CENP-E的小鼠胚胎无法植入并且不能发展过去植入29，这是CENP-E在减数分裂中的机制研究的障碍。综上所述，建立切实可行的男性减数分裂研究体系，可以极大地促进减数分裂的研究领域。
小细胞渗透性抑制剂是研究细胞分裂和发育过程中驱动蛋白马达的有力工具。变构抑制剂GSK923295特异性结合CENP-E运动域，阻断ADP（二磷酸腺苷）的释放，最终稳定CENP-E与微管之间的相互作用30。在这项研究中，通过腹部手术和睾丸注射GSK923295提出了体内抑制小鼠模型。CENP-E抑制导致原代精细胞中期I的染色体错位。此外，CENP-E抑制导致精子细胞的减数分裂停滞和精子发生的破坏。描述了一系列用于分析精子细胞的方案，可用于观察精子细胞中的减数分裂纺锤体微管、同源染色体和亚细胞器。我们的体内抑制法是研究减数分裂和精子发生的有效方法。
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Protocol
所有动物实验均由福建医科大学动物护理与使用委员会审查和批准（实验方案编号SYXK 2016-0007）。所有小鼠实验均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用的相关指南（NIH出版物编号8023,1978年修订）进行。
1. GSK923295介导的CENP-E抑制小鼠模型的构建
- 在121°C下对手术器械进行灭菌30分钟。用紫外线C（UVC）照射手术超净工作台2小时。称量用于实验的3周龄雄性ICR（癌症研究所）小鼠，并计算所需的麻醉剂剂量。
- 通过腹膜内注射施用氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）的组合来麻醉小鼠。通过小鼠角膜反射，伤害性反射，呼吸以及肌肉张力的组合检查小鼠的麻醉深度。确认小鼠已深度麻醉。
注意：将动物放在加热垫上，以在手术过程中提供热支持。 - 将鼠标四肢绑起来并固定在蜡盘上。将一滴兽医软膏滴在小鼠眼睛上，以防止麻醉时干燥。使用实验动物剃须刀将小鼠的腹毛从下腹部剃到阴囊。用无菌窗帘固定手术区域。
- 用Betadine磨砂膏对腹腹部进行消毒，然后用75%乙醇消毒三次。使用无菌手术刀打开腹腔并开<5毫米。
- 用无菌手术夹夹住皮肤，并用无菌夹钳拉附睾脂肪垫，以使用无菌镊子定位睾丸。在立体镜下用无菌镊子固定睾丸，并使用 10 μL 流湿 30 以终浓度 10 μM 缓慢将10 μL GSK923295注入生精小管中。对于对照组的构建，注入10μL的1%DMSO（二甲基亚砜）/ PBS（磷酸盐缓冲盐水）溶液。
注意：将GSK923295溶液以10mM的浓度储存在-80°C。 将 0.1 μL 的 10 mM GSK923295溶解到 100 μL PBS 溶液中，以制备 10 μM 的GSK923295溶液。 - 用无菌手术钳轻轻地将睾丸推回腹腔。使用直径为0.1毫米的缝合线用两到四针分别缝合腹膜和皮肤。
- 腹部手术后，用永久性记号笔在动物背部标记一个 3 x 3 毫米的地方，将小鼠放回饲养笼，并确保清洁和无病原体的环境，有足够的食物和水。
- 通过过滤的空气、灭菌的食物和水保持环境处于无菌状态。照顾动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。对于术后镇痛，每12小时皮下注射一剂丁丙诺啡（0.1mg / kg），持续3天。确保在完全恢复之前不会将鼠标归还给其他动物。
注意：给予小鼠术后护理，并在必要时使用0.5%利多卡因适当地给予伤口局部麻醉，以减轻术后疼痛。
2. 苏木精-伊红（HE）染色和组织病理学
- 腹部手术后四天，在CO2室中以2L / min的流速对小鼠实施安乐死。确认颈椎脱位死亡作为安乐死的确认方法。使用手术剪刀打开阴囊，用镊子取出睾丸。注射后4天收集小鼠睾丸GSK923295并将其固定在室温下的30mL 10%甲醛溶液中12小时。
- 对于梯度脱水，依次将样品在 40 mL 70% 乙醇中孵育 1 小时，在 40 mL 85% 乙醇中孵育 1 小时，在 40 mL 95% 乙醇中孵育 1 小时，在 40 mL 100% 乙醇中孵育 1 小时。
- 将样品在40mL二甲苯中孵育40分钟，然后在65°C下在40mL石蜡中孵育1小时。 将纸巾放在包埋盒的底部。将融化的石蜡加入包埋盒中。冷却组织以在4°C下完全凝固6小时。
- 将样品固定在超薄切片机的支架上，将样品与刀表面之间的角度保持在5-10°，并将切片厚度调整为5μm。使用超薄切片机制备5μm厚的切片，将载玻片铺在40°C的水浴中，并在载玻片干燥器中在37°C下干燥12小时。
- 将载玻片在 200 mL 二甲苯中孵育 40 分钟，在 200 mL 100% 乙醇中孵育 6 分钟，在 200 mL 95% 乙醇中孵育 2 分钟，在 200 mL 90% 乙醇中孵育 2 分钟，在 200 mL 70% 乙醇中孵育 2 分钟， 分别。
- 在蒸馏水中冲洗载玻片5分钟，并在室温下用Mayer苏木精溶液染色6分钟。
注意：Mayer苏木精溶液：0.011摩尔/升苏木精，6.7%无水乙醇，0.646mol/L硫酸铝钾和0.003摩尔/升碘酸钠。 - 在流水中冲洗载玻片5分钟，然后用蒸馏水孵育2分钟。
- 将载玻片在1%乙醇盐酸盐中孵育3秒，然后在流水中冲洗2分钟。
- 用1%伊红对样品染色15秒，然后用95%乙醇孵育5秒，用100%乙醇孵育2分钟，在二甲苯中孵育40分钟。
- 使用 15 μL 中性口香糖和 24 x 50 mm 盖玻片密封载玻片。
3. 免疫荧光和共聚焦显微镜
- 收集小鼠睾丸的5μm厚的石蜡切片以进行免疫荧光。将载玻片在二甲苯中孵育40分钟，在100%乙醇中孵育6分钟，在95%乙醇中孵育2分钟，在90%乙醇中孵育2分钟，在80%乙醇中孵育2分钟，在70%乙醇中孵育2分钟。在蒸馏水中冲洗载玻片5分钟，并用0.01M PBS冲洗载玻片5分钟。
- 将载玻片放入抗原修复溶液（0.01M柠檬酸盐缓冲液）中，并使用高压锅在高压下煮沸4分钟以进行抗原修复。将载玻片自然冷却至室温。用蒸馏水冲洗5分钟两次，用PBS冲洗5分钟。
注意：0.01 M 柠檬酸盐缓冲液 （pH 6.0）：2.1 mmol/L 柠檬酸，11.6 mmol/L 柠檬酸三钠二水合物。 - 通过将载玻片在 500 μL 0.25% TritonX-100/PBS 中孵育 10 分钟来透化细胞。用PBS冲洗载玻片5分钟三次。
- 对于抗原阻断，将样品与 300 μL 3% 牛血清白蛋白 （BSA）/PBST（PBS 中的 0.1% 吐温-20）孵育 1 小时。将样品与一抗在3%BSA / PBST中在4°C下孵育16小时。 将载玻片放入加湿的盒子中，以防止纸巾变干。将载玻片自然重新加热至室温30分钟。
- 丢弃一抗，然后在PBST中冲洗载片5分钟三次。在 3% BSA/PBST 中稀释二抗。将样品与二抗在37°C孵育1-2小时。 将样品在PBST中冲洗5分钟五次。
- 在室温下用 50 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 对细胞核染色 5 分钟。用防褪色安装介质安装盖玻片，并用指甲油密封盖玻片。
- 使用配备NA 40x/ 0.75物镜的荧光显微镜观察并记录载玻片中的荧光信号。
4. 流式细胞术
- 在6厘米培养皿中收集小鼠睾丸，并使用手术剪刀将睾丸切成1毫米3 块。
- 在1.5mL离心管中使用1mL的1%胶原酶在37°C下消化睾丸10分钟，然后以1,000× g 离心样品5分钟以沉淀生精细胞。
- 弃去上清液，然后在37°C下加入1mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液20分钟，然后将样品以1,000× g 离心5分钟。
- 弃去上清液，然后将沉淀的细胞与1mL的70%冷乙醇在4°C孵育8小时以上。
- 将样品以1,000 x g 离心5分钟，然后收集细胞沉积物。用500μL碘化丙啶（PI）染色溶液（50μg/ mL PI，100μg/ mLRNase A和PBS中的0.2%Triton X-100）在37°C下染色生精细胞30分钟。
注意：每5分钟轻轻摇动离心管以避免细胞聚集。 - 使用300目筛过滤样品以去除细胞碎片;将细胞收集在流管中并将其储存在4°C。
- 使用流式细胞仪检测激发波长为 488 nm 的荧光信号和光散射。使用 Modfit MFLT32 软件分析 DNA 含量和光散射。
5. 透射电子显微镜
- 使用锋利的手术刀将睾丸切成1mm 3块，并在4°C下快速将样品与3 %戊二醛-1.5%多聚甲醛溶液在0.1M PBS（pH 7.2）中孵育4小时，以避免超微结构的变化。用0.1M PBS冲洗样品5分钟三次。
注意：手术刀和剪刀应锋利，并尽量避免人为挤压和拉扯。样品的处理应在固定液中进行。 - 将样品固定在4°C的1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾溶液中1.5小时。用滤纸擦干水，用0.1M PBS冲洗样品5分钟三次。
- 将样品在4°C的40mL 50%乙醇中脱水10分钟。 将样品在40mL的70%乙醇饱和乙酸铀染料中在4°C孵育12小时，在4°C下在40mL的90%乙醇中孵育10分钟，在40mL的90%乙醇 - 丙酮中在室温下孵育10分钟，在40mL无水丙酮中孵育10分钟在室温下三次。
- 将样品在无水丙酮 - 环氧树脂618包埋剂（v / v = 1：1）混合物中孵育1.5小时，然后将样品包埋在35°C的环氧树脂618包埋剂中3小时。
- 对于树脂聚合，将样品在环氧树脂618包埋剂中在35°C孵育12小时，在45°C孵育12小时，然后在60°C孵育24小时。
- 安装样品和玻璃刀，然后调整样品和刀之间的距离。使用超薄切片机制备 90 nm 厚的超薄切片。以恒定速度切片样品，然后将载玻片放在镍网上。将载玻片置于室温下的培养皿中。
- 用2%乙酸铀酰对载玻片染色10分钟，然后用2%柠檬酸铅染色样品10分钟。用蒸馏水冲洗载玻片。在室温下将载玻片干燥24小时。
- 观察载玻片并使用透射电子显微镜在70-100 kV下记录电子图像。
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Representative Results
通过腹部手术和睾丸注射GSK923295 19，成功构建了小鼠睾丸体内CENP-E抑制模型。该方法的关键技术步骤如图1所示。睾丸注射GSK923295 4天后，收获睾丸进行进一步分析。在对照组中，生精小管中的生精波是规则且有组织的（图2A）。然而，在GSK923295组中，生精波在生精小管中发生改变，并且在CENP-E抑制后中期停滞的原代精子细胞显着增加（图2B-D）。重要的是，在CENP-E抑制后，几条同源染色体在赤道板上没有对齐（图2B-D）。此外，CENP-E抑制也导致生精小管中中期I精子细胞的增加（图2E，F，G）。综上所述，CENP-E抑制导致减数分裂I期间原代精子细胞的染色体错位，这表明CENP-E负责减数分裂中染色体的聚集和精子细胞的排列。
为了进一步验证这些结果，我们进行了免疫荧光测定以检测生精小管中的生精细胞。我们发现，对照组显示的常规生精波在GSK923295组中发生了明显的变化并变得不规则（图3）。分裂精子细胞的减数分裂纺锤体用抗α-微管蛋白抗体标记，精子细胞中突触复合物的横丝用抗突触复合蛋白3（SYCP3）抗体标记（图3A）。CENP-E抑制后，每个生精小管的SYCP3阳性细胞减少（图3B）。同时，CENP-E抑制后，每个中期细胞的SYCP3点未被破坏（图3C）。此外，每个细胞的SYCP3拉伸在GSK92395组中也没有受到影响（图3D）。引人注目的是，我们发现在CENP-E抑制后，中期I精子细胞中纺锤形极的距离增加（图3E，F）。这些免疫荧光结果表明，CENP-E是染色体错位和精子发生过程所必需的，对于维持双极纺锤体和减数分裂纺锤体的组织是必不可少的。
为了研究小鼠睾丸中的细胞群，我们消化睾丸并进行PI染色和流式细胞术测定（图4）。重要的技术程序如图4A-C所示。生精细胞由几个细胞群组成，包括精原细胞、原代精细胞、次级精细胞、精单体和精子。这些生精细胞的DNA含量如图4A所示。我们证明CENP-E抑制导致单倍体细胞从对照组的42.95±1.09%减少到GSK923295组的38.26±1.86%（图4B-D）。CENP-E抑制后，二倍体细胞和非整倍体细胞的比例没有显着影响（图4E，F）。此外，四倍体细胞的比例从对照组的17.76±1.52%增加到GSK923295组的28.88±2.05%（图4G）。综上所述，我们发现生精细胞的细胞群在CENP-E抑制后略有改变。CENP-E抑制导致单倍体细胞减少，四倍体细胞增加，表明CENP-E抑制与分裂精子细胞中期停滞有关。
此外，我们使用透射电子显微镜观察了生精细胞的亚微观结构（图5）。精子细胞的染色质组织、内质网和线粒体如图 5所示。我们发现GSK923295组中生精细胞的组织略有中断（图5）。
图1：通过腹部手术和睾丸给药建立小鼠睾丸体内抑制模型。 （A）腹部手术中使用的所有手术器械。1）解剖剪刀，2）针钳，3）直钳，4）钳子，5）流湿，6）1毫升注射器，7）带3号手柄和11号刀片的手术刀，8）针状体，9）圆形缝合针，1/2 0.6 x 14毫米，1/2 0.7 x 17毫米，10）乙醇拭子。（B）麻醉后，将小鼠仰卧放在蜡盘上，制备下腹部并用75%乙醇消毒。（C）在下腹部中间开了一个<5毫米的开口。（D）用无菌夹钳拉附睾脂肪垫以定位睾丸。使用10μL流湿药注射10μL GSK923295睾丸。（E）腹膜和皮肤同时缝合两针。（F）伤口用75%乙醇消毒。请点击此处查看此图的大图。
图2：CENP-E抑制导致小鼠精子细胞中减数分裂I和染色体错位的停滞 。 （A）对照组中生精细胞的HE染色。箭头表示精子细胞。（B）GSK923295组中生精细胞的HE染色。睾丸以终浓度10μM注射GSK923295 4天。箭头表示精子细胞中的染色体错位。对于所有图像，比例尺，10 μm。 （C）生精小管中中期精子细胞的比例。控制，13.43±1.68%;GSK923295,42.29±3.94%。分析N = 1308个细胞。组 = 4。学生的 t检验。误差线，表示± SEM. ****， P < 0.001。（D）生精小管与分裂精子细胞的比例。控制，5.38±2.64%;GSK923295,33.96±3.87%。分析N = 151个生精小管。组 = 4。（E）对照组和GSK923295组中组蛋白H3（磷酸化Ser 10）和TUBA4A的免疫荧光图像。大号4A，红色;组蛋白H3（磷酸化Ser 10），绿色;DAPI，蓝色。比例尺，10 μm。放大的框将缩放。（F）生精小管中中期细胞数量的量化。控制，11.45 ± 1.55;GSK923295,18.91 ± 2.36。N = 11。（G，H）对照组（G）和GSK923295组（H）中期I精子细胞中组蛋白H3和TUBA4A荧光强度的线扫描分析。大号4A，红色;组蛋白H3（磷酸化Ser 10），绿色;DAPI，蓝色。X 轴表示相对距离。Y 轴表示荧光强度。学生的 t检验。误差线，平均±扫描电镜* ，P < 0.05; ***， P < 0.001. 请点击此处查看此图的大图。
图3：GSK923295的CENP-E抑制导致生精小管的紊乱和精子发生的破坏 。 （A）对照组和GSK923295组中SYCP3和TUBA4A的代表性免疫荧光图像。SYCP3，红色;大号4A，绿色;DAPI，蓝色。比例尺，10 μm。 （B）对照组和GSK923295组中每个生精小管的SYCP3阳性细胞。控制，56.00 ± 5.43%;GSK923295,39.00±1.73%。N = 10。（C）每个中期细胞的SYCP3点的定量。控制，10.00 ± 1.02;GSK923295， 9.71 ± 0.86， N = 7.（D）对照组和GSK923295组中每个细胞的SYCP3拉伸的定量。控制，8.63 ± 0.22;GSK923295,8.21±0.21。N = 19。（E）中期I期精子细胞中纺锤形极的距离分析。控制，8.20±0.28μm;GSK923295,9.30 ± 0.29 μm. N = 30。（F）对照组和GSK923295组生精小管的免疫荧光图像。箭头表示精子细胞。DAPI，绿色;β-微管蛋白，绿色。虚线框的放大图像显示在缩放中。对于所有图像，比例尺，10 μm。 学生的 t 检验。误差线，平均±扫描电镜，P > 0.05; **， P < 0.01。 请点击此处查看此图的大图。
图4：小鼠睾丸中生精细胞的流式细胞术分析 。 （A）小鼠生精细胞细胞周期分析关键步骤的示意图。二倍体精子细胞经历减数分裂I和II以形成单倍体精子。C值表示DNA含量。N 值（倍性）表示染色体组的数量。（乙，丙）对照组（B）和GSK923295组（C）中生精细胞的流式细胞术分析。对于 体内 CENP-E抑制，GSK923295以10μM的终浓度注射到3周龄雄性ICR小鼠睾丸中4天。对于细胞周期分析，测量和分析n = 3,000个细胞。P4，单倍体细胞（1C）。P5，二倍体细胞（2C）。P6，四倍体细胞（4C）。（D）对照组和GSK923295组中单倍体细胞的比例。控制，42.95±1.09%;GSK923295,38.26±1.86%。N = 8。（E）对照组和GSK923295组中二倍体细胞的比率。控制，20.10 ± 0.91%;GSK923295,17.95±0.81%。N = 8。（F）对照组和GSK923295组中非整倍体细胞（2C~4C）的比例。控制，3.41±0.23%;GSK923295,3.39±0.25%。N = 8。（G）对照组和GSK923295组中四倍体细胞的比例。控制，17.76 ± 1.52%;GSK923295,28.88±2.05%。N = 8。对于所有图形，学生的 t 检验。误差线， 平均±扫描电镜， P > 0.05;*， P < 0.05;， P < 0.001. 请点击此处查看此图的大图。
图5：对照组和GSK923295组中生精细胞的电子显微镜分析 。 （A）对照组中生精小管的代表性图像。比例尺，5μm。 （B）精子细胞核的放大图像。箭头表示精细胞的同源染色质。比例尺，1μm。 （C）精子细胞质的放大图像。比例尺，1 μm。 （D）GSK923295组中生精小管的代表性图像。睾丸用10μM GSK923295处理4天。比例尺，5μm。 （E）GSK923295组中精子细胞核的放大图像。比例尺，1μm。 （F）GSK923295组中精子细胞质的放大图像。比例尺，1 μm。对于所有图形，sc，精子细胞;SD，精子。ER，内质网;山，线粒体。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在这项研究中，我们利用腹部手术和显微注射GSK923295建立了小鼠睾丸体内CENP-E抑制模型。本研究中使用的腹部手术和睾丸注射方法具有以下优点。首先，它不仅限于小鼠的年龄。实验者可以在早期阶段进行睾丸注射，例如，在3周龄或更年轻的小鼠身上。其次，GSK923295对CENP-E具有特异性和优异的抑制作用。第三，该方法操作简单，可重复性高。此外，睾丸的完整性得以保持，这适用于在器官背景下研究完整组织。
该协议中有几个关键步骤。例如，在腹部手术期间保持无菌环境对于预防术后感染很重要31.此外，对于不同年龄或不同实验动物的小鼠，应根据睾丸的大小和药物的有效性适当调整注射量19,32。此外，在流式细胞术期间测定单细胞和随后的细胞群测试需要适当的消化时间和显微镜观察。但是，此协议中存在一些限制。当小鼠年龄小于2周龄时，很难使用腹部手术来构建小鼠模型。主要原因是小鼠年龄太小，术后饮食困难，存活率低。动物模型中使用的药物是液体的，具有易穿透细胞膜19,32,33的特点，适用于该给药方法的应用。
体 外 细胞培养和基因敲除研究刺激了减数分裂的理解，然而，它不容易应用于哺乳动物精子细胞28。男性减数分裂机制研究的障碍是缺乏适当的系统来操纵和观察减数分裂中的精子细胞27。小鼠是研究精子发生过程中减数分裂的细胞和分子机制的优秀模式生物。第一波小鼠精子细胞在产后第10天（dpp）开始减数分裂，并在35 dpp发育为成熟精子，这为减数分裂和精子发生研究提供了发育时间窗口34。
睾丸注射，包括通过阴囊直接注射和通过腹部手术进行显微注射，是研究精子发生的有用技术35,36。通过阴囊直接注射快速简单，仅引起轻微的手术创伤，适用于睾丸下降到阴囊的4周龄或以上的小鼠。然而，不可能注射3周龄或更年轻小鼠的未降睾丸。通过腹膜内手术或阴囊手术进行显微注射适用于未降睾丸的注射，这需要熟练的手术技巧的实验操作人员，体视显微镜以及手术和实验室设备。按注射部位分显微注射可分为精小管注射、睾丸网注射和睾丸间质注射。与其他基于注射的睾丸模型相比，通过腹部手术注射抑制剂可以有效抑制蛋白质的功能，具有细胞膜穿透、操作简便、长期抑制等优点19,32。使用siRNA、反义寡核苷酸或慢病毒的方法在细胞膜渗透效率低、脱靶副作用以及siRNA或寡核苷酸在体内易降解等方面具有较大的局限性37,38,39,40。
活组织中的减数分裂比培养条件下的减数分裂更复杂，其中应考虑体内的组织结构，发育信号和环境因素41。先前的研究表明，培养基和细胞自主因子对于刺激减数分裂期的开始至关重要。例如，磷酸酶抑制剂冈田酸（OA）42、精细胞特异性组蛋白HIST1H1T43、拓扑异构酶II44和中期促进因子（MPF）45促进培养的精子细胞中的G2/MI转变。这些复杂的培养条件和因素导致了精子细胞短期培养的局限性。
将质粒DNA直接注射到睾丸中成功地应用于睾丸介导的基因转移和转基因小鼠的生产32,46。体内电穿孔涉及将DNA表达质粒注射到生精小管的管腔中，然后利用一系列电脉冲改变细胞膜通透性，提高转基因表达效率，并进行基因修饰45,46,47,48,49。我们的方法可以与体内电穿孔以及荧光标记蛋白和基因编辑工具相结合，使这种方法在组织和器官生理背景下分析男性减数分裂方面更加强大。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢福建医科大学细胞骨架实验室的所有成员的有益讨论。感谢福建医科大学公共技术服务中心林俊进在流式细胞术方面的技术支持。感谢福建医科大学公共技术服务中心电子显微镜实验室的吴明霞和周林英在电子显微镜方面的技术援助。感谢福建医科大学基础医学实验教学中心的郑思义、林颖、祁珂、宋军的支持。本研究得到了以下资助：国家自然科学基金（批准号82001608），中国福建省自然科学基金（批准号2019J05071），福建省卫生技术项目（批准号2018-1-69），福建医科大学科研启动基金（批准号2017XQ1001），福建医科大学高层次人才科研启动资金项目（批准号XRCZX2017025）和研究项目中医研究生网上教育与教学（资助号B-YXC20200202-06）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
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