Therapeutische Bewertung der fäkalen Mikrobiota-Transplantation in einem Interleukin-10-defizienten Mausmodell

Summary

Das Zusammenspiel von genetischer Anfälligkeit, Schleimhautimmunität und mikroökologischem Darmmilieu ist an der Pathogenese entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) beteiligt. In dieser Studie wandten wir die fäkale Mikrobiota-Transplantation bei IL-10-defizienten Mäusen an und untersuchten ihre Auswirkungen auf Dickdarmentzündungen und Herzfunktion.

Abstract

Mit der Entwicklung der Mikroökologie in den letzten Jahren hat der Zusammenhang zwischen Darmbakterien und entzündlichen Darmerkrankungen (CED) erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass dysbiotische Mikrobiota eine aktive Rolle bei der Auslösung oder Verschlechterung des Entzündungsprozesses bei IBD spielt und dass die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) eine attraktive therapeutische Strategie ist, da die Übertragung einer gesunden Mikrobiota auf IBD-Patienten die entsprechende Wirt-Mikrobiota-Kommunikation wiederherstellen könnte. Die molekularen Mechanismen sind jedoch unklar und die Wirksamkeit von FMT ist nicht sehr gut belegt. Daher sind weitere Studien in Tiermodellen der IBD notwendig. In dieser Methode wandten wir FMT von Wildtyp-C57BL / 6J-Mäusen auf IL-10-defiziente Mäuse an, ein weit verbreitetes Mausmodell für Colitis. Die Studie befasst sich mit dem Sammeln von Kotpellets von den Spendermäusen, der Herstellung der Stuhllösung / -suspension, der Verabreichung der Stuhllösung und der Überwachung der Krankheit. Wir fanden heraus, dass FMT die kardiale Beeinträchtigung bei IL-10-Knockout-Mäusen signifikant milderte, was ihr therapeutisches Potenzial für das IBD-Management unterstreicht.

Introduction

Das menschliche Darmmikroökosystem ist äußerst komplex, mit mehr als 1000 Bakterienarten im Darm eines gesunden Menschen¹. Die Darmflora ist an der Aufrechterhaltung der normalen physiologischen Funktionen des Darms und der Immunantwort beteiligt und hat eine untrennbare Beziehung zum menschlichen Körper. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass das Darmmikrobiom das letzte menschliche Organ darstellt, das Teil des menschlichen Körpers ist, nicht nur eine Gruppe von Parasiten². Eine “gesunde” symbiotische Beziehung zwischen der Darmmikrobiota, ihren Metaboliten und dem im frühen Leben etablierten Immunsystem des Wirts ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase. Bei einigen abnormalen Zuständen wie chronischen Entzündungen stören Veränderungen in der inneren und äußeren Umgebung des Körpers die Darmhomöostase ernsthaft, was zu einem anhaltenden Ungleichgewicht der mikrobiellen Gemeinschaft des Darms führt, die als Dysbiose³ bezeichnet wird. Tatsächlich kann die Exposition gegenüber mehreren Umweltfaktoren, einschließlich Ernährung, Medikamenten und Krankheitserregern, zu Veränderungen in der Mikrobiota führen.

Dysbiose ist mit der Pathogenese einer Vielzahl von Darmerkrankungen verbunden, wie entzündliche Darmerkrankungen (IBD), Reizdarmsyndrom (IBS) und pseudomembranöse Enteritis, sowie eine wachsende Liste von extraintestinalen Erkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fettleibigkeit und Allergien⁴. Mikrobiota-Profiling zeigte, dass Patienten mit IBD eine dramatische Abnahme der bakteriellen Vielfalt sowie deutliche Veränderungen in den Populationen einiger spezifischer Bakterienstämme aufweisen ^5,6. Diese Studien zeigten weniger Lachnospiraceae und Bacteroidetes, sondern mehr Proteobakterien und Actinobakterien bei IBD-Patienten. Es wird angenommen, dass die Pathogenese von IBD mit verschiedenen pathogenen Faktoren zusammenhängt, einschließlich abnormaler Darmflora, dysregulierter Immunantwort, Umweltproblemen und genetischen Varianten⁷. Es gibt zahlreiche Hinweise darauf, dass Darmbakterien eine Rolle in der Anfangs- und Anwendungsphase von IBD^8,9 spielen^, was darauf hindeutet, dass die Korrektur der Darmdysbiose einen neuen Ansatz für die Therapie und/oder Erhaltungstherapie von IBD darstellen könnte.

Der Prototyp der fäkalen Mikrobiota-Transplantation (FMT) begann im alten China¹⁰. Im Jahr 1958 behandelten Dr. Eiseman und seine Kollegen erfolgreich vier Fälle von schwerer pseudomembranöser Enteritis mit Fäkalien von gesunden Spendern über Einläufe und eröffneten ein neues Kapitel in der modernen westlichen Medizin mit menschlichem Kot zur Behandlung menschlicher Krankheiten¹¹. Clostridium difficile-Infektion (CDI) hat sich als Hauptursache für pseudomembranöse Enteritis¹² erwiesen und FMT ist bei der Behandlung von CDI hochwirksam. In den letzten acht Jahren hat sich FMT zu einer Standardtherapie für die Behandlung von rezidivierendem CDI¹³ entwickelt, was zu weiteren Studien geführt hat, die die Rolle von FMT bei anderen Erkrankungen wie IBD untersuchen. In den letzten zwanzig Jahren haben zahlreiche Fallberichte und Kohortenstudien den Einsatz von FMT bei Patienten mit IBD¹⁴ dokumentiert. Eine Meta-Analyse, einschließlich 12 Studien, zeigte, dass 62% der Patienten mit Morbus Crohn (CD) eine klinische Remission nach FMT erreichten, und 69% der CD-Patienten hatten ein klinisches Ansprechen¹⁵. Trotz dieser ermutigenden Ergebnisse bleibt die Rolle von FMT bei der Behandlung von IBD ungewiss, und die Mechanismen, mit denen FMT Darmentzündungen lindert, sind kaum verstanden. Weitere Untersuchungen sind notwendig, bevor FMT sich dem aktuellen Arsenal von Behandlungsmöglichkeiten für IBD in den Kliniken anschließen kann.

In diesem Protokoll haben wir FMT auf IL-10-^/- Mäuse angewendet, die spontan nach dem Absetzen eine Kolitis entwickeln und als Goldstandard gedient haben, um die multifaktorielle Natur von IBD^16,17,18 widerzuspiegeln. IL-10−^/−-Mäuse wurden ausgiebig zur Analyse der IBD-Ätiologie eingesetzt, da sie ähnliche molekulare und histologische Merkmale wie CED-Patienten aufweisen und die Krankheit wie Patienten mit einer Anti-TNFα-Therapie gelindert werden kann¹⁶. Alternde IL10−^/−-Mäuse (>9 Monate alt) haben eine erhöhte Herzgröße und beeinträchtigte Herzfunktion im Vergleich zu altersentsprechenden Wildtyp-Mäusen¹⁹, was sie zu einem ausgezeichneten Modell für die Untersuchung von Colitis-induzierten Herzerkrankungen macht. Andere murine Modelle der Colitis, wie das Dextran-Natriumsulfat-Modell und das T-Zell-induzierte Colitis-Modell, können jedoch ebenfalls verwendet werden. Wir verabreichten fäkale Suspension über orale Gavage, die sich als wirksamer und besserer Weg als der Einlauf beim Menschen erwiesen^{hat 20}.

Protocol

Alle an Tieren durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas Medical Branch in Galveston genehmigt (Protokoll # 1512071A). 1. Sammlung von frischen Fäkalienpellets Bereiten Sie sterile Papiertücher, stumpfe Pinzetten und 50 ml konische Röhrchen vor.Einige Papierhandtücher und Pinzetten in separate Autoklavenbeutel geben und bei 180 °C bei trockener Hitze 30 min autoklavieren. Verwenden Sie auch s…

Representative Results

Wir führten eine gesunde Spender-FMT 3-mal (einmal im Monat für 3 Monate) an 2 Monate alten C57BL / 6J-Wildtyp- (WT) und IL-10-Knockout-Mäusen durch. Als Kotspender dienten altersgerechte C57BL/6J-Mäuse (Altersunterschied sollte <2 Monate betragen) und jedes Mal wurden frische Kotpellets verwendet. EIA-Assays zeigten, dass BNP im Plasma von IL-10-Mangelmäusen deutlich erhöht war und dass eine gesunde Spender-FMT den Anstieg der BNP-Spiegel signifikant abschwächte (Abbildung 1A, n = 5,…

Discussion

Als innovative Prüfbehandlung ist FMT in den letzten Jahren zu einem heißen Thema bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen geworden, da die Dysbiose der kommensalen Mikrobiota an der Pathogenese mehrerer menschlicher Krankheiten beteiligt ist, darunter IBD, Fettleibigkeit, Diabetes mellitus, Autismus, Herzerkrankungen und Krebs²⁶. Obwohl der Mechanismus nicht bestimmt wurde, wird angenommen, dass FMT funktioniert, indem es eine neue biologische Flora aufbaut und den Verlust von Restbakterie…

Materials

BD Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-829-10F
Blunt end forceps	Knipex	926443
Brain natriuretic peptide EIA kit	Sigma	RAB0386
C57BL/6J mice	Jackson Lab	000664
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Conical tubes	ThermoFisher	339650
Curved feeding Needles	Kent Scientific	FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer	Omni International	GLH-115
Glycerol	MilliporeSigma	G5516
IL-10 knockout mice	Jackson Lab	004366
Isoflurane	Piramal Critical care	NDC66794-017-10
USP normal saline	Grainger	6280
Vaporizer	Euthanex Corp.	EZ-108SA