Avaliação Terapêutica do Transplante de Microbiota Fecal em um Modelo de Camundongo deficiente interleucina

Summary

A interação da suscetibilidade genética, imunidade mucosa e ambiente microecológico intestinal está envolvida na patogênese da doença inflamatória intestinal (DII). Neste estudo, aplicamos o transplante de microbiota fecal em camundongos deficientes de IL-10 e investigamos seu impacto na inflamação cólon e na função cardíaca.

Abstract

Com o desenvolvimento da microecologia nos últimos anos, a relação entre bactérias intestinais e doença inflamatória intestinal (DIB) tem atraído considerável atenção. O acúmulo de evidências sugere que a microbiota disbiótica desempenha um papel ativo no desencadeamento ou agravamento do processo inflamatório no DIB e que o transplante de microbiota fecal (FMT) é uma estratégia terapêutica atraente, uma vez que a transferência de uma microbiota saudável para o paciente com IBD poderia restaurar a comunicação hospedeira-microbiota adequada. No entanto, os mecanismos moleculares não são claros, e a eficácia da FMT não foi muito bem estabelecida. Assim, são necessários estudos posteriores em modelos animais de DII. Neste método, aplicamos FMT de camundongos C57BL/6J do tipo selvagem em camundongos deficientes il-10, um modelo de colite de camundongos amplamente utilizado. O estudo elabora sobre a coleta de pelotas fecais dos camundongos doadores, fazendo a solução/suspensão fecal, administrando a solução fecal e monitorando a doença. Descobrimos que a FMT atenuou significativamente o comprometimento cardíaco em camundongos eliminatórios IL-10, sublinhando seu potencial terapêutico para o manejo do IBD.

Introduction

O microsistema intestinal humano é extremamente complexo, com mais de 1000 espécies de bactérias no intestino de uma pessoa saudável¹. A flora intestinal está envolvida na manutenção das funções fisiológicas normais do intestino e da resposta imune e tem uma relação inseparável com o corpo humano. O acúmulo de evidências sugere que o microbioma intestinal constitui o último órgão humano, que faz parte do corpo humano, não apenas um grupo de parasitas². Uma relação simbiótica “saudável” entre a microbiota intestinal, seus metabólitos e o sistema imunológico hospedeiro estabelecido no início da vida é fundamental para manter a homeostase intestinal. Em algumas condições anormais, como inflamação crônica, alterações no ambiente interno e externo do corpo interrompem seriamente a homeostase intestinal, resultando em um persistente desequilíbrio da comunidade microbiana do intestino, chamada disbiose³. De fato, a exposição a múltiplos fatores ambientais, incluindo dieta, drogas e patógenos, pode levar a mudanças na microbiota.

A disbiose está associada à patogênese de uma variedade de doenças intestinais, como doença inflamatória intestinal (DII), síndrome do intestino irritável (IBS) e enterite pseudomembrana, bem como uma lista crescente de distúrbios extra-intestinais, incluindo doenças cardiovasculares, obesidade e alergia⁴. O perfil da microbiota revelou que os pacientes com DIB têm uma redução drástica na diversidade bacteriana, bem como alterações acentuadas nas populações de algumas cepas bacterianas específicas ^5,6. Esses estudos demonstraram menos Lachnospiraceae e Bacteroidetes, mas mais Proteobacterias e Actinobacterias em pacientes com IBD. Acredita-se que a patogênese do DII está relacionada a vários fatores patogênicos, incluindo flora intestinal anormal, resposta imune desregulada, desafios ambientais e variantes genéticas⁷. Evidências abundantes sugerem que as bactérias intestinais desempenham um papel nas fases de iniciação e aplicação do IBD ^8,9, indicando que a correção da disbiose intestinal pode representar uma nova abordagem para a terapia e/ou tratamento de manutenção do DII.

O protótipo do transplante de microbiota fecal (FMT) começou na China^{antiga 10}. Em 1958, o Dr. Eiseman e seus colegas trataram com sucesso quatro casos de enterite pseudomembana grave com matéria fecal de doadores saudáveis via enema, abrindo um novo capítulo na medicina ocidental moderna usando fezes humanas para tratar doenças humanas¹¹. A infecção por clostridium difficile (CDI) tem sido a principal causa de enterite pseudomembrana¹² e a FMT é altamente eficaz no tratamento do CDI. Nos últimos oito anos, a FMT tornou-se uma terapia padrão de cuidado para o tratamento do CDI¹³ recorrente, o que levou a novos estudos que investigam o papel da TF em outros transtornos, como o DII. Nos últimos vinte anos, inúmeros relatos de casos e estudos de coorte documentaram o uso de FMT em pacientes com IBD¹⁴. Uma metanálise, incluindo 12 ensaios, mostrou que 62% dos pacientes com a doença de Crohn (CD) alcançaram remissão clínica após a FMT, e 69% dos pacientes com CD tiveram resposta clínica¹⁵. Apesar desses achados encorajadores, o papel da FMT na gestão do DIB permanece incerto, e os mecanismos pelos quais a FMT ameniza a inflamação intestinal são mal compreendidos. Novas investigações são necessárias para que a FMT possa se juntar ao armamento atual das opções de tratamento para o IBD nas clínicas.

Neste protocolo, aplicamos FMT em camundongos IL-10^-/- que desenvolvem colite espontaneamente após o desmamar e serviram como padrão-ouro para espelhar a natureza multifatorial do IBD 16,17,18. Os camundongos IL-10^−/− têm sido amplamente utilizados para dissecar a etiologia do IBD porque apresentam características moleculares e histológicas semelhantes aos pacientes com IBD, e, como pacientes, a doença pode ser amenizar com a terapia anti-TNFα¹⁶. Camundongos il10⁻⁻⁻ envelhecidos (>9 meses de idade) têm um aumento do tamanho do coração e função cardíaca prejudicada em comparação com camundongos do tipo selvagem^{de 19 anos}, tornando-se um excelente modelo para estudar doenças cardíacas induzidas pela colite. No entanto, outros modelos de colite murina, como o modelo de sulfato de sódio dextran e o modelo de colite induzida por células T, também podem ser usados. Administramos suspensão fecal via gavage oral, comprovadamente um caminho eficaz e melhor do que o enema em humanos²⁰.

Protocol

Todos os procedimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Filial Médica da Universidade do Texas em Galveston (Protocolo nº 1512071A). 1. Coleção de pelotas fecais frescas Prepare toalhas de papel estéreis, fórceps de ponta sem corte e tubos cônicos de 50 mL.Coloque algumas toalhas de papel e fórceps em sacos automáticos separados e autoclave-os a 180 °C em fogo seco por 30 minutos. Use t…

Representative Results

Realizamos doador saudável FMT 3 vezes (uma vez por mês durante 3 meses) em camundongos C57BL/6J de 2 meses de idade (WT) e il-10 knockout mice. Os camundongos C57BL/6J compatíveis com a idade (a diferença de idade deve ser de <2 meses) serviram como doadores fecais e pelotas fecais frescas foram usadas cada vez. Os ensaios do EIA revelaram que o BNP foi significativamente elevado no plasma de camundongos com deficiência de IL-10 e que o doador saudável FMT atenuou significativamente o aumento dos níveis de BNP (<…

Discussion

Como um tratamento investigativo inovador, a FMT tornou-se um tema quente no tratamento de diversos transtornos nos últimos anos, uma vez que a disbiose da microbiota commensal está implicada na patogênese de múltiplas doenças humanas, incluindo DII, obesidade, diabetes mellitus, autismo, doenças cardíacas e câncer²⁶. Embora o mecanismo não tenha sido determinado, acredita-se que a FMT funcione construindo uma nova flora biológica e prevenindo a perda de bactérias residuais. O método a…

Materials

BD Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-829-10F
Blunt end forceps	Knipex	926443
Brain natriuretic peptide EIA kit	Sigma	RAB0386
C57BL/6J mice	Jackson Lab	000664
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Conical tubes	ThermoFisher	339650
Curved feeding Needles	Kent Scientific	FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer	Omni International	GLH-115
Glycerol	MilliporeSigma	G5516
IL-10 knockout mice	Jackson Lab	004366
Isoflurane	Piramal Critical care	NDC66794-017-10
USP normal saline	Grainger	6280
Vaporizer	Euthanex Corp.	EZ-108SA