Терапевтическая оценка трансплантации фекальной микробиоты в мышиной модели с дефицитом интерлейкина 10

Summary

Взаимодействие генетической предрасположенности, иммунитета слизистой оболочки и микроэкологической среды кишечника участвует в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК). В этом исследовании мы применили трансплантацию фекальной микробиоты мышам с дефицитом IL-10 и исследовали ее влияние на воспаление толстой кишки и функцию сердца.

Abstract

С развитием микроэкологии в последние годы связь между кишечными бактериями и воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК) привлекла значительное внимание. Накопленные данные свидетельствуют о том, что дисбиотическая микробиота играет активную роль в запуске или ухудшении воспалительного процесса при ВЗК и что трансплантация фекальной микробиоты (FMT) является привлекательной терапевтической стратегией, поскольку передача здоровой микробиоты пациенту с ВЗК может восстановить соответствующую связь между хозяином и микробиотой. Тем не менее, молекулярные механизмы неясны, и эффективность FMT не была очень хорошо установлена. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования на животных моделях ВЗК. В этом методе мы применили FMT от мышей дикого типа C57BL / 6J к мышам с дефицитом IL-10, широко используемой мышиной модели колита. Исследование подробно описывает сбор фекальных гранул у мышей-доноров, изготовление фекального раствора / суспензии, введение фекального раствора и мониторинг заболевания. Мы обнаружили, что FMT значительно смягчает сердечные нарушения у нокаутирующих мышей IL-10, подчеркивая его терапевтический потенциал для лечения ВЗК.

Introduction

Микроэкосистема кишечника человека чрезвычайно сложна, с более чем 1000 видами бактерий в кишечнике здорового человека¹. Кишечная флора участвует в поддержании нормальных физиологических функций кишечника и иммунного ответа и имеет неразрывные отношения с организмом человека. Накопленные данные свидетельствуют о том, что кишечный микробиом представляет собой последний орган человека, который является частью человеческого тела, а не просто группу паразитов². «Здоровые» симбиотические отношения между кишечной микробиотой, их метаболитами и иммунной системой хозяина, установленные в раннем возрасте, имеют решающее значение для поддержания гомеостаза кишечника. При некоторых аномальных состояниях, таких как хроническое воспаление, изменения во внутренней и внешней среде организма серьезно нарушают гомеостаз кишечника, что приводит к постоянному дисбалансу микробного сообщества кишечника, называемому дисбактериозом³. Фактически, воздействие нескольких факторов окружающей среды, включая диету, лекарства и патогены, может привести к изменениям в микробиоте.

Дисбактериоз связан с патогенезом различных кишечных заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), синдром раздраженного кишечника (СРК) и псевдомембранозный энтерит, а также с растущим списком внекишечных расстройств, включая сердечно-сосудистые заболевания, ожирение и аллергию⁴. Профилирование микробиоты показало, что у пациентов с ВЗК наблюдается резкое снижение бактериального разнообразия, а также заметные изменения в популяциях некоторых специфических бактериальных штаммов ^5,6. Эти исследования продемонстрировали меньше Lachnospiraceae и Bacteroidetes, но больше протеобактерий и актинобактерий у пациентов с ВЗК. Считается, что патогенез ВЗК связан с различными патогенными факторами, включая аномальную кишечную флору, дисрегулируемый иммунный ответ, экологические проблемы и генетические варианты⁷. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что кишечные бактерии играют роль в фазах инициации и применения ВЗК ^8,9, что указывает на то, что коррекция дисбактериоза кишечника может представлять собой новый подход к терапии и / или поддерживающему лечению ВЗК.

Прототип трансплантации фекальной микробиоты (FMT) начался в древнем Китае¹⁰. В 1958 году доктор Эйсман и его коллеги успешно лечили четыре случая тяжелого псевдомембранозного энтерита фекалиями от здоровых доноров с помощью клизмы, открыв новую главу в современной западной медицине с использованием человеческих фекалий для лечения заболеваний человека¹¹. Было обнаружено, что инфекция Clostridium difficile (CDI) является основной причиной псевдомембранозного энтерита¹² , и FMT очень эффективен при лечении CDI. За последние восемь лет FMT стал стандартом терапии для лечения рецидивирующего CDI¹³, что побудило к дальнейшим исследованиям, изучающим роль FMT в других расстройствах, таких как IBD. За последние двадцать лет многочисленные отчеты о случаях заболевания и когортные исследования документировали использование FMT у пациентов с IBD¹⁴. Мета-анализ, включающий 12 испытаний, показал, что 62% пациентов с болезнью Крона (БК) достигли клинической ремиссии после ТФМ, а 69% пациентов с БК имели клинический ответ¹⁵. Несмотря на эти обнадеживающие выводы, роль FMT в лечении ВЗК остается неопределенной, а механизмы, с помощью которых FMT улучшает воспаление кишечника, плохо изучены. Необходимо провести дальнейшее исследование, прежде чем FMT сможет присоединиться к нынешнему арсеналу вариантов лечения ВЗК в клиниках.

В этом протоколе мы применили FMT на мышах IL-10^-/-, у которых колит развивается спонтанно после отъема и которые служили золотым стандартом для отражения многофакторной природы IBD 16,17,18. Мыши IL-10^−/− широко использовались для препарирования этиологии ВЗК, поскольку они имеют сходные молекулярные и гистологические особенности с пациентами с ВЗК, и, как и пациенты, заболевание может быть улучшено с помощью анти-TNFα терапии¹⁶. Стареющие мыши IL10^−/− (>9 месяцев) имеют увеличенный размер сердца и нарушенную сердечную функцию по сравнению с соответствующими возрасту мышами дикого типа¹⁹, что делает его отличной моделью для изучения сердечных заболеваний, вызванных колитом. Тем не менее, другие мышиные модели колита, такие как модель декстрана сульфата натрия и модель Т-клеточного колита, также могут быть использованы. Мы вводили фекальную суспензию через пероральный прием, что оказалось эффективным и лучшим способом, чем клизма у людей²⁰.

Protocol

Все процедуры, выполненные на животных, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне (Протокол No 1512071A). 1. Сбор свежих фекальных гранул Приготовьте стерильн?…

Representative Results

Мы проводили здоровый донорский FMT 3 раза (один раз в месяц в течение 3 месяцев) на 2-месячных мышах C57BL/6J дикого типа (WT) и IL-10. Соответствующие возрасту мыши C57BL/6J (разница в возрасте должна составлять <2 месяца) служили донорами фекалий, и каждый раз использовались свежие фекальные гранулы. А…

Discussion

Как инновационное исследовательское лечение, FMT стал горячей темой в лечении различных расстройств в последние годы, поскольку дисбактериоз комменсальной микробиоты участвует в патогенезе множественных заболеваний человека, включая ВЗК, ожирение, сахарный диабет, аутизм, болезни сер…

Materials

BD Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-829-10F
Blunt end forceps	Knipex	926443
Brain natriuretic peptide EIA kit	Sigma	RAB0386
C57BL/6J mice	Jackson Lab	000664
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Conical tubes	ThermoFisher	339650
Curved feeding Needles	Kent Scientific	FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer	Omni International	GLH-115
Glycerol	MilliporeSigma	G5516
IL-10 knockout mice	Jackson Lab	004366
Isoflurane	Piramal Critical care	NDC66794-017-10
USP normal saline	Grainger	6280
Vaporizer	Euthanex Corp.	EZ-108SA