JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologie et infection

インターロイキン10欠損マウスモデルにおける糞便微生物叢移植の治療的評価

Published: April 06, 2022
doi:
10.3791/63350
, , ,
1Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine,University of Texas Medical Branch at Galveston, 2Department of Gastroenterology,Xiangya Hospital of Central South University

Summary

炎症性腸疾患(IBD)の病因には、遺伝的感受性、粘膜免疫、腸の微小生態学的環境の相互作用が関与しています。本研究では、糞便微生物叢移植をIL-10欠損マウスに適用し、結腸の炎症と心機能への影響を調べました。

Abstract

近年の微生物生態学の発展に伴い、腸内細菌と炎症性腸疾患(IBD)の関係が注目されています。蓄積された証拠は、ジスバイオティクス微生物叢がIBDの炎症プロセスの誘発または悪化に積極的な役割を果たし、健康な微生物叢をIBD患者に移すと宿主と微生物叢のコミュニケーションを回復できるため、糞便微生物叢移植(FMT)が魅力的な治療戦略であることを示唆しています。しかし、その分子メカニズムは不明であり、FMTの有効性はあまり確立されていません。したがって、IBDの動物モデルにおけるさらなる研究が必要である。この方法では、野生型C57BL/6JマウスのFMTを、大腸炎の広く使用されているマウスモデルであるIL-10欠損マウスに適用しました。この研究では、ドナーマウスから糞便ペレットを収集し、糞便溶液/懸濁液を作成し、糞便溶液を投与し、病気を監視する方法について詳しく説明します。FMTはIL-10ノックアウトマウスの心機能障害を大幅に軽減し、IBD管理の治療の可能性を強調していることがわかりました。

Introduction

ヒトの腸内微小生態系は非常に複雑で、健常人の腸内には1000種以上の細菌が存在する1。腸内細菌叢は、腸の正常な生理機能と免疫応答の維持に関与しており、人体と不可分の関係にあります。蓄積された証拠は、腸内細菌叢が寄生虫のグループだけでなく、人体の一部である最後の人間の臓器を構成することを示唆しています2。腸内細菌叢、その代謝物、および幼少期に確立された宿主免疫系の間の「健全な」共生関係は、腸の恒常性を維持するために重要です。慢性炎症などのいくつかの異常な状態では、体の内部および外部環境の変化が腸の恒常性を深刻に破壊し、腸の微生物群集の持続的な不均衡を引き起こします。実際、食事、薬物、病原体などの複数の環境要因にさらされると、微生物叢の変化につながる可能性があります。

嚥下障害は、炎症性腸疾患(IBD)、過敏性腸症候群(IBS)、偽膜性腸炎などのさまざまな腸疾患の病因、および心血管疾患、肥満、アレルギーなどの腸外疾患のリストの増加に関連しています4。微生物叢プロファイリングにより、IBD患者は細菌の多様性が劇的に減少し、特定の細菌株の集団に著しい変化があることが明らかになりました5,6。これらの研究では、IBD患者では、クモ膜科とバクテロイデスは少ないが、プロテオバクテリアと放線菌が多いことが示されました。IBDの病因は、異常な腸内細菌叢、調節不全の免疫応答、環境上の課題、遺伝的変異など、さまざまな病原性因子に関連していると考えられています7。豊富な証拠は、腸内細菌がIBD 8,9の開始および適用段階で役割を果たすことを示唆しており、腸内細菌叢症の矯正がIBDの治療および/または維持治療のための新しいアプローチを表す可能性があることを示しています。

糞便微生物叢移植(FMT)のプロトタイプは古代中国で始まりました10。1958年、アイズマン博士と彼の同僚は、浣腸を介して健康なドナーからの糞便で重度の偽膜性腸炎の4例を治療することに成功し、人間の糞便を使用して人間の病気を治療する現代西洋医学の新しい章を開きました11。 クロストリジウム・ディフィシル 感染症(CDI)が偽膜性腸炎の主な原因であることが判明しており12 、FMTはCDIの治療に非常に効果的です。過去8年間で、FMTは再発性CDI13の治療のための標準治療療法になり、IBDなどの他の障害におけるFMTの役割を調査するさらなる研究を促しています。過去20年間、多数の症例報告とコホート研究がIBD14患者におけるFMTの使用を文書化しています。12件の試験を含むメタアナリシスでは、クローン病(CD)患者の62%がFMT後に臨床的寛解を達成し、CD患者の69%が臨床反応を示した15。これらの有望な発見にもかかわらず、IBDの管理におけるFMTの役割は依然として不明であり、FMTが腸の炎症を改善するメカニズムはほとんど理解されていません。FMTが診療所でのIBDの治療オプションの現在の兵器庫に参加する前に、さらなる調査が必要です。

このプロトコルでは、離乳後に自然に大腸炎を発症し、IBD 16,17,18の多因子性を反映するゴールドスタンダードとして機能しているIL-10–/-マウスにFMTを適用しました。IL-10-/-マウスは、IBD患者と同様の分子的および組織学的特徴を示し、患者と同様に抗TNFα療法で疾患を改善できるため、IBD病因を解剖するために広く使用されています16。老化したIL10-/-マウス(>9ヶ月齢)は、年齢が一致した野生型マウスと比較して心臓のサイズが大きく、心機能障害があり19、大腸炎誘発性心疾患を研究するための優れたモデルとなっています。ただし、デキストラン硫酸ナトリウムモデルやT細胞誘発大腸炎モデルなど、大腸炎の他のマウスモデルも使用できます。経口強制経口投与で糞便懸濁液を投与し、ヒトの浣腸よりも効果的で優れた経路であることが証明されました20。

Protocol

動物に対して行われたすべての手順は、ガルベストンのテキサス大学医学部の施設動物管理および使用委員会によって承認されました(プロトコル#1512071A)。 1.新鮮な糞便ペレットの収集 滅菌ペーパータオル、鈍端鉗子、および50mLの円錐管を準備します。ペーパータオルと鉗子を別々のオートクレーブバッグに入れ、180°Cの乾熱で30分間オートク?…

Representative Results

健康なドナーFMTを2ヶ月齢のC57BL/6J野生型(WT)およびIL-10ノックアウトマウスに3回(月に1回、3ヶ月間)実施した。年齢を一致させたC57BL / 6Jマウス(年齢差は<2か月)を糞便ドナーとして使用し、毎回新鮮な糞便ペレットを使用しました。EIAアッセイは、BNPがIL-10欠損マウスの血漿中で著しく上昇し、健康なドナーFMTがBNPレベルの増加を有意に緩和することが明らかになりました(図1A</st…

Discussion

FMTは、共生微生物叢の嚥下障害がIBD、肥満、糖尿病、自閉症、心臓病、癌などの複数のヒト疾患の病因に関与しているため、革新的な治験治療として近年さまざまな疾患の治療で話題になっています26。そのメカニズムは解明されていませんが、FMTは新たな生物フローラを構築し、残存菌の損失を防ぐことで機能していると考えられています。本明細書に提示された方法は?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究の一部は、国立衛生研究所からの助成金(R01 HL152683およびR21 AI126097からQ.Li)および米国心臓協会の助成金17GRNT33460395(Q.Li)(heart.org)によってサポートされました。

Materials

BD Syringe, 1 mL Fisher Scientific 14-829-10F
Blunt end forceps Knipex 926443
Brain natriuretic peptide EIA kit Sigma RAB0386
C57BL/6J mice Jackson Lab 000664
Centrifuge Eppendorf 5415R
Conical tubes ThermoFisher 339650
Curved feeding Needles Kent Scientific FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer Omni International GLH-115
Glycerol MilliporeSigma G5516
IL-10 knockout mice Jackson Lab 004366
Isoflurane Piramal Critical care NDC66794-017-10
USP normal saline Grainger 6280
Vaporizer Euthanex Corp. EZ-108SA
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References

  1. D’Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clinica Chimica Acta. 451, 97-102 (2015).
  2. Baquero, F., Nombela, C. The microbiome as a human organ. Clinical Microbiology and Infection. 18, 2-4 (2012).
  3. Hawrelak, J. A., Myers, S. P. The causes of intestinal dysbiosis: a review. Alternative Medcine Review. 9 (2), 180-197 (2004).
  4. Carding, S., Verbeke, K., Vipond, D. T., Corfe, B. M., Owen, L. J. Dysbiosis of the gut microbiota in disease. Microbial Ecology in Health and Disease. 26 (1), 26191 (2015).
  5. Ma, H. Q., Yu, T. T., Zhao, X. J., Zhang, Y., Zhang, H. J. Fecal microbial dysbiosis in Chinese patients with inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 24 (13), 1464-1477 (2018).
  6. Chu, Y., et al. Specific changes of enteric mycobiota and virome in inflammatory bowel disease. Journal of Digestive Diseases. 19 (1), 2-7 (2018).
  7. Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
  8. Podolsky, D. K. Inflammatory bowel disease. The New England Journal of Medicine. 347 (6), 417-429 (2002).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53 (1), 1-4 (2004).
  10. Shi, Y. C., Yang, Y. S. Fecal microbiota transplantation: Current status and challenges in China. JGH Open: An Open Access Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2 (4), 114-116 (2018).
  11. Markley, J. C., Carson, R. P., Holzer, C. E. Pseudomembranous enterocolitis: A clinico pathologic study of fourteen cases with a common etiologic factor. AMA Archives of Surgery. 77 (3), 452-461 (1958).
  12. Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection and pseudomembranous colitis. Best Practice and Research Clinical Gastroenterology. 17 (3), 475-493 (2003).
  13. Kelly, C. R., de Leon, L., Jasutkar, N. Fecal microbiota transplantation for relapsing Clostridium difficile infection in 26 patients: methodology and results. Journal of Clinical Gastroenterology. 46 (2), 145-149 (2012).
  14. Borody, T. J., Warren, E. F., Leis, S., Surace, R., Ashman, O. Treatment of ulcerative colitis using fecal bacteriotherapy. Journal of Clinical Gastroenterology. 37 (1), 42-47 (2003).
  15. Cheng, F., Huang, Z., Wei, W., Li, Z. Fecal microbiota transplantation for Crohn’s disease: a systematic review and meta-analysis. Techniques in Coloproctology. 25 (5), 495-504 (2021).
  16. Scheinin, T., Butler, D. M., Salway, F., Scallon, B., Feldmann, M. Validation of the interleukin-10 knockout mouse model of colitis: antitumour necrosis factor-antibodies suppress the progression of colitis. Clinical and Experimental Immunology. 133 (1), 38-43 (2003).
  17. Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A multihit model: Colitis lessons from the interleukin-10-deficient mouse. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (8), 1967-1975 (2015).
  18. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  19. Sikka, G., et al. Interleukin 10 knockout frail mice develop cardiac and vascular dysfunction with increased age. Experimental Gerontology. 48 (2), 128-135 (2013).
  20. Fecal microbiota transplantation-standardization study group. Nanjing consensus on methodology of washed microbiota transplantation. Chinese Medical Journal (Engl). 133 (19), 2330-2332 (2020).
  21. Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50843 (2013).
  22. Cheng, H. -. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51041 (2014).
  23. Tang, Y., et al. Chronic colitis upregulates microRNAs suppressing brain-derived neurotrophic factor in the adult heart. PLoS One. 16 (9), 0257280 (2021).
  24. Orner, G. A., et al. Suppression of tumorigenesis in the Apc(min) mouse: down-regulation of beta-catenin signaling by a combination of tea plus sulindac. Carcinogenesis. 24 (2), 263-267 (2003).
  25. Kline, K. T., et al. Neonatal injury increases gut permeability by epigenetically suppressing E-Cadherin in adulthood. The Journal of Immunology. 204 (4), 980-989 (2020).
  26. DeGruttola, A. K., Low, D., Mizoguchi, A., Mizoguchi, E. Current understanding of dysbiosis in disease in human and animal models. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1137-1150 (2016).
  27. Chevalier, G., et al. Effect of gut microbiota on depressive-like behaviors in mice is mediated by the endocannabinoid system. Nature Communications. 11 (1), 6363 (2020).
  28. Kao, D., et al. Effect of oral capsule- vs colonoscopy-delivered fecal microbiota transplantation on recurrent clostridium difficile infection: A randomized clinical trial. JAMA. 318 (20), 1985-1993 (2017).
  29. Cammarota, G., et al. International consensus conference on stool banking for faecal microbiota transplantation in clinical practice. Gut. 68 (12), 2111-2121 (2019).
  30. Vemuri, R., et al. The microgenderome revealed: sex differences in bidirectional interactions between the microbiota, hormones, immunity and disease susceptibility. Seminar Immunopathology. 41 (2), 265-275 (2019).
  31. Wilkinson, N. M., Chen, H. -. C., Lechner, M. G., Su, M. A. Sex differences in immunity. Annual Review of Immunology. , (2022).
  32. Lee, C. H., et al. Frozen vs fresh fecal microbiota transplantation and clinical resolution of diarrhea in patients with recurrent clostridium difficile infection: A randomized clinical trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
  33. Hamilton, M. J., Weingarden, A. R., Sadowsky, M. J., Khoruts, A. Standardized frozen preparation for transplantation of fecal microbiota for recurrent clostridium difficile infection. American Journal of Gastroenterology. 107 (5), 761-767 (2012).
  34. Tang, G., Yin, W., Liu, W. Is frozen fecal microbiota transplantation as effective as fresh fecal microbiota transplantation in patients with recurrent or refractory Clostridium difficile infection: A meta-analysis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 88 (4), 322-329 (2017).
  35. Cui, B., et al. Fecal microbiota transplantation through mid-gut for refractory Crohn’s disease: safety, feasibility, and efficacy trial results. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 30 (1), 51-58 (2015).
  36. Li, P., et al. Timing for the second fecal microbiota transplantation to maintain the long-term benefit from the first treatment for Crohn’s disease. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (1), 349-360 (2019).
  37. Moayyedi, P. Update on fecal microbiota transplantation in patients with inflammatory bowel disease. Gastroenterology and Hepatology. 14 (5), 319 (2018).
  38. Saha, S., Mara, K., Pardi, D. S., Khanna, S. Long-term safety of fecal microbiota transplantation for recurrent clostridioides difficile infection. Gastroenterology. 160 (6), 1961-1969 (2021).
  39. Perler, B. K., et al. Long-term efficacy and safety of fecal microbiota transplantation for treatment of recurrent clostridioides difficile infection. Journal of Clinical Gastroenterology. 54 (8), 701-706 (2020).
  40. Safety alert regarding use of fecal microbiota for transplantation and risk of serious adverse events likely due to transmission of pathogenic organisms. FDA Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/safety-availability-biologics/safety-alert-regarding-use-fecal-microbiota-tramsplantation-and-risk-serious-adverse-events-likely (2020)

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Keywords: Fecal Microbiota TransplantationIL-10 Deficient Mouse ModelOral GavageSterile TechniqueFecal DonorFecal SuspensionHomogenizationFiltrationCryogenic StorageThawingGavage Needle
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Citer Cet Article
Xiao, Y., Zhong, X. S., Liu, X., Li, Q. Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model. J. Vis. Exp. (182), e63350, doi:10.3791/63350 (2022).
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