Valutazione terapeutica del trapianto di microbiota fecale in un modello murino carente di interleuchina 10

Summary

L’interazione tra suscettibilità genetica, immunità mucosa e ambiente microecologico intestinale è coinvolta nella patogenesi della malattia infiammatoria intestinale (IBD). In questo studio, abbiamo applicato il trapianto di microbiota fecale a topi carenti di IL-10 e abbiamo studiato il suo impatto sull’infiammazione del colon e sulla funzione cardiaca.

Abstract

Con lo sviluppo della microecologia negli ultimi anni, la relazione tra batteri intestinali e malattie infiammatorie intestinali (IBD) ha attirato una notevole attenzione. Prove crescenti suggeriscono che il microbiota disbiotico svolge un ruolo attivo nell’innescare o peggiorare il processo infiammatorio nell’IBD e che il trapianto di microbiota fecale (FMT) è una strategia terapeutica interessante poiché il trasferimento di un microbiota sano al paziente con IBD potrebbe ripristinare la comunicazione ospite-microbiota appropriata. Tuttavia, i meccanismi molecolari non sono chiari e l’efficacia della FMT non è stata molto ben stabilita. Pertanto, sono necessari ulteriori studi su modelli animali di IBD. In questo metodo, abbiamo applicato FMT da topi selvatici C57BL / 6J a topi carenti di IL-10, un modello murino ampiamente utilizzato di colite. Lo studio elabora la raccolta di pellet fecali dai topi donatori, la produzione della soluzione / sospensione fecale, la somministrazione della soluzione fecale e il monitoraggio della malattia. Abbiamo scoperto che l’FMT ha mitigato significativamente la compromissione cardiaca nei topi knockout IL-10, sottolineando il suo potenziale terapeutico per la gestione delle IBD.

Introduction

Il microecosistema intestinale umano è estremamente complesso, con più di 1000 specie di batteri nell’intestino di una persona sana¹. La flora intestinale è coinvolta nel mantenimento delle normali funzioni fisiologiche dell’intestino e della risposta immunitaria e ha un rapporto inscindibile con il corpo umano. L’accumulo di prove suggerisce che il microbioma intestinale costituisce l’ultimo organo umano, che fa parte del corpo umano, non solo un gruppo di parassiti². Una relazione simbiotica “sana” tra il microbiota intestinale, i loro metaboliti e il sistema immunitario dell’ospite stabilito nei primi anni di vita è fondamentale per mantenere l’omeostasi intestinale. In alcune condizioni anormali come l’infiammazione cronica, i cambiamenti nell’ambiente interno ed esterno del corpo interrompono seriamente l’omeostasi intestinale, con conseguente squilibrio persistente della comunità microbica dell’intestino, chiamato disbiosi³. Infatti, l’esposizione a molteplici fattori ambientali, tra cui dieta, farmaci e agenti patogeni, può portare a cambiamenti nel microbiota.

La disbiosi è associata alla patogenesi di una varietà di malattie intestinali, come la malattia infiammatoria intestinale (IBD), la sindrome dell’intestino irritabile (IBS) e l’enterite pseudomembranosa, nonché un elenco crescente di disturbi extra-intestinali, tra cui malattie cardiovascolari, obesità e allergia⁴. Il profilo del microbiota ha rivelato che i pazienti con IBD hanno una drastica diminuzione della diversità batterica, nonché marcate alterazioni nelle popolazioni di alcuni ceppi batterici specifici ^5,6. Questi studi hanno dimostrato meno Lachnospiraceae e Bacteroidetes ma più Proteobacteria e Actinobacteria nei pazienti con IBD. Si ritiene che la patogenesi dell’IBD sia correlata a vari fattori patogeni, tra cui flora intestinale anormale, risposta immunitaria disregolata, sfide ambientali e varianti genetiche⁷. Abbondanti prove suggeriscono che i batteri intestinali svolgono un ruolo nelle fasi di inizio e applicazione di IBD^8,9, indicando che la correzione della disbiosi intestinale può rappresentare un nuovo approccio per la terapia e / o il trattamento di mantenimento dell’IBD.

Il prototipo del trapianto di microbiota fecale (FMT) è iniziato nell’antica Cina¹⁰. Nel 1958, il Dr. Eiseman e i suoi colleghi trattarono con successo quattro casi di grave enterite pseudomembranosa con materia fecale da donatori sani tramite clistere, aprendo un nuovo capitolo nella moderna medicina occidentale usando le feci umane per curare le malattie umane¹¹. L’infezione da Clostridium difficile (CDI) è risultata essere la causa principale dell’enterite pseudomembranosa¹² e l’FMT è altamente efficace nel trattamento della CDI. Negli ultimi otto anni, l’FMT è diventata una terapia standard per il trattamento della CDI¹³ ricorrente, spingendo ulteriori studi che indagano il ruolo dell’FMT in altri disturbi, come l’IBD. Negli ultimi vent’anni, numerosi casi clinici e studi di coorte hanno documentato l’uso di FMT in pazienti con IBD¹⁴. Una meta-analisi, inclusi 12 studi, ha mostrato che il 62% dei pazienti con malattia di Crohn (MC) ha raggiunto la remissione clinica dopo FMT e il 69% dei pazienti con CD ha avuto una risposta clinica¹⁵. Nonostante questi risultati incoraggianti, il ruolo dell’FMT nella gestione dell’IBD rimane incerto e i meccanismi con cui l’FMT migliora l’infiammazione intestinale sono poco conosciuti. Sono necessarie ulteriori indagini prima che FMT possa unirsi all’attuale armamentario di opzioni di trattamento per IBD nelle cliniche.

In questo protocollo, abbiamo applicato FMT su topi IL-10-^/-, che sviluppano colite spontaneamente dopo lo svezzamento e sono serviti come gold standard per rispecchiare la natura multifattoriale di IBD^16,17,18. I topi IL-10−^/− sono stati ampiamente utilizzati per sezionare l’eziologia dell’IBD perché presentano caratteristiche molecolari e istologiche simili ai pazienti con IBD e, come i pazienti, la malattia può essere migliorata con la terapia anti-TNFα¹⁶. I topi IL10^−/− (>9 mesi di età) hanno una maggiore dimensione del cuore e una funzione cardiaca compromessa rispetto ai topi wild-type di pari età¹⁹, rendendolo un modello eccellente per lo studio delle malattie cardiache indotte da colite. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri modelli murini di colite, come il modello di solfato di sodio destrano e il modello di colite indotta da cellule T. Abbiamo somministrato sospensione fecale tramite sonda orale gastrica, dimostrata una via efficace e migliore rispetto al clistere negli esseri umani²⁰.

Protocol

Tutte le procedure eseguite sugli animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee della University of Texas Medical Branch di Galveston (Protocollo # 1512071A). 1. Raccolta di pellet fecali freschi Preparare asciugamani di carta sterili, pinze smussate e tubi conici da 50 ml.Mettere alcuni tovaglioli di carta e pinze in sacchetti separati per autoclave e sterilizzarli in autoclave a 180 °C a fuoco secco per 30 minuti. Utilizzare…

Representative Results

Abbiamo eseguito FMT donatore sano 3 volte (una volta al mese per 3 mesi) su topi selvatici C57BL / 6J di 2 mesi (WT) e IL-10 knockout. Topi C57BL / 6J di età corrispondente (la differenza di età dovrebbe essere <2 mesi) sono serviti come donatori fecali e ogni volta sono stati utilizzati pellet fecali freschi. I test EIA hanno rivelato che il BNP era marcatamente elevato nel plasma dei topi con deficit di IL-10 e che l'FMT del donatore sano ha mitigato significativamente l'aumento dei livelli di BNP (<strong class="xf…

Discussion

Come trattamento sperimentale innovativo, FMT è diventato un argomento caldo nel trattamento di vari disturbi negli ultimi anni poiché la disbiosi del microbiota commensale è implicata nella patogenesi di più malattie umane, tra cui IBD, obesità, diabete mellito, autismo, malattie cardiache e cancro²⁶. Sebbene il meccanismo non sia stato determinato, si ritiene che FMT funzioni costruendo una nuova flora biologica e prevenendo la perdita di batteri residui. Il metodo qui presentato ha adottat…

Materials

BD Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-829-10F
Blunt end forceps	Knipex	926443
Brain natriuretic peptide EIA kit	Sigma	RAB0386
C57BL/6J mice	Jackson Lab	000664
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Conical tubes	ThermoFisher	339650
Curved feeding Needles	Kent Scientific	FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer	Omni International	GLH-115
Glycerol	MilliporeSigma	G5516
IL-10 knockout mice	Jackson Lab	004366
Isoflurane	Piramal Critical care	NDC66794-017-10
USP normal saline	Grainger	6280
Vaporizer	Euthanex Corp.	EZ-108SA