Summary
Этот протокол представляет собой новую хирургическую технику трансплантации почки мыши, ориентированную на модифицированную стратегию артериального анастомоза. Также представлена методика сосудистого шва, включающая простой и безопасный метод анастомоза мочеточника и мочевого пузыря. Эти модификации сокращают время операции и улучшают вероятность успеха процедуры трансплантации почки мыши.
Abstract
Трансплантация почки у мышей является сложной и сложной хирургической процедурой. Существует очень мало публикаций, демонстрирующих ключевые этапы этой операции. Поэтому данная статья знакомит с методикой и указывает на хирургические предостережения, связанные с данной операцией. Кроме того, демонстрируются важные изменения по сравнению с обычной процедурой. Во-первых, участок брюшной аорты разрезают и готовят таким образом, чтобы проксимальные бифуркации почечной артерии, включая мочеточниковую артерию, перерезались вместе с донорской почкой в блоке. Это снижает риск некроза мочеточника и позволяет избежать развития окклюзии мочевыводящих путей. Во-вторых, продемонстрирован новый метод сосудистого анастомоза, позволяющий оператору гибко увеличивать или уменьшать размер анастомоза после того, как уже начата реперфузия почечной трансплантации. Это позволяет избежать развития стриктур сосудов и внутрибрюшных кровотечений. В-третьих, показана методика, позволяющая провести анастомоз деликатного донорского мочеточника и мочевого пузыря-реципиента, не вызывающего травмы. Принятие этого протокола может сократить время операции и уменьшить повреждение мочевого пузыря реципиента, тем самым значительно увеличивая вероятность успеха операции для мышей-реципиентов.
Introduction
С тех пор, как Саковиц и др. впервые разработали мышиные модели трансплантации почки в 1973 году1, она зарекомендовала себя как важный экспериментальный инструмент для изучения механизмов трансплантационного ишемического повреждения и аллоиммунного отторжения, а также для разработки новых методов лечения, направленных на продление выживаемости аллотрансплантата и, возможно, достижение иммунологической толерантности. Тем не менее, хирургическая техника оказалась сложной и очень требовательной, иногда имея такие осложнения, как сосудистые анастомотические стриктуры, приводящие к преренальной неиммунологической недостаточности почки2, постренальной недостаточности, вызванной ишемией и последующим некрозом трансплантированного мочеточника, стриктуры анастомоза трансплантированного мочеточника и / или мочевого пузыря реципиента, приводящего к нарушению оттока мочи. Все это причины, по которым трансплантация почек у мышей не получила дальнейшего развития и поэтому не получила широкого распространения. Создание эффективной и долгосрочной стабильной модели трансплантации почки мыши без осложнений сосудов и мочевыводящих путей по-прежнему имеет незаменимое значение для многих исследований в области трансплантации с акцентом на почечные иммуноопосредованные, но также инфекционные заболевания3. Кроме того, по сравнению с другими трансплантациями органов в мышиных моделях, таких как трансплантация легких, сердца и кишечника 4,5, модель трансплантации почки мыши дает шанс для изучения долгосрочной выживаемости даже в условиях большого несоответствия антигенов гистосовместимости 3,6. Также было показано, что в одних и тех же условиях комбинаций донор-реципиент различные трансплантации органов, таких как сердце или почки, характеризуются различной динамикой и началом отторжения аллотрансплантата3. Кроме того, с нефрологической точки зрения это более подходящая модель для изучения паренхиматозно-опосредованных иммунных регуляторных механизмов в контексте острых и хронических событий отторжения, чем простые эксперименты по пересадке кожи.
Основываясь на предыдущих отчетах о хирургической технике трансплантации почки у мышей 3,7,8,9, мы здесь демонстрируем следующие надежные улучшения, которые были успешно применены в течение последних 10 лет в нашей группе 10,11,12: Во-первых, мочеточниковая артерия безопасно сохраняется, поскольку почечная артерия резецируется в блоке. вместе с соответствующей частью брюшной аорты. Во-вторых, новая, простая и быстрая методика бессучкового сосудистого анастомоза, при которой окончательный стежок анастомоза не завязывается концом верхнего галстука, как традиционный подход, а остается свободным. Данная методика позволяет увеличить или уменьшить размеры анастомоза после реперфузии почек во избежание стриктуры сосудов и внутрибрюшного кровотечения. В-третьих, иглы шприца 21 г и 30 г использовались в качестве вспомогательного инструмента для прокола, чтобы имплантировать донорский мочеточник в стенку мочевого пузыря реципиента, уменьшая повреждение мочевого пузыря реципиента и облегчая образование стриктурного свободного анастомоза.
В этом отчете мы также сравнили традиционную, широко используемую методику с модифицированной, которая установлена в нашей лаборатории, и не обнаружили существенной разницы в степени почечной канальцевой атрофии и интерстициального фиброза ткани трансплантата почки. В предыдущих исследованиях мы дополнительно сравнивали результаты этой новой методики с обычным методом с точки зрения местного кровотечения, тромбоза, времени выполнения анастомоза сосудов и выживаемости. Мы обнаружили такие улучшения, как значительное снижение локальных тромбозных событий (1,1% против 6,6%), сокращение времени для процедуры анастомоза и высоковоспроизводимый сингенный трансплантат почек с долгосрочной выживаемостью (95% против 84% при классическом подходе)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами директивы 2010/63/EU Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях (Карточка этики животных: Министерство безопасности пищевых продуктов и лекарственных средств Нижней Саксонии, #33.9-42502-04-11/0492). Проводите процедуры с использованием стерильных хирургических инструментов и расходных материалов (автоклавных) и старайтесь держать операционную зону как можно более стерильной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы мышей C57BL/6J служили донорами и реципиентами (модель сингенной трансплантации), в то время как мыши Balb/c служили реципиентами аллотрансплантата почек (модель для изучения модели острого отторжения аллотрансплантата9). Мыши были в возрасте от 8 до 12 недель, весили ~ 25-30 г при трансплантации и содержались в стандартных условиях. Данные, представленные в этой рукописи, были получены четырьмя хирургами, имеющими опыт работы на мышах.
1. Подготовительные шаги
- Для хирургии используйте набор микроскопических инструментов, включая микроножниц, микрощипцы, держатель иглы, микрогемостатические зажимы и электрохирургическую ручку. Выполняйте швы с использованием нейлоновой мононити 7/0er, 10/0er или 4/0er.
- Для анестезии поместите мышь в коробку для вдыхания изофлурана (2%) примерно на 40-60 с, чтобы вызвать потерю сознания.
- Как только мышь будет обезболена, взвесьте мышь.
- В зависимости от веса мыши применяют внутрибрюшинную инъекцию кетамина (100 мг/кг) + ксилазина (10 мг/кг) + ацепромазина (2 мг/кг) для анестезии мыши13. Убедитесь, что мышь обезболена, наблюдая отсутствие реакции на защемление пальца ноги.
- Когда анестезия вступит в силу, обрежьте брюшной мех. Затем зафиксируйте мышь на операционном столе, свободно обездвижив конечности стерильной маскировочной лентой.
- Вылечите брюшную полость мыши после размещения мыши на операционном столе. Выполните дезинфекцию с помощью чередующегося скраба из повидона йодида (йодофора) и спирта, три раза (используйте концентрический рисунок, начните скраб в середине живота и двигайтесь наружу), а затем правильно задрапируйте мышь с помощью фенестрированного хирургического полотенца.
- Наносите глазную мазь и сохраняйте стерильность на протяжении всей процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики не рекомендуются на протяжении всей процедуры, так как эти вещества могут влиять на иммунологические реакции.
2. Процедура работы донора
- Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу и выполнить поперечный разрез брюшной полости около 3-4 см. Разрезать мышцы брюшной стенки. Накройте крышкой и осторожно отведите внутренние органы солевой впитанной марлей.
- Используйте ватный тампон, чтобы аккуратно удалить кишечник, желудок и селезенку с правой стороны (с точки зрения мыши), накрыть и осторожно отвести внутренние органы солевой впитанной марлей.
- Используйте микрощипцы для обнажения левой почки, аорты и нижней полой вены (IVC).
- Используйте электрохирургический карандаш для тщательного прижигания левых поясничных вен, включая их нижележащие ветви и другие мелкие сосуды вместе с левым сосудом надпочечников.
- Используйте микроножницы и щипцы, чтобы рассечь левый мочеточник и осторожно мобилизовать его из окружающих тканей. Очистите срежьте его близко к мочевому пузырю. Мобилизовать область аорты между левой и правой почечными артериями длиной около 2 мм.
- Используйте микрощипцы, чтобы отделить инфраренальную нижнюю полую вену (IVC) и аорту, а затем используйте изогнутые щипцы, чтобы пройти под аорту, чтобы поместить свободный галстук из 7-0 шелкового шва вокруг этого сосуда.
- Перекрестный зажим области аорты ниже правой почечной артерии и нижней полой вены (IVC) с помощью двух 5 мм микрососудистых зажимов.
- Трансекция левой почечной вены из полой вены.
- Используйте шприц для промывки аорты 1 мл солевого раствора гепарина (60 Ед/мл).
- Используйте микрощипы для подтяжки лигатуры, нанесенной на шаге 2.5. Затем срежьте аорту ниже лигатуры, а также ниже проксимального зажима. При этом проксимальные бифуркации почечной артерии (обратите внимание, что артериальное отверстие необходимо аккуратно перерезать, иначе это повлияет на анастомоз) и мочеточниковой артерии включаются и трансецируются в блок. Готовьтесь тщательно, чтобы нежная мочеточниковая артерия полностью сохранилась.
- Используйте электрохирургический карандаш и щипцы, чтобы полностью освободить левую почку и связанные с ней сосуды, осторожно прижигая все сосуды, окружающие ткани. Удалить почку и хранить в физиологическом растворе при 4 °C.
- Усыпить обезболенную донорскую мышь путем обезглавливания.
3. Порядок работы получателя
- Выполните начальные хирургические этапы (включая анестезию и стерилизацию, см. шаги с 1.1 по 1.7), как описано для мыши-донора.
- Используйте ножницы, чтобы открыть живот через срединный разрез (около 2,5 см в длину), а затем накройте органы брюшной полости влажной марлей с помощью физиологического раствора.
- Тщательно сохраняйте инфраренальную аорту и нижнюю полую вену (IVC) и убедитесь, что каждая крупная сосудистая ветвь прижигается. Используйте электрическое прижигание, чтобы тщательно рассечь левый мочеточник в положении, близком к тазу почек. Затем удалить левую почку.
- Используйте микрощипцы и ватные палочки, чтобы обнажить брюшную аорту и нижнюю полую вену и отделить их от окружающей жировой ткани (примерно более 4 мм в длину).
- Используйте два микрососудистых зажима и расположите их проксимально и дистально как на нижней полой вене, так и на брюшной аорте одновременно.
- Используйте держатель микроиглы для направления 10/0 мононити (изготовленной из синтетического волокна с гладкой поверхностью) шовной иглы, которая помещается через стенку аорты проксимальным и дистальным образом.
- Добейтесь эллиптической артериотомии примерно 1 мм с мягким вытяжением шва вверх, при этом разрезая непосредственно нижнюю часть иглы тонкими, изогнутыми ножницами.
- Используйте микроножницы, чтобы разрезать нижнюю полую вену (IVC) продольно с достаточной длиной примерно 1,5 мм. Расположите этот разрез немного ниже его аортального аналога.
- Выполняйте донорский и реципиентный анастомоз аорты сквозным способом. Поместите донорскую почку на правую сторону нижней полой вены реципиента, выравнивая манжету брюшной аорты донора с анастомозом брюшной аорты реципиента.
- Используйте держатель микроиглы и два отдельных шва 10-0, чтобы сшить проксимальный и дистальный концы анастомоза.
- После завязывания оставьте два длинных шва, включая иглу, на месте. Пришивают левую сторону стенки аорты к анастомозу непрерывно двумя равномерно расположенными швами в дистально-проксимальном направлении.
- После последнего шва направьте шов через частичную толщину стенки сосуда над верхним шовным стяжкой.
- Используйте микрощипцы, чтобы одновременно оказывать мягкое сцепление с коротким концом нижнего шовного галстука.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой новой технике без узлов последний стежок не привязан к короткому концу верхнего галстука. - Используйте микрощипцы, чтобы перевернуть пересаженную почку в нормальное положение. Теперь непрерывно пришивают правую стенку аортального анастомоза с помощью трех швов в проксимальном и дистальном порядке.
ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с обычной хирургической техникой 7,8 последний шов сливается с дистальным галстуком поблизости. Не привязывайте его к концу нижнего шва, обрежьте его, чтобы вместо этого осталась свободная длина 2-3 мм. - Выполните венозный анастомоз, используя ту же процедуру наложения швов, что и ранее описанная, с той разницей, что для каждой стороны анастомоза необходимо четыре-пять швов. Конечный стежок оставляется свободным концом аналогичной длины, похожим на аортальный анастомоз, описанный выше.
- После завершения обоих анастомозов используйте сухой тампон, чтобы оказывать мягкое давление на ушиваемую область в течение примерно 10-20 с.
- Используйте зажимные аппликаторные щипцы, чтобы снять оба зажима, сначала нижний, затем верхний. Промыть брюшную полость 0,9% хлоридом натрия при температуре 38,0 °C.
- Наблюдают за реперфузией пересаженной почки.
4. Имплантация мочеточника
- Используйте держатель микроиглы для проникновения через мочевой пузырь реципиента швом 10/0 (прямая игла) и вставьте его в просвет иглы 21 г для руководства (см. Дополнительный рисунок 1a).
- Теперь направьте иглу весом 21 г, чтобы сшить отверстие в месте предыдущего применения иглы (дополнительный рисунок 1b).
- Вытащите иглу весом 21 г (дополнительный рисунок 1c).
- Используйте держатель микроиглы и шов 10/0, чтобы сшить (без галстука) обрезанный конец мочеточника и снова перфорировать мочевой пузырь этим швом 10/0 в месте его входа (дополнительный рисунок 1d).
- Используйте держатель микроиглы для буксировки нити 10/0 и мочеточника в мочевой пузырь через построенное отверстие (дополнительный рисунок 1e).
- Используйте держатель микроиглы и еще один шов 10/0, чтобы анастомозировать мочеточник донора к мочевому пузырю реципиента. Здесь соединяют наружную мембрану мочеточника с наружной мембраной стенки мочевого пузыря, и выполняют прерывистые швы с 3 – 4 швами. Наконец, вытащите тяговый шов (дополнительный рисунок 1f).
- Используйте щипцы, чтобы поместить кишечник обратно в брюшную полость. Выполните двухслойные швы (сначала мышцы живота, а затем кожу), чтобы закрыть брюшную рану с помощью нити 4/0.
- Поместите пересаженных мышей в кислородную и температурную камеру для восстановления после операции.
- Для послеоперационного обезболивания непосредственно вводят Метамизол 200 мг/кг per os после операции.
Через четыре и 16 ч после операции дают Метамизол 200 мг/кг на ос плюс Карпрофен (5 мг/кг) с.к. При дальнейшем наблюдении применяют карпрофен (5 мг/кг) s.c. к пересаженным мышам каждые 24 часа в течение трех последовательных дней после операции13. При наличии признаков недостаточного обезболивания бупренорфин дополнительно назначают 0,05 мг/кг каждые 8 ч. ст.
5. Контралатеральная нефрэктомия и жертвоприношение мыши-реципиента
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните контралатеральную нефрэктомию мыши-реципиента через 5 дней после трансплантации.
- Выполняют контралатеральную нефрэктомию пересаженной мыши через 5 дней после трансплантации под наркозом. Обрезать и перерезать аутологичные правые почечные артерии и вены реципиента, удалить правую почку и закрыть брюшную полость. Послеоперационный уход и обезболивание такие же, как описано выше (см. шаг 4.7).
- Поднимите и запишите состояние мыши. Обеспечьте пересаженной мыши послеоперационную анальгезию, питание и водоснабжение.
- Через четыре недели после трансплантации принесите в жертву половину пересаженных мышей и выполните окрашивание H&E для пересадки почки.
- Через 12 недель после трансплантации принесите в жертву оставшихся мышей и выполните окрашивание Массоном Голдом этих пересадок почки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Через четыре недели после трансплантации как модифицированный метод, так и обычный метод показали умеренные признаки почечной канальцевой атрофии14,15 по сравнению с нативным реципиентом контралатеральных почек (рисунок 1). Степень атрофии почечных канальцев не продемонстрировала существенной разницы между двумя различными методами. Трихромное окрашивание Массона Голднера14,15 почек через 12 недель после трансплантации равномерно показало явные признаки интерстициального фиброза тканей по сравнению с нормальными нетрансплантированными почками (рисунок 2).
Ранее мы исследовали результат этой новой бесузлывой методики (n = 175) и сравнили ее с классическим подходом (n = 122) с точки зрения технических аспектов процедуры и интраоперационных и послеоперационных осложнений (см. также таблицу 1)10. Модифицированная методика, показанная здесь, была связана с меньшим возникновением внутритрансплантатных артериальных или венозных тромботических событий (Рисунок 3b, 1,1% против 6,6%). Время выполнения анастомоза было значительно меньше (рисунок 3a), и была достигнута высоковоспроизводимая долгосрочная выживаемость почечного трансплантата (95% против 84%, p < 0,001, рисунок 3c), определяемая выживаемостью реципиента через 12 недель после трансплантации. Кроме того, применение этой модифицированной процедуры трансплантации не влияет на функцию почечного аллотрансплантата, оцениваемую креатинином сыворотки в течение периода наблюдения 12 недель10.
| Общепринятый | Новая техника без узлов | |
| (n=122) | (n=175) | |
| Время работы | ||
| Время артериального анастомоза (мин) | 9.2 ± 0.09 | 7.5 ± 0.06** |
| Время венозного анастомоза (мин) | 9.1 ± 0.10 | 7.5 ± 0.05** |
| Частота осложнений | ||
| Тромбоз | 8 (6.6%) | 2 (1,1%)* |
| Местное кровотечение | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| Процент успеха | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Ронг, С., Льюис А.Г., Кунтер У., и др. Бесузловая техника для трансплантации почки у мыши. J Трансплантация. Epub2012:127215,(2012). | ||
Таблица 1: Сравнение этой новой методики (n = 175) с обычной техникой (n = 122) с точки зрения технических аспектов процедуры и интраоперационных и послеоперационных осложнений10. Цифры представляют время работы в минутах каждой процедуры (среднее ± SD).
Рисунок 1: Репрезентативные гистологические результаты оценки канальцевой атрофии. Окрашивание почки через 4 недели после трансплантации (40x): (a) нормальная нетрансплантированная почка, (b) обычная техника и (c) модифицированная техника сингенной трансплантации почки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные гистологические результаты оценки интерстициального фиброза. Трихромное окрашивание Массона Голднера через 12 недель после трансплантации (40x) (а) нормальной нетрансплантированной почки, (б) обычной техники и (в) модифицированной техники сингенной трансплантации почки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение времени работы анастомозов сосудов, частоты осложнений и показателей успешности между модифицированной и обычной техникой10 Барграфы в (а) изображают время операции, необходимое для выполнения анастомоза сосуда; барграфы в подпункте b) изображают события внутритрансплантатного тромбоза и проблемы с местным кровотечением; в то время как барграфы в (c) демонстрируют более высокую успешность новой бесузлывой техники в соответствии с выживаемостью более 12 недель после трансплантации после дополнительной эксплантации нативной контралатеральной почки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Обзор анатомического строения (верхние панели a и b) и линий резекции аорты и почечной артерии как для обычной (c), так и для модифицированной техники (d). (A) Брюшной аорты, (B) Почечной артерии, (C) Мочеточниковой артерии, (D) Почки, (E) Мочеточника. Венозные сосуды (V. cava, включая Vv. renales) изображены в виде пунктирных линий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Примерная демонстрация безузлового сшивания анастомоза сосуда артерии , показывающего (А) брюшную аорту, (В) почечную артерию и (В) технику бесузлового сшивания, где последний стежок анастомоза не завязан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Анастомоз донорского мочеточника с мочевым пузырем реципиента. (a) Проникнуть через мочевой пузырь реципиента с мононитью 10/0 и вставить его в просвет иглы 21 G, (b) направить иглу 21 G для выполнения отверстия, расположенного на предыдущей перфорации иглы, (c) вытащить иглу 21 G, (d) сшить обрезанный конец мочеточника швом 10/0 и снова перфорировать мочевой пузырь швом 10/0 в месте его входа, (e) затем отбуксировать шов 10/0 и мочеточник в мочевой пузырь через построенное отверстие, (f) и анастомозировать мочеточник донора в мочевой пузырь реципиента еще одним швом 10/0. Наконец, вытяните тяговый шов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как модель трансплантации кожи у мышей проста и легка в выполнении для изучения событий аллоиммунного отторжения, хирургические методы более конкретного исследования воспалительных изменений, связанных с аллоиммуном, после сердца16 и трансплантации почки10 , оказались сложными и очень требовательными. С точки зрения трансплантолога, создание эффективной и долгосрочной стабильной модели трансплантации почек мышей по-прежнему имеет незаменимое значение для многих функциональных и иммунологических исследований. Кроме того, по сравнению с другими трансплантациями органов, модель трансплантации почки мыши может достигать длительной выживаемости даже при определенных различиях в основных антигенах гистосовместимости, подразумевающих возможность изучения механизмов иммунной регуляции в долгосрочном развитии как отторжения, так и выявления предпосылок для установления аллоиммунной толерантности3.
Как описано ранее, трансплантация почки у мышей является сложной процедурой, и показатели успеха даже опытных хирургов широко варьируются от 40 до 95% 10,17,18,19,20. Что касается отчетов различных исследовательских групп по всему миру по этой хирургической технике, мы внесли следующие изменения по сравнению с классическим подходом, что привело к нескольким улучшениям.
Во-первых, участок брюшной аорты разрезают и готовят таким образом, чтобы проксимальные бифуркации почечной артерии и мочеточниковой артерии пересекались, включая донорскую почку в блоке. Этот маневр не только полностью сохраняет и сохраняет кровоснабжение и функцию мочеточника донора, избегая травмы периуретеральной ткани, тем самым предотвращая послеоперационный гидронефроз, но и предотвращает послеоперационные стриктуры почечной артерии (рисунок 4). Следовательно, избегается почечная трансплантационная ишемия, опосредованная стриктурой почечной артерии или вызванная гидронефрозом, опосредованным строгим и ишемическим трансплантационным мочеточником, что представляет собой два ключевых аспекта для достижения долгосрочной выживаемости трансплантата в этой модели. Однако существуют анатомические варианты для потомства мочеточниковой артерии. Например, у некоторых мышей мочеточниковая артерия берет свое начало из основного ствола брюшной аорты, а не из почечной артерии, и положение этого потомства в основном составляет от 0,2 до 0,5 мм от потомства почечной артерии (изображено на рисунке 4). Исходя из нашего опыта, мы бы оценили возникновение мочеточниковой артерии, происходящей непосредственно из аорты примерно у 20% самцов мышей C57BL/6J (неопубликованное наблюдение) и реже у других штаммов мышей, таких как BALBc. В некоторых из сообщенных традиционных хирургических методов этим важным питательным сосудом иногда пренебрегали для защиты, поскольку он игнорировался и непосредственно лигировался или подвергался электрооблаждению.
Особенно в этих ситуациях анатомических вариантов, когда потомство мочеточниковой артерии мыши происходит из основного ствола брюшной аорты ниже потомства почечной артерии, этот метод трансекции и реконструкции анастомоза аорты еще более подходит. Опытные хирурги могут даже решить, когда использовать традиционный или модифицированный анальный анастомоз.
Во-вторых, применение новой, простой и быстрой техники безузлового сосудистого анастомоза, при котором конечный стежок анастомоза не связан с концом верхнего галстука, как традиционный подход, а остается свободным, вместо этого предлагает ценное преимущество (см. Рисунок 5). Эта методика по-прежнему позволяет увеличить или уменьшить размер анастомоза после того, как реперфузия пересадки почки уже была начата. Это позволяет избежать развития стриктур сосудов и внутрибрюшных кровотечений. Кроме того, свободные хвосты анкерных швов на обоих концах можно натягивать в противоположных направлениях, чтобы гибко корректировать и расширять анастомоз, чтобы избежать стеноза артерий или вен. Таким образом, техника сшивания улучшает коэффициент отказоустойчивости операции и дружелюбна к новичкам20.
В-третьих, для атравматического выполнения анастомоза донорского мочеточника и мочевого пузыря-реципиента в качестве вспомогательных инструментов для пункции использовались шприцевые иглы 21 г и 30 г. У мышей мочеточник довольно тонкий и очень тонкий для выполнения сквозного анастомоза. Обычно донорский мочеточник непосредственно втягивается в мочевой пузырь с помощью щипцов для направления мочеточника после перфорации мочевого пузыря шприцевой иглой. Мы еще больше усовершенствовали этот метод, используя иглу шприца более тонкого диаметра 30 г в качестве направляющей для иглы шприца 21 г (процедура Селдингера). С помощью этой атравматической техники игла шприца 21 G не проникает во весь мочевой пузырь, что уменьшает повреждение мочевого пузыря и сложность имплантации мочеточника17 (дополнительный рисунок 1).
Критическим этапом протокола является настройка артериального отверстия. В обоих случаях (донор и реципиент) они должны быть аккуратно разрезаны, иначе это повлияет на качество анастомоза. Кроме того, в этой новой безузловой технике последний стежок не привязан к завязанной нити. После анастомоза хирург должен изначально держать анастомотическую стому небольшой. Затем, после реперфузии, потяните концы нити на верхнем и нижнем концах, чтобы увеличить ее. Другим важным шагом, о котором необходимо знать, является позиционирование разреза донорской почечной артерии, поскольку мочеточниковая артерия должна быть идентифицирована для защиты.
Основным ограничением этого метода является, помимо описанных улучшений, то, что оператор по-прежнему должен соответствовать высоким требованиям, поскольку стенки судна маленькие и очень нежные. Без интенсивной и настойчивой практики уровень успеха операции будет низким.
Таким образом, этот отчет демонстрирует применимость технической модификации процедуры трансплантации почки у мышей. Хирургическая процедура, представленная здесь, зарекомендовала себя как ценный и надежный метод, который служил важным компонентом нескольких научных публикаций в течение последних 10 лет 3,19,20. По сравнению с классической и широко распространенной моделью хирургии, метод, продемонстрированный здесь, обеспечивает несколько важных улучшений, которые приводят к снижению частоты осложнений и более высокой выживаемости трансплантата в условиях сингенной трансплантации почки3. Важно отметить, что оба метода (модифицированные и обычные) имеют одни и те же дальнейшие осложнения, влияющие на смертность реципиента, такие как смерть от повреждения висцерала, утечка мочи, гидронефроз, инфекции и т. Д., Которые не отличались. Таким образом, эта новая хирургическая техника улучшает общий показатель успеха и долгосрочную выживаемость трансплантата, что делает его надежным инструментом для изучения аллоиммунного ответа после трансплантации почки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Мы благодарим команду доктора Тяньтянь Бай за помощь с голосом за кадром, мисс Миань Пао за ее помощь в медицинской иллюстрации. Эта работа была частично поддержана Немецким исследовательским фондом (DFG) для содействия международному сотрудничеству (HO2581/4-1 to AH) и Национальным научным фондом Китая (NSFC; #81760291 fJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A.
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H.
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
