Summary
פרוטוקול זה מציג טכניקה כירורגית חדשה של השתלת כליה של עכברים המתמקדת באסטרטגיית אנסטומוזיס עורקית שונה. כמו כן מוצגת טכניקת תפר כלי דם הכוללת שיטת אנסטומוזה פשוטה ובטוחה יותר של השופכן-שלפוחית השתן. שינויים אלה מקצרים את זמן הניתוח ומשפרים את שיעור ההצלחה של הליך השתלת הכליה של העכבר.
Abstract
השתלת כליה בעכברים היא הליך ניתוח מסובך ומאתגר. יש מעט מאוד פרסומים המדגימים את השלבים המרכזיים של פעולה זו. לכן, מאמר זה מציג את הטכניקה ומצביע על האזהרות הכירורגיות הקשורות לניתוח זה. בנוסף, מודגמים שינויים חשובים בהשוואה להליך הקונבנציונלי. ראשית, טלאי של אבי העורקים הבטני נחתך ומוכן כך שהביפורקטיונים הפרוקסימליים של עורק הכליה, כולל עורק השופכה עוברים יחד עם הכליה התורמת en bloc. זה מקטין את הסיכון לנמק השופכן ומונע התפתחות של חסימת דרכי השתן. שנית, שיטה חדשה של anastomosis כלי הדם הוא הוכיח המאפשר המפעיל להגדיל באופן גמיש או להקטין את גודל של anastomosis לאחר השתלת הכליה reperfusion כבר יזם. זה מונע את הפיתוח של היצרות כלי הדם ודימום intraabdominal. שלישית, מוצגת טכניקה המאפשרת את הרסטומוזה של השופכן התורם העדין ושל שלפוחית השתן המקבלת שאינה גורמת לטראומה. אימוץ פרוטוקול זה יכול לקצר את זמן הפעולה ולצמצם את הנזק לשלפוחית השתן של הנמען, ובכך להגדיל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של הניתוח עבור העכברים המקבלים.
Introduction
מאז שסקוביץ ואחרים פיתחו מודלים של השתלת כליה בעכברים בשנת 1973 בפעם הראשונה1, הוא הוכיח את עצמו ככלי ניסיוני חשוב לחקר המנגנונים של פגיעה איסכמית בהשתלה ודחייה אלואימונית, כמו גם לפיתוח טיפולים חדשים שמטרתם להאריך את הישרדות האלוגרפט ואולי להשיג סבילות אימונולוגית. עם זאת, הטכניקה הכירורגית הוכחה כמורכבת ותובענית מאוד, לעיתים עם סיבוכים כגון היצרויות אנסטומוטיות של כלי הדם המובילות לאי ספיקת כליה טרום-רנלית שאינה אימונולוגית2, כשל פוסט-פרנאלי הנגרם על ידי איסכמיה ונמק לאחר מכן של השופכן המושתל, היצרויות של האנסטומוזה של השופכן המושתל ו /או שלפוחית השתן של המושתל המובילות להפרעה בזרימת השתן. כל אלה הן סיבות מדוע השתלת כליה בעכברים לא פותחה עוד יותר ולכן אינה בשימוש נרחב. לביסוס מודל השתלת כליה יעיל ויציב לטווח ארוך של עכברים ללא סיבוכים וסקולריים ודרכי שתן עדיין יש משמעות שאין לה תחליף עבור מחקרים רבים בתחום ההשתלות תוך התמקדות במחלות כלייתיות בתיווך חיסוני אך גם זיהומיות3. בנוסף, בהשוואה להשתלות איברים אחרות במודלים של מורין כגון השתלת ריאות, לב ומעיים 4,5, מודל השתלת הכליה של העכבר מציע סיכוי לחקר הישרדות ארוכת טווח גם במסגרת פער אנטיגן היסטו-קומפטבילי גדול 3,6. כמו כן הוכח כי באותה סביבה של שילובי זן תורם-מושתל השתלות איברים שונות כגון לב או כליה מאופיינות בדינמיקה שונה ובהתחלות של דחיית allograft3. יתר על כן, מנקודת מבט נפרולוגית, זהו מודל מתאים יותר לחקר מנגנוני ויסות חיסוני בתיווך פרנכימלי בהקשר של אירועי דחייה חריפים וכרוניים מאשר ניסויים פשוטים בהשתלת עור.
על בסיס דיווחים קודמים על הטכניקה הניתוחית של השתלת כליה בעכברים 3,7,8,9, אנו מדגימים כאן את השיפורים המהימנים הבאים שיושמו בהצלחה במהלך 10 השנים האחרונות בתוך הקבוצה שלנו 10,11,12: ראשית, עורק השופכה נשמר בבטחה כאשר עורק הכליה נחתך באופן גושני יחד עם החלק המתאים של אבי העורקים הבטני. שנית, טכניקה חדשה, פשוטה ומהירה של אנסטומוזה וסקולרית ללא קשרים, שבה התפר הסופי של האנסטומוזיס אינו קשור לקצה העניבה העליונה כמו הגישה המסורתית אלא נשאר חופשי. טכניקה זו מאפשרת להגדיל או להקטין את גודל האנסטומוזיס לאחר ריפרפוזיה כלייתית כדי למנוע היצרות כלי דם ודימום תוך-אבדומינלי. שלישית, מחטי מזרק 21 G ו-30 G שימשו ככלי עזר מנחה לניקוב על מנת להשתיל את השופכן התורם בדופן שלפוחית השתן של המקבל, ובכך להפחית את הנזק לשלפוחית השתן של המקבל ולהקל על היווצרות של אנסטומוזיס ללא היצרות.
בדו"ח זה, השווינו גם את הטכניקה המסורתית, הנמצאת בשימוש נרחב, עם הטכניקה המתוקנת שהוקמה במעבדה שלנו ולא מצאנו הבדל משמעותי במידת ניוון צינוריות הכליה ופיברוזיס של השתלת כליה. במחקרים קודמים, השווינו בנוסף את התוצאות של טכניקה חדשה זו עם השיטה המקובלת במונחים של דימום מקומי, פקקת, זמן לביצוע אנסטומוזיס כלי הדם ושיעור ההישרדות. מצאנו שיפורים כגון הפחתה משמעותית של אירועי פקקת מקומיים (1.1% לעומת 6.6%), זמן מופחת להליך הרסטומוזה, והישרדות ארוכת טווח של השתלת כליות סינגנית הניתנת לשחזור (95% לעומת 84% בגישה הקלאסית)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי הנחיות ההנחיה 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות (כרטיס אתיקה לבעלי חיים: המשרד לבטיחות מזון ותרופות בסקסוניה התחתונה, #33.9-42502-04-11/0492). בצע הליכים באמצעות כלי ניתוח סטריליים וחומרים מתכלים (autoclaved) ונסה לשמור על אזור הניתוח סטרילי ככל האפשר.
הערה: עכברים זכרים C57BL/6J שימשו כתורמים ומושתלים (מודל השתלה סינגנית) בעוד שעכברי Balb/c שימשו כמושתלי אלוגרפט בכליות (מודל לחקר מודל דחייה אקוטי של אלוגרפטמודל 9). העכברים היו בני 8-12 שבועות, שקלו כ-25-30 גרם בעת ההשתלה ושוכנו בתנאים סטנדרטיים. הנתונים המדווחים בכתב יד זה נוצרו על ידי ארבעה מנתחים המנוסים בניתוח עכברים.
1. שלבי הכנה
- לצורך ניתוח, השתמש במערך של מכשירים מיקרוסקופיים, כולל מיקרו-מספריים, מיקרו-מלקחיים, מחזיק מחט, מלחציים מיקרו-המוסטטיים ועט אלקטרוכירורגי. בצעו תפרים באמצעות מונופילמנט ניילון 7/0er, 10/0er או 4/0er.
- להרדמה, הכניסו את העכבר לתוך הקופסה לצורך שאיפת איזופלורן (2%) במשך כ-40-60 שניות על מנת לגרום לחוסר הכרה.
- לאחר שהעכבר מורדם, שקלו את העכבר.
- על פי משקל העכבר, יש למרוח הזרקה תוך-צפקית של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) + קסילאזין (10 מ"ג/ק"ג) + אצפרומאזין (2 מ"ג/ק"ג) כדי להרדים את העכבר13. אשר כי העכבר מורדם על ידי התבוננות בחוסר תגובה לצביטת בוהן.
- כאשר ההרדמה נכנסה לתוקף, קוצצים את פרוות הבטן. לאחר מכן, לתקן את העכבר על שולחן הניתוח על ידי שיתוק רופף של הגפיים עם סרט מיסוך סטרילי.
- יש לחטא את בטנו של העכבר לאחר הנחת העכבר על שולחן הניתוחים. בצע חיטוי באמצעות קרצוף לסירוגין של יודיד פובידון (יודופור) ואלכוהול, שלוש פעמים (השתמש בתבנית קונצנטרית, התחל לשפשף באמצע הבטן וזז החוצה), ולאחר מכן עטף כראוי את העכבר באמצעות מגבת כירורגית מגוננת.
- החל משחת עיניים ולשמור על סטריליות לאורך כל ההליך.
הערה: אנטיביוטיקה אינה מומלצת לאורך כל ההליך מכיוון שחומרים אלה עשויים להשפיע על תגובות אימונולוגיות.
2. הליך הפעולה של התורם
- השתמש במספריים כדי לחתוך את העור ולבצע חתך בטן צולבת של כ 3-4 ס"מ. לחתוך את השרירים של דופן הבטן. מכסים ומזיזים בזהירות את הקרביים עם גזה טבולה מלוחה.
- השתמשו במטוש צמר גפן כדי להסיר בעדינות את המעיים, הקיבה והטחול לכיוון צד ימין (מנקודת המבט של העכבר), מכסים ומזיזים בזהירות את הקרביים עם גזה מלוחה.
- השתמש במלקחיים זעירים כדי לחשוף את הכליה השמאלית, אבי העורקים והווריד הנבוב התחתון (IVC).
- השתמש בעיפרון אלקטרוכירורגי כדי לצרוב את הוורידים המותניים השמאליים, כולל הענפים שמתחתיהם וכלי דם קטנים אחרים יחד עם כלי יותרת הכליה השמאלי, בזהירות.
- השתמש במיקרו מספריים ומלקחיים כדי לנתח את השופכן השמאלי ולגייס אותו בזהירות מהרקמה הסובבת אותו. נקי לחתוך אותו קרוב לשלפוחית השתן. גייסו את אזור אבי העורקים בין עורקי הכליה השמאליים והימניים באורך של כ-2 מ"מ.
- השתמש במלקחיים זעירים כדי להפריד בין הווריד התחתון האינפרא-רנלי קאווה (IVC) ואבי העורקים, ולאחר מכן השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לעבור מתחת לאבי העורקים כדי להניח עניבה רופפת של תפר משי 7-0 סביב כלי זה.
- לחצות את האזור של אבי העורקים מתחת לעורק הכליה הימני ואת הווריד הנבוב התחתון (IVC) באמצעות שני מלחציים מיקרו-וסקולריים בקוטר 5 מ"מ.
- העבר את הווריד הכליתי השמאלי מהווריד קאווה.
- השתמש במזרק כדי לשטוף את אבי העורקים עם 1 מ"ל של תמיסת מלח הפרין (60 U / mL).
- השתמש במלקחיים זעירים כדי להדק את הליגטורה המופעלת בשלב 2.5. לאחר מכן, חותכים את אבי העורקים מתחת לליגטורה, כמו גם מתחת למהדק הפרוקסימלי. עם זאת, bifurcations proximal של עורק הכליה (שים לב כי פתח העורק חייב להיות חתוך בצורה מסודרת, אחרת זה ישפיע על anastomosis) ואת עורק השופכה כלולים ו transected en bloc. הכן בזהירות, כך עורק השופכה העדין נשמר לחלוטין.
- השתמש בעיפרון האלקטרוכירורגי ובמלקחיים כדי לשחרר את הכליה השמאלית ואת כלי הדם הקשורים אליו לחלוטין על ידי זהירות זהירה בכל הרקמות המקיפות את כלי הדם שמסביב. הסר את הכליה ואחסן אותה בתמיסה מלוחה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- המתת חסד את העכבר התורם המרדים על ידי עריפת ראשים.
3. הליך פעולת הנמען
- בצע את השלבים הניתוחיים הראשוניים (כולל הרדמה ועיקור, ראה שלבים 1.1 עד 1.7) כמתואר עבור העכבר התורם.
- השתמש במספריים כדי לפתוח את הבטן באמצעות חתך חציוני (באורך של כ -2.5 ס"מ), ולאחר מכן לכסות את איברי הבטן עם גזה רטובה באמצעות תמיסת מלח.
- שמרו בזהירות על אבי העורקים האינפרא-רנלי ועל הווריד הנבוב התחתון קאווה (IVC) וודאו שכל ענף כלי גדול מצומק. השתמש גם בצריבה החשמלית כדי לנתח את השופכן השמאלי בזהירות בתנוחה קרובה לאגן הכליות. לאחר מכן, הסר את הכליה השמאלית.
- השתמשו במלקחיים זעירים ובניצני כותנה כדי לחשוף את אבי העורקים הבטני ואת הווריד הנבוב התחתון ולנתק אותם מרקמת השומן שמסביב (באורך של כ-4 מ"מ).
- השתמשו בשני מלחציים מיקרו-וסקולריים והניחו אותם באופן פרוקסימלי ודיסטלי הן על הווריד הנבוב התחתון והן על אבי העורקים הבטני בו זמנית.
- השתמש במחזיק מחט מיקרו כדי להנחות מחט מונופילמנט 10/0 (עשוי מסיבים סינתטיים עם משטח חלק) מחט תפר, אשר מונחת דרך דופן אבי העורקים באופן פרוקסימלי עד דיסטלי.
- להשיג טרשת עורקים אליפטית של כ -1 מ"מ עם אחיזה עדינה כלפי מעלה של התפר, תוך חיתוך ישירות מתחת לפנים התחתונות של המחט עם מספריים עדינים ומעוקלים.
- השתמש במיקרו מספריים כדי לחתוך את הווריד הנחות קאווה (IVC) לאורך עם אורך מספיק של כ -1.5 מ"מ. מקם חתך זה מעט מתחת למקבילו אבי העורקים.
- בצעו את האנסטומוזיס של אבי העורקים התורם והמקבל באופן מקצה לקצה. מניחים את הכליה התורמת בצד ימין של הווריד הנבוב התחתון של המקבל ומיישרים את השרוול של אבי העורקים הבטני של התורם עם האנסטומוזוזיס של אבי העורקים הבטני של המקבל.
- השתמש במחזיק מחט מיקרו ושני תפרים נפרדים של 10-0 כדי לתפור את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של האנסטומוזה.
- לאחר הקשירה, השאירו את שני התפרים הארוכים, כולל המחט, במקומם. לתפור את הצד השמאלי של דופן אבי העורקים של האנסטומוזיס ברציפות עם שני תפרים במרווחים שווים בכיוון דיסטלי-פרוקסימלי.
- לאחר התפר האחרון, הנחה את התפר דרך עובי חלקי של דופן הכלי מעל עניבת תפר השהייה העליונה.
- השתמשו במיקרו מלקחיים כדי להפעיל בו-זמנית אחיזה עדינה לקצה הקצר של עניבת התפר התחתונה.
הערה: בטכניקה חדשה זו ללא קשר, התפר האחרון אינו קשור לקצה הקצר של העניבה העליונה. - השתמש במלקחיים זעירים כדי להפוך את הכליה המושתלת למקומה הרגיל. כעת לתפור ברציפות את הקיר הימני של האנסטומוזה אבי העורקים באמצעות שלושה תפרים באופן פרוקסימלי עד דיסטלי.
הערה: בהשוואה לטכניקה הכירורגית הקונבנציונלית 7,8 התפר האחרון מתמזג עם העניבה הדיסטלית הסמוכה. אין לקשור אותו לקצה התפר התחתון, לחתוך אותו כדי להשאיר אורך חופשי של 2-3 מ"מ במקום. - בצע את האנסטומוזה הוורידית באמצעות אותו הליך תפירה כפי שתואר קודם לכן עם ההבדל כי ארבעה עד חמישה תפרים נדרשים עבור כל צד של anastomosis. התפר הסופי נותר כקצה חופשי באורך דומה בדומה לאנסטומוזיס אבי העורקים שתואר לעיל.
- לאחר השלמת שני האנסטומוזות, השתמשו במטוש יבש כדי להפעיל לחץ עדין לכיוון אזור התפירה במשך כ-10-20 שניות.
- השתמש במלקחיים אפליקטור קליפס כדי להסיר את שני המהדקים, תחילה התחתון ואז העליון. לשטוף את חלל הבטן עם 0.9% נתרן כלורי בטמפרטורה של 38 °C (76 °F).
- שימו לב לרפרפוזיה של הכליה המושתלת.
4. השתלת שופכן
- השתמשו במחזיק מחט זעיר כדי לחדור דרך שלפוחית השתן של הנמען באמצעות תפר 10/0 (מחט ישרה) והכנסו אותו ללומן מחט 21 גרם להדרכה (ראו איור משלים 1a).
- כעת הנחה את מחט 21 G לתפירת חור במקום היישום הקודם של המחט (איור משלים 1b).
- שלפו את מחט ה-21 גרם (איור משלים 1c).
- השתמשו במחזיק מחט זעירה ותפר 10/0 כדי לתפור (ללא קשירה) את קצה השופכן הגזום ולנקב את שלפוחית השתן עם תפר 10/0 זה שוב במקום כניסתו (איור משלים 1d).
- השתמשו במחזיק מחט זעיר כדי לגרור את חוט ה-10/0 ואת השופכן לשלפוחית השתן דרך החור הבנוי (איור משלים 1e).
- השתמשו במחזיק מחט זעיר ובעוד תפר של 10/0 כדי להצמיד את השופכן של התורם לשלפוחית השתן של המקבל. כאן, חברו את הקרום החיצוני של השופכן לממברנה החיצונית של דופן שלפוחית השתן, ובצעו תפרים לסירוגין עם 3 עד 4 תפרים. לבסוף, שלפו את תפר המתיחה (איור משלים 1f).
- השתמש במלקחיים כדי להחזיר את המעיים לחלל הבטן. בצעו תפרים דו-שכבתיים (תחילה שרירי הבטן ואחריהם העור) כדי לסגור את פצע הבטן באמצעות נימה של 4/0.
- מכניסים את העכברים המושתלים לחדר מבוקר חמצן וטמפרטורה לצורך התאוששות לאחר הניתוח.
- עבור משכך כאבים לאחר הניתוח, תן ישירות Metamizol 200 מ"ג / ק"ג לכל מערכת הפעלה לאחר הניתוח.
ארבע ו-16 שעות לאחר הניתוח נותנות ל-Metamizol 200 מ"ג/ק"ג לכל מערכת הפעלה בתוספת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) s.c. במעקב הנוסף, יש למרוח קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) s.c. על העכברים המושתלים כל 24 שעות במשך שלושה ימים רצופים לאחר הניתוח13. אם יש סימנים של משכך כאבים לא מספיק buprenorphine 0.05 מ"ג / ק"ג ניתן בנוסף כל 8 שעות s.c.
5. כריתת נפש והקרבה של העכבר המקבל
הערה: בצעו כריתת נפרקציה של העכבר המושתל 5 ימים לאחר ההשתלה.
- בצע את כריתת הנפרקציה של העכבר המושתל 5 ימים לאחר ההשתלה בהרדמה. מלטפים וחותכים את עורקי הכליה והוורידים הימניים האוטולוגיים של הנמען, מסירים את הכליה הימנית וסוגרים את חלל הבטן. הטיפול לאחר הניתוח ומשככי הכאבים זהים לאלה שתוארו קודם לכן (ראו שלב 4.7).
- הרם ותעד את מצב העכבר. ספק לעכבר המושתל משככי כאבים, מזון ואספקת מים לאחר הניתוח.
- ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, להקריב מחצית מהעכברים המושתלים ולבצע צביעת H&E עבור השתלות הכליה שלהם.
- 12 שבועות לאחר ההשתלה, להקריב את העכברים הנותרים ולבצע צביעת זהב מאסון של השתלות כליה אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, הן הטכניקה המתוקנת והן הטכניקה הקונבנציונלית הראו סימנים מתונים של ניוון צינורי כלייתי14,15 בהשוואה לכליות הקונטרה-צדדיות של המושתלים המקומיים (איור 1). מידת ניוון צינוריות הכליה לא הראתה הבדל משמעותי בין שתי הטכניקות השונות. הכתמת הטריכרום של מאסון גולדנרב-14,15 מהכליות 12 שבועות לאחר ההשתלה הראתה באופן אחיד סימנים ברורים של פיברוזיס של רקמת ביניים בהשוואה לכליות רגילות שלא הושתלו (איור 2).
חקרנו בעבר את התוצאה של טכניקה חדשה זו ללא קשר (n = 175) והשווינו אותה לגישה הקלאסית (n = 122) במונחים של היבטים טכניים של ההליך וסיבוכים תוך ניתוחיים ופוסט-ניתוחיים (ראו גם טבלה 1)10. הטכניקה המתוקנת המוצגת כאן נקשרה לתופעה נמוכה יותר של אירועים טרומבוטיים עורקיים תוך-עורקיים או ורידיים (איור 3b, 1.1% לעומת 6.6%). הזמן לביצוע האנסטומוזיס היה נמוך משמעותית (איור 3a), והושגה הישרדות ארוכת טווח של השתלת כליות הניתנת לשחזור (95% לעומת 84%, p < 0.001, איור 3c) כפי שנקבע על ידי הישרדות המושתל 12 שבועות לאחר ההשתלה. בנוסף, היישום של הליך השתלה שונה זה אינו משפיע על תפקוד allograft הכליות כפי שהוערך על ידי קריאטינין בסרום במהלך תקופת התצפית של 12 שבועות10.
| קונבנציונאלי | טכניקה חדשה ללא קשרים | |
| (n=122) | (n=175) | |
| זמני פעולה | ||
| זמן לאנסטומוזיס עורקי (מינימום) | 9.2 ± 0.09 | 7.5 ± 0.06** |
| הגיע הזמן לאנסטומוזיס ורידי (מינימום) | 9.1 ± 0.10 | 7.5 ± 0.05** |
| שיעורי סיבוכים | ||
| פקקת | 8 (6.6%) | 2 (1.1%)* |
| דימום מקומי | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| אחוזי הצלחה | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Rong,S., Lewis AG., Kunter U., et al. טכניקה ללא קשר להשתלת כליה בעכבר. J השתלה. Epub2012:127215,(2012). | ||
טבלה 1: השוואה של טכניקה חדשה זו (n = 175) לטכניקה הקונבנציונלית (n = 122) במונחים של היבטים טכניים של ההליך וסיבוכים תוך ניתוחיים ואחרי ניתוח10. המספרים מייצגים את זמני הפעולה בדקות של כל הליך (ממוצע ± SD).
איור 1: תוצאות היסטולוגיות מייצגות המעריכות ניוון צינורי. צביעת HE של השתלות כליה 4 שבועות לאחר ההשתלה (40x): (א) כליה רגילה שאינה מושתלת, (ב) טכניקה קונבנציונלית, ו-(ג) טכניקה שונה של השתלת כליה סינגנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תוצאות היסטולוגיות מייצגות המעריכות פיברוזיס אינטרסטיציאלי. צביעת הטריכרום של מאסון גולדנר 12 שבועות לאחר ההשתלה (פי 40) של (א) כליה רגילה שאינה מושתלת, (ב) טכניקה קונבנציונלית, ו-(ג) טכניקה שונה של השתלת כליה סינגנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: השוואה בין זמני הפעולה של אנסטומוזות כלי הדם, תדירות הסיבוכים ושיעורי ההצלחה בין הטכניקה המתוקנת לקונבנציונלית10 הברגרפים ב-(א) מתארים את זמן הפעולה הדרוש לביצוע האנסטומוזה של הכלי; הברגרפים ב-(ב) מתארים אירועי פקקת תוך-השתלית ובעיות דימום מקומיות; בעוד שהברגרפים ב-(ג) מדגימים שיעור הצלחה גבוה יותר של הטכניקה החדשה ללא קשר על פי ההישרדות העולה על 12 שבועות לאחר ההעברה לאחר ההתנסות הנוספת של הכליה הנגדית הטבעית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: סקירה כללית של המבנה האנטומי (לוחות עליונים a ו-b) וקווי הכריתה של אבי העורקים ועורק הכליה הן עבור המבנה הקונבנציונלי (c) והן עבור הטכניקה המתוקנת (d). (A) אבי העורקים הבטני, (B) עורק הכליה, (C) עורק השופכן, (D) הכליה, (E) השופכן. כלי הדם הוורידיים (V. cava, כולל Vv. renales) מתוארים כקווים מנוקדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הדגמה מופתית של תפירה ללא קשר של האנסטומוזיס של כלי העורק המציגה (A) את אבי העורקים הבטני, (B) את עורק הכליה, ו-(C) את טכניקת התפירה ללא קשר שבה התפר האחרון של האנסטומוזה אינו קשור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: אנסטומוזיס של השופכן התורם עם שלפוחית השתן של המקבל. (א) לחדור דרך שלפוחית השתן של הנמען עם מונופילמנט 10/0 ולהחדיר אותו לתוך לומן של מחט 21 G, (ב) להנחות את מחט 21 G לבצע חור הממוקם בניקוב המחט הקודם, (ג) לשלוף את מחט 21 G, (ד) לתפור את השופכן הגזום מסתיים עם תפר 10/0 ולנקב את שלפוחית השתן עם תפר 10/0 שוב במקום כניסתו, (ה) לאחר מכן, גררו את התפר 10/0 ואת השופכן לתוך שלפוחית השתן דרך החור הבנוי, (ו) ואנסטומוז את השופכן של התורם לשלפוחית השתן של המקבל עם תפר נוסף של 10/0. לבסוף, שלפו את תפר המתיחה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד שמודל השתלת העור בעכברים הוא פשוט וקל לביצוע כדי לחקור אירועי דחייה אלואימוניים, הטכניקות הכירורגיות לחקר באופן ספציפי יותר את השינויים הדלקתיים הקשורים לאלואימוניות לאחר לב16 והשתלת כליה10 הוכחו כמורכבת ותובענית מאוד. מנקודת מבטו של הנפרולוג המושתל, להקמת מודל יעיל וארוך טווח של השתלת כליה של עכברים יציבים יש עדיין משמעות שאין לה תחליף עבור מחקרים פונקציונליים ואימונולוגיים רבים. בנוסף, בהשוואה להשתלות איברים אחרות, מודל השתלת הכליה של העכבר יכול להשיג הישרדות ארוכת טווח גם עם הבדלים מסוימים באנטיגנים היסטו-קומפטביליים גדולים המרמזים על ההזדמנות לחקור מנגנוני ויסות חיסוני בהתפתחות ארוכת טווח של דחייה או זיהוי של גורמים מוקדמים כדי לבסססבילות אלואימונית 3.
כפי שתואר קודם לכן, השתלת כליה בעכברים היא הליך מאתגר, ושיעורי ההצלחה של אפילו מנתחים מנוסים נעים מאוד בין 40 ל-95%10,17,18,19,20. ביחס לדיווחים של צוותי מחקר שונים ברחבי העולם על טכניקה כירורגית זו, ביצענו את השינויים הבאים בהשוואה לגישה הקלאסית שהובילה למספר שיפורים.
ראשית, טלאי של אבי העורקים הבטני נחתך ומוכן כך שהביפורקטיונים הפרוקסימליים של עורק הכליה ועורק השופכן עוברים כריתה, כולל הכליה התורמת en bloc. תמרון זה לא רק משמר לחלוטין ומשמר את אספקת הדם והתפקוד של השופכן של התורם על ידי הימנעות מפגיעה ברקמת הפריורטרציה ובכך מונע הידרונפרוזיס לאחר הניתוח, אלא שהוא גם מונע היצרות לאחר הניתוח של עורק הכליה (איור 4). לפיכך, איסכמיה של השתלת כליה המתווכת על ידי היצרות של עורק הכליה או הנגרמת על ידי הידרונפרוזיס המתווכת על ידי שופכן מושתל קפדני ואיסכמי נמנעים, המייצגים שניים מההיבטים המרכזיים להשגת הישרדות ההשתלה לטווח הארוך במודל זה. עם זאת, ישנן גרסאות אנטומיות לצאצאים של עורק השופכה. לדוגמה, בחלק מהעכברים עורק השופכן מקורו בגזע הראשי של אבי העורקים הבטני במקום מעורק הכליה, ומיקומו של צאצא זה הוא בעיקר כ-0.2 עד 0.5 מ"מ דיסטלי מעורק הכליה (המתואר באיור 4). מניסיוננו, היינו מעריכים את התרחשותו של עורק השופכן שמקורו ישירות באבי העורקים בכ-20% מהעכברים הזכרים C57BL/6J (תצפית שלא פורסמה), ולעתים רחוקות יותר בזנים אחרים של עכברים כגון BALBc. בחלק מהשיטות הכירורגיות המסורתיות שדווחו, כלי תזונתי חשוב זה הוזנח לעתים כדי להגן עליו, שכן הוא התעלם ממנו ונקשר ישירות או עבר אלקטרוקאוטרים.
במיוחד במצבים אלה של גרסאות אנטומיות כאשר הצאצאים של עורק השופכה של העכבר מקורם בגזע הראשי של אבי העורקים הבטני מתחת לצאצאים של עורק הכליה, שיטה זו של טרנסקציה en bloc ושחזור של הרסטומוזה אבי העורקים מתאימה עוד יותר. מנתחים מנוסים יכולים אפילו להחליט מתי להשתמש באנסטומוזיס en גוש מסורתי או שונה.
שנית, היישום של טכניקה חדשה, פשוטה ומהירה של אנסטומוזיס כלי דם ללא קשרים, שבה התפר הסופי של האנסטומוזיס אינו קשור לסוף העניבה העליונה כמו הגישה המסורתית, אלא נשאר חופשי במקום זאת מציע יתרון רב ערך (ראו איור 5). טכניקה זו עדיין מאפשרת להגדיל או להקטין את גודל האנסטומוזיס לאחר השתלת כליה reperfusion כבר החלה. זה מונע את הפיתוח של היצרות כלי הדם ודימום intraabdominal. בנוסף, הזנבות החופשיים של תפרי העיגון בשני הקצוות יכולים להימשך בכיוונים מנוגדים כדי להתאים ולהרחיב בגמישות את האנסטומוזיס כדי למנוע היצרות של העורקים או הוורידים. טכניקת התפירה, אם כן, משפרת את שיעור הסבילות לתקלות בניתוח וידידותית לטירונים20.
שלישית, כדי לבצע באופן אטרומטי את האנסטומוזיס של השופכן התורם ושל שלפוחית השתן המקבלת, מחטי מזרק 21 G ו-30 G שימשו ככלי עזר לניקוב. בעכברים, השופכן הוא די רזה ועדין מאוד כדי לבצע אנסטומוזה מקצה לקצה. בדרך כלל, השופכן התורם נמשך ישירות לתוך שלפוחית השתן באמצעות מלקחיים כדי להנחות את השופכן לאחר ניקוב שלפוחית השתן עם מחט מזרק. שיפרנו עוד יותר את השיטה הזו, תוך שימוש במחט מזרק בקוטר דק יותר של 30 גרם כמדריך למחט מזרק 21 גרם (הליך סלדינגר). בעזרת טכניקה טרה-אומטית זו, מחט המזרק 21 גרם אינה חודרת לכל שלפוחית השתן, מה שמפחית את הנזק לשלפוחית השתן ואת הקושי של השתלת השופכה17 (איור משלים 1).
שלב קריטי בפרוטוקול הוא התצורה של פתח העורק. בשני המקרים (התורם והמקבל) יש לחתוך אותם בצורה מסודרת, אחרת זה ישפיע על איכות האנסטומוזה. יתר על כן, בטכניקה חדשה זו ללא קשר, התפר האחרון אינו קשור לחוט הקשור. לאחר anastomosis, המנתח צריך בתחילה לשמור על סטומה anastomotic קטן. לאחר מכן, לאחר רפרפוזיה, משכו את קצוות החוט בקצוות העליונים והתחתונים על מנת להגדיל אותו. צעד קריטי נוסף שיש להיות מודעים אליו הוא מיקום החתך של עורק הכליה התורם, שכן יש לזהות את עורק השופכה כדי להיות מוגן.
מגבלה עיקרית של טכניקה זו היא - מלבד השיפורים המתוארים - שהמפעיל עדיין צריך לעמוד בדרישות גבוהות מכיוון שקירות כלי השיט קטנים ורכים מאוד. ללא תרגול אינטנסיבי ומתמיד, שיעור ההצלחה של הניתוח יהיה נמוך.
לסיכום, דוח זה מדגים את הישימות של שינוי טכני של הליך השתלת הכליה בעכברים. הליך הניתוח שהוצג כאן הוכיח את עצמו כשיטה רבת ערך ואמינה ששימשה כמרכיב חיוני במספר פרסומי מחקר במהלך 10 השנים האחרונות 3,19,20. בהשוואה למודל הניתוחים הקלאסי והמבוסס, השיטה שהוכחה כאן מספקת מספר שיפורים חשובים שמובילים לפחות שיעורי סיבוכים ושיעור הישרדות ארוך יותר של השתלות השתלות כליה סינגניות בהגדרת3. חשוב להזכיר כי שתי הטכניקות (המתוקנות והקונבנציונליות) חולקות את אותם סיבוכים נוספים המשפיעים על תמותתו של המושתל כגון מתים על ידי נזק הקרביים, דליפת שתן, הידרונפרוזיס, זיהומים וכו ', אשר לא היה שונה. לסיכום, טכניקה כירורגית חדשה זו משפרת את שיעור ההצלחה הכולל ואת הישרדות השתלה לטווח הארוך והופכת אותה לכלי אמין לחקר התגובה האלואימונית לאחר השתלת כליה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
אנו מודים לצוות ד"ר טיאנטיאן באי על העזרה בקריינות, מיס מיאן פאו על עזרתה באיור רפואי. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) לקידום שיתופי פעולה בינלאומיים (HO2581/4-1 עד AH) והקרן הלאומית למדע של סין (NSFC; #81760291 ל- FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A.
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H.
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
