Summary
Dit protocol presenteert een nieuwe chirurgische techniek van niertransplantatie bij muizen, gericht op een aangepaste arteriële anastomosestrategie. Een vasculaire hechttechniek inclusief een eenvoudige en veiligere ureter-blaas anastomose methode wordt ook gepresenteerd. Deze wijzigingen verkorten de operatietijd en verbeteren het slagingspercentage van de niertransplantatieprocedure bij muizen.
Abstract
Niertransplantatie bij muizen is een gecompliceerde en uitdagende chirurgische procedure. Er zijn zeer weinig publicaties die de belangrijkste stappen van deze operatie aantonen. Daarom introduceert dit artikel de techniek en wijst op de chirurgische kanttekeningen die bij deze operatie horen. Bovendien worden belangrijke wijzigingen ten opzichte van de conventionele procedure aangetoond. Ten eerste wordt een pleister van de abdominale aorta gesneden en voorbereid zodat de proximale bifurcaties van de nierslagader, inclusief de ureterslagader, samen met de donornier en bloc worden doorsneden. Dit vermindert het risico op een urineleidernecrose en voorkomt de ontwikkeling van een urinewegocclusie. Ten tweede wordt een nieuwe methode van de vasculaire anastomose aangetoond waarmee de operator de grootte van de anastomose flexibel kan vergroten of verkleinen nadat de niertransplantatiereperfusie al is gestart. Dit voorkomt de ontwikkeling van vaatvernauwingen en intraabdominale bloedingen. Ten derde wordt een techniek getoond die de anastomose van de delicate donorureter en de ontvangende blaas mogelijk maakt die geen trauma veroorzaakt. Het aannemen van dit protocol kan de operatietijd verkorten en vermindert de schade aan de blaas van de ontvanger, waardoor het succespercentage van de operatie voor de ontvangende muizen aanzienlijk toeneemt.
Introduction
Sinds Sakowitz et al. in 1973 voor het eerst muismodellen van niertransplantatie ontwikkelden1, heeft het bewezen als een belangrijk experimenteel hulpmiddel om de mechanismen van transplantatie ischemische schade en alloimmune afstoting te bestuderen, evenals voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingen gericht op het verlengen van allograft overleving en mogelijk om immunologische tolerantie te bereiken. De chirurgische techniek is echter complex en zeer veeleisend gebleken, soms met complicaties zoals vasculaire anastomotische stricturen die leiden tot prerenaal niet-immunologisch niertransplantatiefalen2, postrenaal falen veroorzaakt door ischemie en daaropvolgende necrose van de getransplanteerde urineleider, stricturen van de anastomose van de getransplanteerde urineleider en / of de urineblaas van de ontvanger die leidt tot een verstoring van de urine-uitstroom. Dit zijn allemaal redenen waarom niertransplantatie bij muizen niet verder is ontwikkeld en daarom niet veel wordt gebruikt. Het opzetten van een effectief en langdurig stabiel niertransplantatiemodel voor muizen zonder vasculaire en urinewegcomplicaties heeft nog steeds onvervangbare betekenis voor veel studies op het gebied van transplantatie met focus op de nierimmuun gemedieerde maar ook infectieziekten3. Bovendien biedt het muisniertransplantatiemodel, in vergelijking met andere orgaantransplantaties in muizenmodellen zoals long-, hart- en darmtransplantatie 4,5, een kans om overleving op lange termijn te bestuderen, zelfs in de setting van grote histocompatibiliteitsantigeenongelijkheid 3,6. Het is ook aangetoond dat in dezelfde setting van donor-ontvanger stamcombinaties verschillende orgaantransplantaties zoals hart of nier worden gekenmerkt door verschillende dynamieken en aanvallen van allograftafstoting3. Bovendien is het vanuit nefrologisch oogpunt een geschikter model voor het bestuderen van parenchymale gemedieerde immuunregulerende mechanismen in de context van acute en chronische afstotingsgebeurtenissen dan eenvoudige huidtransplantatie-experimenten.
Op basis van eerdere rapporten over de chirurgische techniek van niertransplantatie bij muizen 3,7,8,9, tonen we hier de volgende betrouwbare verbeteringen aan die de afgelopen 10 jaar met succes zijn toegepast binnen onze groep 10,11,12: Ten eerste wordt de ureterslagader veilig geconserveerd terwijl de nierslagader en bloc wordt gereseceerd samen met het respectieve deel van de abdominale aorta. Ten tweede, een nieuwe, eenvoudige en snelle techniek van een knooploze vasculaire anastomose waarbij de laatste steek van anastomose niet wordt gebonden aan het uiteinde van de bovenband zoals de traditionele aanpak, maar vrij blijft. Deze techniek maakt het mogelijk om de grootte van de anastomose na nierreperfusie te vergroten of te verkleinen om vaatvernauwing en intraabdominale bloedingen te voorkomen. Ten derde werden 21 G en 30 G spuitnaalden gebruikt als een hulppunctiegeleidingstool om de donorureter in de blaaswand van de ontvanger te implanteren, waardoor de schade aan de blaas van de ontvanger werd verminderd en de vorming van strictuurvrije anastomose werd vergemakkelijkt.
In dit rapport vergeleken we ook de traditionele, veel gebruikte techniek met de gemodificeerde die in ons laboratorium is vastgesteld en vonden we geen significant verschil in de mate van renale tubulaire atrofie en niertransplantatie interstitiële weefselfibrose. In eerdere studies vergeleken we bovendien de resultaten van deze nieuwe techniek met de conventionele methode in termen van lokale bloedingen, trombose, tijd voor het uitvoeren van de vaatanastomose en overlevingskans. We vonden verbeteringen zoals significante verminderingen van lokale trombosegebeurtenissen (1,1% versus 6,6%), een kortere tijd voor de anastomoseprocedure en een zeer reproduceerbare nier syngeneïsche transplantaatoverleving op lange termijn (95% versus 84% met de klassieke benadering)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (Dierethiekkaart: Nedersaksisch Ministerie van Voedsel- en Geneesmiddelenveiligheid, #33.9-42502-04-11/0492). Voer procedures uit met behulp van steriele chirurgische instrumenten en verbruiksartikelen (geautoclaveerd) en probeer het operatiegebied zo steriel mogelijk te houden.
OPMERKING: C57BL / 6J mannelijke muizen dienden als donoren en ontvangers (syngeneïsch transplantatiemodel), terwijl Balb / c-muizen dienden als ontvangers van nier allograft (model voor het bestuderen van acute allograftafstotingsmodel9). Muizen waren tussen de 8-12 weken oud, wogen ~ 25-30 g bij transplantatie en werden onder standaardomstandigheden gehuisvest. Gegevens die in dit manuscript werden gerapporteerd, werden gegenereerd door vier chirurgen die ervaring hadden met muizenchirurgie.
1. Voorbereidende stappen
- Gebruik voor een operatie een set microscopische instrumenten, waaronder een microschaar, microtang, een naaldhouder, microhemostatische klemmen en een elektrochirurgische pen. Voer hechtingen uit met 7/0er, 10/0er of 4/0er nylon monofilament.
- Plaats voor anesthesie de muis in de doos voor inademing van isofluraan (2%) gedurende ongeveer 40-60 s om bewusteloosheid te induceren.
- Zodra de muis is verdoofd, weegt u de muis.
- Breng volgens het gewicht van de muis een intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) + xylazine (10 mg / kg) + acepromazine (2 mg / kg) toe om de muis te verdoven13. Bevestig dat de muis is verdoofd door een gebrek aan reactie op een teenknelpunt waar te nemen.
- Wanneer de anesthesie is ingetreden, knipt u de buikvacht. Bevestig vervolgens de muis op de operatietafel door de ledematen losjes te immobiliseren met een steriele afplaktape.
- Desinfecteer de buik van de muis na het plaatsen van de muis op de operatietafel. Voer desinfectie uit met afwisselend scrub van povidonjodide (jodofor) en alcohol, drie keer (gebruik concentrisch patroon, begin met scrub in het midden van de buik en beweeg naar buiten) en drapeer de muis vervolgens goed met een fenestrated chirurgische handdoek.
- Breng oogzalf aan en behoud de steriliteit tijdens de hele procedure.
OPMERKING: Antibiotica worden niet aanbevolen tijdens de hele procedure, omdat deze stoffen immunologische reacties kunnen beïnvloeden.
2. Procedure voor donoroperaties
- Gebruik een schaar om de huid te knippen en voer een kruisablantische incisie uit van ongeveer 3-4 cm. Snijd de spieren van de buikwand door. Bedek en beweeg voorzichtig de ingewanden weg met een zout gaasje.
- Gebruik een wattenstaafje om de darmen, maag en milt voorzichtig naar de rechterkant te verwijderen (vanuit het oogpunt van de muis), bedek en beweeg voorzichtig de ingewanden weg met een zoutoplossing geïmpregneerd gaas.
- Gebruik microtangen om de linker nier, aorta en inferieure vena cava (IVC) bloot te leggen.
- Gebruik een elektrochirurgisch potlood om de linker lumbale aderen, inclusief hun onderliggende takken en andere kleine bloedvaten samen met het linker bijniervat, voorzichtig dicht te schroeien.
- Gebruik een microschaar en tang om de linker urineleider te ontleden en voorzichtig uit het omliggende weefsel te mobiliseren. Snijd het schoon dicht bij de urineblaas. Mobiliseer het aortagebied tussen de linker- en rechter nierslagaders met een lengte van ongeveer 2 mm.
- Gebruik een microtang om de infrarood inferieure vena cava (IVC) en aorta te scheiden en gebruik vervolgens een gebogen tang om onder de aorta door te gaan om een losse stropdas van 7-0 zijden hechtdraad rond dit vat te plaatsen.
- Kruisklem het gebied van de aorta onder de rechter nierslagader en de inferieure vena cava (IVC) met behulp van twee microvasculaire klemmen van 5 mm.
- Transect de linker nierader van de vena cava.
- Gebruik een spuit om de aorta te spoelen met 1 ml heparine zoutoplossing (60 E/ml).
- Gebruik een microtang om de ligatuur aan te spannen die bij stap 2.5 is aangebracht. Snijd vervolgens de aorta onder de ligatuur en onder de proximale klem. Hiermee worden de proximale bifurcaties van de nierslagader (houd er rekening mee dat de arteriële opening netjes moet worden doorgesneden, anders zal dit de anastomose beïnvloeden) en de ureterale slagader opgenomen en getransecteerd en bloc. Bereid je zorgvuldig voor, zodat de delicate urineleider volledig behouden blijft.
- Gebruik het elektrochirurgische potlood en de tang om de linker nier en bijbehorende bloedvaten volledig te bevrijden door voorzichtig alle bloedvaten rondom weefsel dicht te schroeien. Verwijder de nier en bewaar deze in zoutoplossing bij 4 °C.
- Euthanaseer de verdoofde donormuis door onthoofding.
3. Procedure voor de verwerking van de ontvanger
- Voer de eerste chirurgische stappen uit (inclusief anesthesie en sterilisatie, zie stappen 1.1 tot en met 1.7) zoals beschreven voor de donormuis.
- Gebruik een schaar om de buik te openen via een mediane incisie (ongeveer 2,5 cm lang) en bedek vervolgens de buikorganen met een nat gaasje met behulp van zoutoplossing.
- Bewaar zorgvuldig de infrarood aorta en inferieure vena cava (IVC) en zorg ervoor dat elke grote vaattak is dichtgeschroeid. Gebruik ook de elektrische cautery om de linker urineleider zorgvuldig te ontleden op een positie proximaal van het nierbekken. Verwijder vervolgens de linkernier.
- Gebruik microtangen en wattenstaafjes om de abdominale aorta en inferieure vena cava bloot te leggen en los te maken van het omliggende vetweefsel (ongeveer 4 mm lang).
- Gebruik twee microvasculaire klemmen en plaats ze proximaal en distaal op zowel de inferieure vena cava als de abdominale aorta tegelijkertijd.
- Gebruik een micronaaldhouder om een 10/0 monofilament (gemaakt van synthetische vezels met een glad oppervlak) hechtnaald te geleiden, die op een proximale tot distale manier door de aortawand wordt geplaatst.
- Bereik een elliptische arteriotomie van ongeveer 1 mm met een zachte opwaartse tractie van de hechting, terwijl u direct onder het onderste gezicht van de naald snijdt met een fijne, gebogen schaar.
- Gebruik een microschaar om de inferieure vena cava (IVC) in de lengterichting te knippen met een voldoende lengte van ongeveer 1,5 mm. Plaats deze incisie iets onder zijn aorta-tegenhanger.
- Voer de donor- en ontvanger-aorta-anastomose op een end-to-side manier uit. Plaats de donornier aan de rechterkant van de inferieure vena cava van de ontvanger en lijn de manchet van de abdominale aorta van de donor uit met de anastomose van de abdominale aorta van de ontvanger.
- Gebruik een micronaaldhouder en twee afzonderlijke 10-0 hechtingen om de proximale en distale uiteinden van de anastomose te hechten.
- Laat na het binden de twee lange hechtingen, inclusief de naald, op hun plaats. Naai de linkerkant van de aortale wand van de anastomose continu met twee gelijkmatig verdeelde steken in een distale-proximale richting.
- Leid na de laatste steek de hechting door een gedeeltelijke dikte van de vaatwand boven de bovenste hechtband.
- Gebruik een microtang om tegelijkertijd zachte tractie uit te oefenen op het korte uiteinde van de onderste hechting.
OPMERKING: Bij deze nieuwe knooploze techniek wordt de laatste steek niet aan het korte uiteinde van de bovenband gebonden. - Gebruik een microtang om de getransplanteerde nier in zijn normale positie te brengen. Naai nu continu de rechterwand van de aortale anastomose met behulp van drie hechtingen op een proximale tot distale manier.
OPMERKING: In vergelijking met de conventionele chirurgische techniek 7,8 wordt de laatste hechting samengevoegd met de distale binding in de buurt. Bind het niet aan het uiteinde van de onderste hechtdraad, knip het in plaats daarvan om een vrije lengte van 2-3 mm te laten. - Voer de veneuze anastomose uit met dezelfde hechtingsprocedure als eerder beschreven met het verschil dat vier tot vijf hechtingen nodig zijn voor elke kant van de anastomose. De laatste steek wordt achtergelaten als een vrij uiteinde van vergelijkbare lengte vergelijkbaar met de hierboven beschreven aortale anastomose.
- Gebruik na het voltooien van beide anastomosen een droog wattenstaafje om gedurende ongeveer 10-20 s zachte druk uit te oefenen op het hechte gebied.
- Gebruik een clip applicator tang om beide klemmen te verwijderen, eerst de onderste dan de bovenste. Spoel de buikholte af met 0,9% natriumchloride bij een temperatuur van 38,0 °C.
- Observeer de reperfusie van de getransplanteerde nier.
4. Ureterale implantatie
- Gebruik een micronaaldhouder om met een 10/0 hechtdraad (rechte naald) door de urineblaas van de ontvanger te dringen en breng deze ter geleiding in een naaldlumen van 21 G in (zie aanvullende figuur 1a).
- Leid nu de naald van 21 G om een gat te naaien op de plaats van de vorige naaldtoepassing (aanvullende figuur 1b).
- Trek de naald van 21 G eruit (aanvullende figuur 1c).
- Gebruik een micronaaldhouder en 10/0 hechtdraad om het bijgesneden urineleideruiteinde te hechten (geen stropdas) en perforeer de blaas met deze 10/0 hechting opnieuw op de plaats van binnenkomst (aanvullende figuur 1d).
- Gebruik een micronaaldhouder om de 10/0 gloeidraad en de urineleider door het geconstrueerde gat in de urineblaas te slepen (aanvullende figuur 1e).
- Gebruik een micronaaldhouder en een andere 10/0 hechting om de urineleider van de donor te anastomoseën naar de urineblaas van de ontvanger. Verbind hier het buitenmembraan van de urineleider met het buitenmembraan van de blaaswand en voer intermitterende hechtingen uit met 3 tot 4 hechtingen. Trek ten slotte de tractienaad uit (aanvullende figuur 1f).
- Gebruik een tang om de darmen terug in de buikholte te plaatsen. Voer tweelaagse hechtingen uit (eerst de buikspieren gevolgd door de huid) om de buikwond te sluiten met behulp van een 4/0 filament.
- Plaats de getransplanteerde muizen in een zuurstof- en temperatuurgecontroleerde kamer om te herstellen na de operatie.
- Voor postoperatieve analgesie, direct geven metamizol 200 mg / kg per os na de operatie.
Vier en 16 uur na de operatie geven Metamizol 200 mg/kg per os plus Carprofen (5mg/kg) s.c. Breng in de verdere follow-up Carprofen (5 mg/kg) s.c. om de 24 uur aan op de getransplanteerde muizen gedurende drie opeenvolgende dagen na operatie13. Als er tekenen zijn van een onvoldoende analgesie buprenorfine wordt bovendien om de 8 uur s.c. 0,05 mg/kg toegediend.
5. Contralaterale nefrectomie en offer van de ontvangende muis
OPMERKING: Voer contralaterale nefrectomie uit van de ontvangende muis 5 dagen na transplantatie.
- Voer de contralaterale nefrectomie van de getransplanteerde muis 5 dagen na transplantatie onder anesthesie uit. Ligate en snijd de autologe rechter nierslagaders en aderen van de ontvanger, verwijder de rechter nier en sluit de buikholte. De postoperatieve zorg en analgesie zijn hetzelfde als eerder beschreven (zie stap 4.7).
- Verhoog en noteer de status van de muis. Zorg voor de getransplanteerde muis postoperatieve analgesie, voedsel en watervoorziening.
- Offer vier weken na de transplantatie de helft van de getransplanteerde muizen op en voer H & E-kleuring uit voor hun niertransplantaties.
- Offer 12 weken na transplantatie de resterende muizen op en voer Masson Gold-kleuring van deze niertransplantaties uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vier weken na de transplantatie vertoonden zowel de gemodificeerde techniek als de conventionele techniek matige tekenen van renale tubulaire atrofie14,15 in vergelijking met de contralaterale nieren van de inheemse ontvanger (figuur 1). De mate van atrofie van de niertubuli toonde geen significant verschil tussen de twee verschillende technieken. Masson Goldner's trichrome kleuring 14,15 van de nieren 12 weken na transplantatie vertoonde uniform duidelijke tekenen van interstitiële weefselfibrose in vergelijking met normale niet-getransplanteerde nieren (figuur 2).
We onderzochten eerder de uitkomst van deze nieuwe knooploze techniek (n = 175) en vergeleken deze met de klassieke benadering (n = 122) in termen van technische aspecten van de procedure en intraoperatieve en postoperatieve complicaties (zie ook tabel 1)10. De aangepaste techniek die hier wordt getoond, was geassocieerd met een lager voorkomen van intratransplantaat arteriële of veneuze trombotische voorvallen (figuur 3b, 1,1% versus 6,6%). De tijd om de anastomose uit te voeren was significant minder (figuur 3a) en een zeer reproduceerbare niertransplantaatoverleving op lange termijn werd bereikt (95% versus 84%, p < 0,001, figuur 3c) zoals bepaald door de overleving van de ontvanger 12 weken na transplantatie. Bovendien heeft de toepassing van deze gemodificeerde transplantatieprocedure geen invloed op de niertransplantaatfunctie zoals beoordeeld door serumcreatinine tijdens de observatieperiode van 12 weken10.
| Conventioneel | Nieuwe knooploze techniek | |
| (n=122) | (n=175) | |
| Openingstijden | ||
| Tijd voor arteriële anastomose (min) | 9,2 ± 0,09 | 7,5 ± 0,06** |
| Tijd voor veneuze anastomose (min) | 9,1 ± 0,10 | 7,5 ± 0,05** |
| Complicatiepercentages | ||
| Trombose | 8 (6.6%) | 2 (1,1%)* |
| Lokale bloedingen | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| Slagingspercentage | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Rong,S., Lewis AG., Kunter U., et al. Een knooploze techniek voor niertransplantatie bij de muis. J Transplantatie. Epub2012:127215,(2012). | ||
Tabel 1: Vergelijking van deze nieuwe techniek (n = 175) met de conventionele techniek (n = 122) in termen van technische aspecten van de procedure en intraoperatieve en postoperatieve complicaties10. Getallen vertegenwoordigen de bewerkingstijden in minuten van elke procedure (gemiddelde ± SD).
Figuur 1: Representatieve histologische resultaten ter beoordeling van tubulaire atrofie. HE Kleuring van niertransplantaties 4 weken na transplantatie (40x): (a) normale niet-getransplanteerde nier, (b) conventionele techniek en (c) gemodificeerde techniek van een syngeneïsche niertransplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve histologische resultaten ter beoordeling van interstitiële fibrose. Masson Goldner's trichrome kleuring 12 weken na transplantatie (40x) van (a) normale niet-getransplanteerde nier, (b) conventionele techniek, en (c) gemodificeerde techniek van een syngenetische niertransplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van de bedrijfstijden van vaatanastomosen, frequentie van complicaties en slagingspercentages tussen de gewijzigde en de conventionele techniek10 De bargraphs in (a) geven de bedrijfstijd weer die nodig is om de vaatanastomose uit te voeren; de staafgrafieken onder b) geven intratransplantaattrombosegebeurtenissen en lokale bloedingsproblemen weer; terwijl de staafjes in (c) een hoger slagingspercentage van de nieuwe knooploze techniek aantonen volgens de overleving groter dan 12 weken na transplantatie na extra explantatie van de inheemse contralaterale nier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Overzicht van de anatomische structuur (bovenste panelen a en b) en resectielijnen van de aorta en nierslagader voor zowel de conventionele (c) als de gemodificeerde techniek (d). (A) Abdominale aorta, (B) Nierslagader, (C) Ureterslagader, (D) Nier, (E) Ureter. De veneuze vaten (V. cava, inclusief de Vv. renales) zijn afgebeeld als stippellijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeldige demonstratie van een knooploze hechting van het slagadervat anastomose met (A) de abdominale aorta, (B) de nierslagader en (C) de knooploze stiktechniek waarbij de laatste steek van de anastomose niet is gebonden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Anastomose van de donorureter met de urineblaas van de ontvanger. (a) penetreer door de urineblaas van de ontvanger met een 10/0 monofilament en steek het in het lumen van een naald van 21 G, (b) Leid de 21 G naald om een gat uit te voeren dat zich bij de vorige naaldperforatie bevindt, (c) trek de naald van 21 G eruit, (d) steek het getrimde urineleideruiteinde met de 10/0 hechting en perforeer de blaas met de 10/0 hechting opnieuw op de plaats van binnenkomst, e) vervolgens de 10/0 hechting en de urineleider door het geconstrueerde gat in de urineblaas te slepen, f) en de urineleider van de donor met nog een 10/0 hechting naar de blaas van de ontvanger te anastomeren. Trek ten slotte de tractiehecht eruit. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel het huidtransplantatiemodel bij muizen eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren is om alloimmune afstotingsgebeurtenissen te bestuderen, is bewezen dat de chirurgische technieken voor het onderzoeken van meer specifiek de alloimmune-gerelateerde ontstekingsveranderingen na hart16 en niertransplantatie10 complex en zeer veeleisend zijn. Vanuit het oogpunt van de transplantatienefroloog heeft de oprichting van een effectief en langdurig stabiel muisniertransplantatiemodel nog steeds een onvervangbare betekenis voor veel functionele en immunologische studies. Bovendien kan het niertransplantatiemodel van muizen, in vergelijking met andere orgaantransplantaties, een langdurige overleving bereiken, zelfs met bepaalde verschillen in belangrijke histocompatibiliteitsantigenen, wat de mogelijkheid impliceert voor het bestuderen van immuunregulatiemechanismen in de langetermijnontwikkeling van zowel afstoting als de identificatie van vereiste factoren om alle tolerantie vast te stellen3.
Zoals eerder beschreven, is niertransplantatie bij muizen een uitdagende procedure en de slagingspercentages van zelfs ervaren chirurgen variëren sterk tussen 40 en 95% 10,17,18,19,20. Met betrekking tot de rapporten van verschillende onderzoeksteams over de hele wereld over deze chirurgische techniek, hebben we de volgende wijzigingen aangebracht in vergelijking met de klassieke aanpak die tot verschillende verbeteringen heeft geleid.
Eerst wordt een pleister van de abdominale aorta gesneden en voorbereid zodat de proximale bifurcaties van de nierslagader en de urineleiderslagader worden doorsneden, inclusief de donornier en bloc. Deze manoeuvre behoudt en behoudt niet alleen de bloedtoevoer en -functie van de urineleider van de donor volledig door een verwonding aan het periureterale weefsel te voorkomen, waardoor een postoperatieve hydronefrose wordt voorkomen, maar het voorkomt ook postoperatieve vernauwingen van de nierslagader (figuur 4). Vandaar dat niertransplantatie-ischemie gemedieerd door een strictuur van de nierslagader of veroorzaakt door een hydronefrose gemedieerd door een vernauwde en ischemische transplantatie-urineleider wordt vermeden, wat twee van de belangrijkste aspecten vertegenwoordigt om de langetermijntransplantatieoverleving in dit model te bereiken. Er zijn echter anatomische varianten voor de nakomelingen van de ureterslagader. Bij sommige muizen is de urineleider bijvoorbeeld afkomstig van de hoofdstam van de abdominale aorta in plaats van van de nierslagader en de positie van dit nageslacht is meestal ongeveer 0,2 tot 0,5 mm distale van de nakomelingen van de nierslagader (afgebeeld in figuur 4). Vanuit onze ervaring zouden we het voorkomen van de ureterale slagader rechtstreeks afkomstig van de aorta schatten bij ongeveer 20% van de C57BL / 6J mannelijke muizen (ongepubliceerde observatie), en meer zelden in andere muizenstammen zoals BALBc. In sommige van de gerapporteerde traditionele chirurgische methoden werd dit belangrijke voedingsvat soms verwaarloosd om te beschermen, omdat het werd genegeerd en direct werd geligeerd of geëlektrocautereerd.
Vooral in deze situaties van anatomische varianten wanneer de nakomelingen van de ureterslagader van de muis afkomstig zijn van de hoofdstam van de abdominale aorta onder de nakomelingen van de nierslagader, is deze methode van en bloc transsectie en reconstructie van de aorta-anastomose nog geschikter. Ervaren chirurgen kunnen zelfs beslissen wanneer ze de traditionele of gemodificeerde en bloc anastomose gebruiken.
Ten tweede biedt de toepassing van een nieuwe, eenvoudige en snelle techniek van een knooploze vasculaire anastomose waarbij de laatste steek van anastomose niet wordt gebonden aan het uiteinde van de bovenband zoals de traditionele aanpak, maar in plaats daarvan vrij blijft, een waardevol voordeel (zie figuur 5). Deze techniek maakt het nog steeds mogelijk om de grootte van de anastomose te vergroten of te verkleinen nadat de niertransplantatiereperfusie al is gestart. Dit voorkomt de ontwikkeling van vaatvernauwingen en intraabdominale bloedingen. Bovendien kunnen de vrije staarten van de verankeringsteken aan beide uiteinden in tegengestelde richtingen worden getrokken om de anastomose flexibel aan te passen en uit te breiden om stenose van de slagaders of aderen te voorkomen. De stiktechniek verbetert daarom de fouttolerantie van de operatie en is vriendelijk voor beginners20.
Ten derde, om de anastomose van de donorureter en de ontvangende blaas atraumatisch uit te voeren, werden 21 G en 30 G spuitnaalden gebruikt als hulpmiddelen voor punctiegeleiding. Bij muizen is de urineleider vrij dun en zeer delicaat om een end-to-end anastomose uit te voeren. Meestal wordt de donorureter direct in de blaas getrokken met behulp van een tang om de urineleider te begeleiden na het perforeren van de blaas met een spuitnaald. We hebben deze methode verder verbeterd door een spuitnaald met een dunnere diameter van 30 G als leidraad voor de 21 G spuitnaald (Seldinger-procedure) te gebruiken. Met deze atraumatische techniek dringt de 21 G spuitnaald niet de hele blaas binnen, wat de schade aan de blaas en de moeilijkheid van de ureterale implantatievermindert 17 (aanvullende figuur 1).
Een cruciale stap van het protocol is de configuratie van de arteriële opening. In beide gevallen (donor en ontvanger) moeten deze netjes worden gesneden, anders zal dit de kwaliteit van de anastomose beïnvloeden. Bovendien wordt bij deze nieuwe knooploze techniek de laatste steek niet aan de geknoopte draad gebonden. Na anastomose moet de chirurg in eerste instantie de anastomotische stoma klein houden. Trek vervolgens, na reperfusie, aan de uiteinden van de draad aan de bovenste en onderste uiteinden om deze te vergroten. Een andere kritieke stap waarvan men zich bewust moet zijn, is de positionering van de incisie van de nierslagader van de donor, omdat de ureterslagader moet worden geïdentificeerd om te worden beschermd.
Een belangrijke beperking van deze techniek is - naast de beschreven verbeteringen - dat de operator nog steeds aan hoge eisen moet voldoen omdat de scheepswanden klein en zeer zacht zijn. Zonder intensieve en volhardende oefening zal het slagingspercentage van de operatie laag zijn.
Samenvattend toont dit rapport de toepasbaarheid aan van een technische wijziging van de niertransplantatieprocedure bij muizen. De hier gepresenteerde chirurgische procedure heeft bewezen als een waardevolle en betrouwbare methode die diende als een essentieel onderdeel van verschillende onderzoekspublicaties in de afgelopen 10 jaar 3,19,20. In vergelijking met het klassieke en algemeen gevestigde operatiemodel biedt de hier gedemonstreerde methode verschillende belangrijke verbeteringen die leiden tot minder complicatiepercentages en een langere overlevingskans van de transplantatie in de syngene niertransplantatiesetting3. Het is belangrijk om te vermelden dat beide technieken (gemodificeerd en conventioneel) dezelfde verdere complicaties delen die van invloed zijn op de mortaliteit van de ontvanger, zoals overlijden door viscerale schade, urineverlies, hydronefrose, infecties, enz., Die niet verschilden. Kortom, deze nieuwe chirurgische techniek verbetert het algehele slagingspercentage en de overleving van het transplantaat op lange termijn, waardoor het een betrouwbaar hulpmiddel is voor het bestuderen van de alloimmune respons na niertransplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
We bedanken het Dr. Tiantian Bai-team voor hulp bij voice-over, Miss Mian Pao voor haar hulp bij medische illustratie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de German Research Foundation (DFG) om internationale samenwerkingen (HO2581/4-1 tot AH) en de National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 aan FJ) te bevorderen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A.
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H.
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
