Summary
Este protocolo presenta una nueva técnica quirúrgica de trasplante renal de ratón centrada en una estrategia de anastomosis arterial modificada. También se presenta una técnica de sutura vascular que incluye un método de anastomosis uréter-vejiga simple y seguro. Estas modificaciones acortan el tiempo de operación y mejoran la tasa de éxito del procedimiento de trasplante de riñón en ratones.
Abstract
El trasplante de riñón en ratones es un procedimiento quirúrgico complicado y desafiante. Hay muy pocas publicaciones que demuestren los pasos clave de esta operación. Por lo tanto, este artículo presenta la técnica y señala las advertencias quirúrgicas asociadas con esta operación. Además, se demuestran modificaciones importantes en comparación con el procedimiento convencional. En primer lugar, se corta y prepara un parche de la aorta abdominal para que las bifurcaciones proximales de la arteria renal, incluida la arteria ureteral, se transecten junto con el riñón del donante en bloque. Esto reduce el riesgo de una necrosis del uréter y evita el desarrollo de una oclusión del tracto urinario. En segundo lugar, se demuestra un nuevo método de anastomosis vascular que permite al operador aumentar o disminuir de manera flexible el tamaño de la anastomosis después de que ya se haya iniciado la reperfusión del trasplante renal. Esto evita el desarrollo de estenosis de los vasos y sangrado intraabdominal. En tercer lugar, se muestra una técnica que permite la anastomosis del delicado uréter donante y de la vejiga receptora que no causa un traumatismo. La adopción de este protocolo puede acortar el tiempo de operación y reducir el daño a la vejiga del receptor, lo que aumenta significativamente la tasa de éxito de la operación para los ratones receptores.
Introduction
Desde que Sakowitz et al. desarrollaron modelos de trasplante renal en 1973 por primera vez1, ha demostrado ser una importante herramienta experimental para estudiar los mecanismos de la lesión isquémica del trasplante y el rechazo aloinmune, así como para desarrollar nuevos tratamientos destinados a prolongar la supervivencia del aloinjerto y posiblemente lograr la tolerancia inmunológica. Sin embargo, la técnica quirúrgica ha demostrado ser compleja y muy exigente, a veces con complicaciones como estenosis anastomóticas vasculares que conducen a insuficiencia prerrenal no inmunológica del trasplante renal2, insuficiencia posrenal causada por isquemia y posterior necrosis del uréter trasplantado, estenosis de la anastomosis del uréter trasplantado y/o vejiga urinaria del receptor que conduce a una interrupción del flujo urinario. Todas estas son razones por las que el trasplante renal en ratones no se ha desarrollado más y, por lo tanto, no se usa ampliamente. Establecer un modelo de trasplante renal de ratón estable y efectivo a largo plazo sin complicaciones vasculares y del tracto urinario todavía tiene un significado insustituible para muchos estudios en el campo del trasplante con enfoque en las enfermedades inmunomediadas por el riñón pero también infecciosas3. Además, en comparación con otros trasplantes de órganos en modelos murinos como el trasplante de pulmón, corazón e intestino 4,5, el modelo de trasplante de riñón de ratón ofrece una oportunidad para estudiar la supervivencia a largo plazo incluso en el contexto de una gran disparidad de antígenos de histocompatibilidad 3,6. También se ha demostrado que en el mismo contexto de combinaciones de cepa donante-receptor diferentes trasplantes de órganos como corazón o riñón se caracterizan por diferentes dinámicas e inicios de rechazo del aloinjerto3. Además, desde el punto de vista nefrológico, es un modelo más adecuado para estudiar los mecanismos de regulación inmune mediados por parénquimas en el contexto de eventos de rechazo agudo y crónico que los simples experimentos de trasplante de piel.
Sobre la base de informes previos sobre la técnica quirúrgica de trasplante renal en ratones 3,7,8,9, aquí demostramos las siguientes mejoras fiables que se han aplicado con éxito durante los últimos 10 años dentro de nuestro grupo 10,11,12: En primer lugar, la arteria ureteral se conserva de forma segura a medida que la arteria renal se reseca en bloque. junto con la parte respectiva de la aorta abdominal. En segundo lugar, una técnica nueva, simple y rápida de una anastomosis vascular sin nudos en la que la puntada final de la anastomosis no se ata con el extremo de la corbata superior como el enfoque tradicional, sino que permanece libre. Esta técnica permite aumentar o disminuir el tamaño de la anastomosis después de la reperfusión renal para evitar la estenosis de los vasos y el sangrado intraabdominal. En tercer lugar, se utilizaron agujas de jeringa de 21 G y 30 G como herramienta auxiliar de guía de punción para implantar el uréter donante en la pared de la vejiga del receptor reduciendo el daño a la vejiga del receptor y facilitando la formación de anastomosis libre de estenosis.
En este informe también comparamos la técnica tradicional y ampliamente utilizada con la modificada que se establece en nuestro laboratorio y no encontramos diferencias significativas en el grado de atrofia tubular renal y fibrosis del tejido intersticial trasplantado renal. En estudios previos, además, comparamos los resultados de esta nueva técnica con el método convencional en cuanto a hemorragia local, trombosis, tiempo de realización de la anastomosis del vaso y tasa de supervivencia. Se encontraron mejoras como reducciones significativas de los eventos de trombosis local (1,1% versus 6,6%), una reducción del tiempo para el procedimiento de anastomosis y una supervivencia a largo plazo del injerto singénico renal altamente reproducible (95% versus 84% con el enfoque clásico)10.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos (Tarjeta de ética animal: Ministerio de Seguridad Alimentaria y Farmacéutica de Baja Sajonia, # 33.9-42502-04-11/0492). Realice procedimientos utilizando instrumentos quirúrgicos estériles y consumibles (autoclave) y trate de mantener el área de operación lo más estéril posible.
NOTA: Los ratones machos C57BL/6J sirvieron como donantes y receptores (modelo de trasplante singénico) mientras que los ratones Balb/c sirvieron como receptores de aloinjerto renal (modelo para estudiar el modelo de rechazo agudo de aloinjerto9). Los ratones tenían entre 8 y 12 semanas de edad, pesaban ~ 25-30 g en el trasplante y fueron alojados en condiciones estándar. Los datos reportados en este manuscrito fueron generados por cuatro cirujanos con experiencia en cirugía con ratones.
1. Pasos preparatorios
- Para la cirugía, use un conjunto de instrumentos microscópicos, que incluyen una microjera, microfórceps, un soporte de aguja, abrazaderas micro hemostáticas y una pluma electroquirúrgica. Realice suturas con monofilamento de nylon 7/0er, 10/0er o 4/0er.
- Para la anestesia, coloque el ratón en la caja para la inhalación de isoflurano (2%) durante unos 40-60 s con el fin de inducir la inconsciencia.
- Una vez que el ratón esté anestesiado, pese el ratón.
- De acuerdo con el peso del ratón, aplique una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) + xilazina (10 mg / kg) + acepromazina (2 mg / kg) para anestesiar al ratón13. Confirme que el ratón está anestesiado observando una falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie.
- Cuando la anestesia haya hecho efecto, recorte el pelaje abdominal. Luego, fije el mouse en la mesa de operaciones inmovilizando libremente las extremidades con una cinta adhesiva estéril.
- Desinfecte el abdomen del ratón después de colocarlo en la mesa de operaciones. Realice la desinfección utilizando un exfoliante alterno de yoduro de povidona (yodóforo) y alcohol, tres veces (use un patrón concéntrico, comience a frotar en el medio del abdomen y muévase hacia afuera), y luego cubra adecuadamente al ratón con una toalla quirúrgica fenestrada.
- Aplique ungüento para los ojos y mantenga la esterilidad durante todo el procedimiento.
NOTA: No se recomiendan antibióticos durante todo el procedimiento, ya que estas sustancias pueden influir en las respuestas inmunológicas.
2. Procedimiento de operación del donante
- Use tijeras para cortar la piel y realice una incisión abdominal cruzada de aproximadamente 3-4 cm. Cortar los músculos de la pared abdominal. Cubra y retire con precaución las vísceras con una gasa salina bebida.
- Use un hisopo de algodón para extraer suavemente los intestinos, el estómago y el bazo hacia el lado derecho (desde el punto de vista del ratón), cubra y aleje con precaución las vísceras con una gasa salina.
- Use micro fórceps para exponer el riñón izquierdo, la aorta y la vena cava inferior (IVC).
- Use un lápiz electroquirúrgico para cauterizar las venas lumbares izquierdas, incluidas sus ramas subyacentes y otros vasos pequeños junto con el vaso suprarrenal izquierdo, con cuidado.
- Use micro tijeras y fórceps para diseccionar el uréter izquierdo y movilizarlo cautelosamente del tejido circundante. Límpielo cerca de la vejiga urinaria. Movilizar la región aórtica entre las arterias renales izquierda y derecha de aproximadamente 2 mm de longitud.
- Use micro fórceps para separar la vena cava inferior infrarrenal (IVC) y la aorta, y luego use pinzas curvas para pasar por debajo de la aorta para colocar una corbata suelta de sutura de seda 7-0 alrededor de este recipiente.
- Pinza cruzada el área de la aorta por debajo de la arteria renal derecha y la vena cava inferior (IVC) utilizando dos pinzas microvasculares de 5 mm.
- Transecte la vena renal izquierda de la vena cava.
- Use una jeringa para enjuagar la aorta con 1 ml de solución salina de heparina (60 U/ml).
- Use micro pinzas para apretar la ligadura aplicada en el paso 2.5. Luego, corte la aorta debajo de la ligadura, así como debajo de la pinza proximal. Con esto, las bifurcaciones proximales de la arteria renal (tenga en cuenta que la abertura arterial debe cortarse cuidadosamente, de lo contrario afectará la anastomosis) y la arteria ureteral se incluyen y transectan en bloque. Prepárese cuidadosamente, de modo que la delicada arteria ureteral se conserve por completo.
- Use el lápiz electroquirúrgico y las fórceps para liberar completamente el riñón izquierdo y los vasos asociados cauterizando cautelosamente todo el tejido circundante del vaso. Retire el riñón y guárdelo en solución salina a 4 °C.
- Sacrificar al ratón donante anestesiado por decapitación.
3. Procedimiento de operación del destinatario
- Realice los pasos quirúrgicos iniciales (incluida la anestesia y la esterilización, consulte los pasos 1.1 a 1.7) como se describe para el ratón donante.
- Use tijeras para abrir el abdomen a través de una incisión mediana (aproximadamente 2,5 cm de longitud) y luego cubra los órganos abdominales con una gasa húmeda con solución salina.
- Conserve cuidadosamente la aorta infrarrenal y la vena cava inferior (IVC) y asegúrese de que cada rama de vaso grande esté cauterizada. Use también el cauterizado eléctrico para diseccionar el uréter izquierdo cuidadosamente en una posición proximal a la pelvis renal. Luego, retire el riñón izquierdo.
- Use micro pinzas y bastoncillos de algodón para exponer la aorta abdominal y la vena cava inferior y separarlas del tejido adiposo circundante (aproximadamente más de 4 mm de longitud).
- Use dos pinzas microvasculares y colóquelas proximal y distalmente tanto en la vena cava inferior como en la aorta abdominal simultáneamente.
- Use un soporte de microagujas para guiar una aguja de sutura de monofilamento 10/0 (hecha de fibra sintética con una superficie lisa), que se coloca a través de la pared de la aorta de manera proximal a distal.
- Lograr una arteriotomía elíptica de aproximadamente 1 mm con una suave tracción hacia arriba de la sutura, mientras se corta directamente debajo de la cara inferior de la aguja con tijeras finas y curvas.
- Utilice micro tijeras para cortar la vena cava inferior (IVC) longitudinalmente con una longitud suficiente de aproximadamente 1,5 mm. Coloque esta incisión ligeramente por debajo de su contraparte aórtica.
- Realizar la anastomosis de la aorta del donante y del receptor de forma integral. Coloque el riñón del donante en el lado derecho de la vena cava inferior del receptor alineando el manguito de la aorta abdominal del donante con la anastomosis de la aorta abdominal del receptor.
- Use un soporte de microaguja y dos suturas separadas de 10-0 para coser los extremos proximal y distal de la anastomosis.
- Después de atar, deje las dos suturas largas, incluida la aguja, en su lugar. Cose el lado izquierdo de la pared aortal de la anastomosis continuamente con dos puntos espaciados uniformemente en dirección distal-proximal.
- Después de la última puntada, guíe la sutura a través de un grosor parcial de la pared del recipiente por encima de la atadura de sutura de la estancia superior.
- Use micro pinzas para ejercer simultáneamente una tracción suave hacia el extremo corto de la corbata de sutura inferior.
NOTA: En esta nueva técnica sin nudos, la última puntada no está atada al extremo corto de la corbata superior. - Use micro fórceps para voltear el riñón trasplantado a su posición normal. Ahora cose continuamente la pared derecha de la anastomosis aortal utilizando tres puntos de sutura de manera proximal a distal.
NOTA: En comparación con la técnica quirúrgica convencional 7,8 la última sutura se fusiona con el lazo distal cercano. No lo ate al extremo de la sutura inferior, córtelo para dejar una longitud libre de 2-3 mm en su lugar. - Realice la anastomosis venosa utilizando el mismo procedimiento de sutura descrito anteriormente con la diferencia de que se necesitan de cuatro a cinco puntos de sutura para cada lado de la anastomosis. La puntada final se deja como un extremo libre de longitud similar a la anastomosis aortal descrita anteriormente.
- Después de completar ambas anastomosis, use un hisopo seco para ejercer una presión suave hacia el área suturada durante aproximadamente 10-20 s.
- Use un aplicador de clip pinzas para quitar ambas abrazaderas, primero la inferior y luego la superior. Enjuague la cavidad abdominal con cloruro de sodio al 0,9% a una temperatura de 38,0 °C.
- Observe la reperfusión del riñón trasplantado.
4. Implantación ureteral
- Use un soporte de microaguja para penetrar a través de la vejiga urinaria del receptor con una sutura de 10/0 (aguja recta) e insértela en un lumen de aguja de 21 G para obtener orientación (consulte la Figura suplementaria 1a).
- Ahora guíe la aguja de 21 G para coser un orificio en el lugar de la aplicación de la aguja anterior (Figura suplementaria 1b).
- Extraiga la aguja de 21 G (Figura suplementaria 1c).
- Use un soporte de microagujas y una sutura de 10/0 para coser (sin atar) el extremo del uréter recortado y perforar la vejiga con esta sutura de 10/0 nuevamente en el lugar de su entrada (Figura suplementaria 1d).
- Use un soporte de microaguja para remolcar el filamento 10/0 y el uréter en la vejiga de orina a través del orificio construido (Figura suplementaria 1e).
- Use un soporte de microaguja y otra sutura 10/0 para anastomosear el uréter del donante a la vejiga urinaria del receptor. Aquí, conecte la membrana externa del uréter a la membrana externa de la pared de la vejiga y realice suturas intermitentes con 3 a 4 puntos de sutura. Finalmente, extraiga la sutura de tracción (Figura suplementaria 1f).
- Use fórceps para colocar los intestinos de nuevo en la cavidad abdominal. Realice suturas de dos capas (primero los músculos abdominales seguidos de la piel) para cerrar la herida abdominal utilizando un filamento 4/0.
- Coloque a los ratones trasplantados en una cámara de oxígeno y temperatura controlada para recuperarse después de la cirugía.
- Para la analgesia postoperatoria, administre directamente Metamizol 200 mg/kg por os después de la operación.
Cuatro y 16 h después de la operación administrar Metamizol 200 mg/kg por os más Carprofeno (5mg/kg) s.c. En el seguimiento posterior, aplique Carprofeno (5 mg / kg) s.c. a los ratones trasplantados cada 24 horas durante tres días consecutivos después de la operación13. Si hay signos de una analgesia insuficiente, buprenorfina se administra adicionalmente 0,05 mg/kg cada 8 h s.c.
5. Nefrectomía contralateral y sacrificio del ratón receptor
NOTA: Realice una nefrectomía contralateral del ratón receptor 5 días después del trasplante.
- Realizar la nefrectomía contralateral del ratón trasplantado 5 días después del trasplante bajo anestesia. Ligar y cortar las arterias y venas renales derechas autólogas del receptor, extirpar el riñón derecho y cerrar la cavidad abdominal. Los cuidados postoperatorios y la analgesia son los mismos que se describieron anteriormente (ver paso 4.7).
- Eleva y registra el estado del ratón. Proporcionar al ratón trasplantado analgesia postoperatoria, alimentos y suministro de agua.
- Cuatro semanas después del trasplante, sacrifique la mitad de los ratones trasplantados y realice tinción de H&E para sus trasplantes de riñón.
- 12 semanas después del trasplante, sacrifique los ratones restantes y realice la tinción Masson Gold de estos trasplantes de riñón.
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Representative Results
Cuatro semanas después del trasplante, tanto la técnica modificada como la técnica convencional mostraron signos moderados de atrofia tubular renal14,15 en comparación con los riñones contralaterales del receptor nativo (Figura 1). El grado de atrofia de los túbulos renales no demostró diferencias significativas entre las dos técnicas diferentes. La tinción tricrómica de Masson Goldneren 14,15 de los riñones 12 semanas después del trasplante mostró de manera uniforme signos obvios de fibrosis del tejido intersticial en comparación con los riñones normales no trasplantados (Figura 2).
Previamente se investigó el resultado de esta nueva técnica sin nudos (n = 175) y se comparó con el enfoque clásico (n = 122) en cuanto a aspectos técnicos del procedimiento y complicaciones intraoperatorias y postoperatorias (ver también Tabla 1)10. La técnica modificada que aquí se muestra se asoció con una menor ocurrencia de eventos trombóticos arteriales o venosos intrainjertos (Figura 3b, 1,1% versus 6,6%). El tiempo para realizar la anastomosis fue significativamente menor (Figura 3a), y se logró una supervivencia a largo plazo del injerto renal altamente reproducible (95% versus 84%, p < 0,001, Figura 3c) según lo determinado por la supervivencia del receptor 12 semanas después del trasplante. Además, la aplicación de este procedimiento de trasplante modificado no afecta a la función de aloinjerto renal evaluada por la creatinina sérica durante el período de observación de 12 semanas10.
| Convencional | Nueva técnica sin nudos | |
| (n=122) | (n=175) | |
| Tiempos de operación | ||
| Tiempo para la anastomosis arterial (min) | 9,2 ± 0,09 | 7,5 ± 0,06** |
| Tiempo para la anastomosis venosa (min) | 9,1 ± 0,10 | 7,5 ± 0,05** |
| Tasas de complicaciones | ||
| Trombosis | 8 (6.6%) | 2 (1,1%)* |
| Sangrado local | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| Tasa de éxito | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Rong, S., Lewis AG., Kunter U., et al. Una técnica sin nudos para el trasplante de riñón en el ratón. J Trasplante. Epub2012:127215,(2012). | ||
Tabla 1: Comparación de esta nueva técnica (n = 175) con la técnica convencional (n = 122) en cuanto a aspectos técnicos del procedimiento y complicaciones intraoperatorias y postoperatorias10. Los números representan los tiempos de operación en minutos de cada procedimiento (media ± SD).
Figura 1: Resultados histológicos representativos valorando la atrofia tubular. TINCIÓN HE de trasplantes renales 4 semanas después del trasplante (40x): (a) riñón normal no trasplantado, (b) técnica convencional y (c) técnica modificada de un trasplante renal singénico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados histológicos representativos evaluando la fibrosis intersticial. Tinción tricrómica de Masson Goldner 12 semanas después del trasplante (40x) de (a) riñón normal no trasplantado, (b) técnica convencional y (c) técnica modificada de un trasplante renal singénico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de los tiempos de operación de las anastomosis de los vasos, la frecuencia de las complicaciones y las tasas de éxito entre la técnica modificada y la convencional10 Los gráficos de barras en (a) representan el tiempo de operación necesario para realizar la anastomosis del vaso; los gráficos de barras en (b) representan eventos de trombosis intrainjerto y problemas de sangrado local; mientras que los bargrafías en (c) demuestran una mayor tasa de éxito de la nueva técnica sin nudos según la supervivencia superior a 12 semanas posttrasplante después de la explantación adicional del riñón contralateral nativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Visión general de la estructura anatómica (paneles superiores a y b) y líneas de resección de la aorta y la arteria renal tanto para la técnica convencional (c) como para la modificada (d). (A) Aorta abdominal, (B) Arteria renal, (C) Arteria uréter, (D) Riñón, (E) Uréter. Los vasos venosos (V. cava, incluyendo el Vv. renales) se representan como líneas punteadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Demostración ejemplar de una sutura sin nudos de la anastomosis del vaso arterial que muestra (A) la aorta abdominal, (B) la arteria renal y (C) la técnica de sutura sin nudos donde no se ata la última puntada de la anastomosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Anastomosis del uréter donante con la vejiga urinaria del receptor. (a) Penetrar a través de la vejiga urinaria del receptor con un monofilamento de 10/0 e insertarlo en la luz de una aguja de 21 G, (b) Guiar la aguja de 21 G para realizar un orificio ubicado en la perforación de la aguja anterior, (c) extraer la aguja de 21 G, (d) coser el extremo del uréter recortado con la sutura 10/0 y perforar la vejiga con la sutura 10/0 nuevamente en el lugar de su entrada, (e) luego, remolcar la sutura 10/0 y el uréter a la vejiga de orina a través del orificio construido, (f) y anastomosear el uréter del donante a la vejiga del receptor con otra sutura 10/0. Finalmente, saca la sutura de tracción. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Si bien el modelo de trasplante de piel en ratones es simple y fácil de realizar para estudiar los eventos de rechazo aloinmune, las técnicas quirúrgicas para investigar más específicamente las alteraciones inflamatorias relacionadas con aloinmuno después del corazón16 y el trasplante de riñón10 han demostrado ser complejas y muy exigentes. Desde el punto de vista del nefrólogo de trasplantes, el establecimiento de un modelo de trasplante renal de ratón estable y efectivo a largo plazo sigue teniendo un significado insustituible para muchos estudios funcionales e inmunológicos. Además, en comparación con otros trasplantes de órganos, el modelo de trasplante renal de ratón puede lograr una supervivencia a largo plazo incluso con ciertas diferencias en los principales antígenos de histocompatibilidad, lo que implica la oportunidad de estudiar los mecanismos de regulación inmune en el desarrollo a largo plazo tanto del rechazo como de la identificación de factores previos para establecer la tolerancia aloinmune3.
Como se describió anteriormente, el trasplante de riñón en ratones es un procedimiento desafiante, y las tasas de éxito incluso de los cirujanos experimentados varían ampliamente entre el 40 y el 95%10,17,18,19,20. Con respecto a los informes de varios equipos de investigación de todo el mundo sobre esta técnica quirúrgica, hemos realizado las siguientes modificaciones en comparación con el enfoque clásico que conducen a varias mejoras.
Primero, se corta un parche de la aorta abdominal y se prepara para que se transecten las bifurcaciones proximales de la arteria renal y la arteria ureteral, incluido el riñón del donante en bloque. Esta maniobra no solo preserva y retiene completamente el riego sanguíneo y la función del uréter del donante al evitar una lesión en el tejido periureteral evitando así una hidronefrosis postoperatoria, sino que también previene las estenosis postoperatorias de la arteria renal (Figura 4). De ahí que se evite la isquemia de trasplante renal mediada por una estenosis de la arteria renal o causada por una hidronefrosis mediada por un uréter de trasplante estenificado e isquémico, lo que representa dos de los aspectos clave para lograr la supervivencia del trasplante a largo plazo en este modelo. Sin embargo, existen variantes anatómicas para la descendencia de la arteria ureteral. Por ejemplo, en algunos ratones, la arteria ureteral se origina en el tronco principal de la aorta abdominal en lugar de la arteria renal y la posición de esta descendencia es principalmente de aproximadamente 0,2 a 0,5 mm distal de la descendencia de la arteria renal (representada en la Figura 4). A partir de nuestra experiencia, estimaríamos la aparición de la arteria ureteral que se origina directamente en la aorta en aproximadamente el 20% de los ratones machos C57BL / 6J (observación no publicada), y más raramente en otras cepas de ratones como BALBc. En algunos de los métodos quirúrgicos tradicionales reportados, este importante vaso nutritivo a veces se descuidó para proteger, ya que fue ignorado y directamente ligado o electrocautado.
Especialmente en estas situaciones de variantes anatómicas cuando la descendencia de la arteria ureteral del ratón se origina en el tronco principal de la aorta abdominal debajo de la descendencia de la arteria renal, este método de transección en bloque y reconstrucción de la anastomosis aórtica es aún más adecuado. Los cirujanos experimentados pueden incluso decidir cuándo usar la anastomosis tradicional o modificada en bloque .
En segundo lugar, la aplicación de una técnica nueva, simple y rápida de una anastomosis vascular sin nudos en la que la puntada final de la anastomosis no se ata con el extremo de la corbata superior como el enfoque tradicional, sino que permanece libre en su lugar ofrece una valiosa ventaja (ver Figura 5). Esta técnica aún permite aumentar o disminuir el tamaño de la anastomosis después de que ya se haya iniciado la reperfusión del trasplante renal. Esto evita el desarrollo de estenosis de los vasos y sangrado intraabdominal. Además, las colas libres de los puntos de anclaje en ambos extremos se pueden tirar en direcciones opuestas para ajustar y expandir de manera flexible la anastomosis para evitar la estenosis de las arterias o venas. La técnica de costura, por lo tanto, mejora la tasa de tolerancia a fallas de la cirugía y es amigable para los novatos20.
En tercer lugar, para realizar atraumáticamente la anastomosis del uréter donante y la vejiga receptora, se utilizaron agujas de jeringa de 21 G y 30 G como herramientas auxiliares de guía de punción. En ratones, el uréter es bastante delgado y muy delicado para realizar una anastomosis de extremo a extremo. Por lo general, el uréter del donante se introduce directamente en la vejiga con fórceps para guiar el uréter después de perforar la vejiga con una aguja de jeringa. Hemos mejorado aún más este método, utilizando una aguja de jeringa de 30 G de diámetro más delgado como guía para la aguja de jeringa de 21 G (procedimiento de Seldinger). Con esta técnica atraumática, la aguja de jeringa de 21 G no penetra en toda la vejiga, lo que reduce el daño a la vejiga y la dificultad de la implantación ureteral17 (Figura suplementaria 1).
Un paso crítico del protocolo es la configuración de la abertura arterial. En ambos casos (donante y receptor) estos deben cortarse prolijamente, de lo contrario afectará la calidad de la anastomosis. Además, en esta nueva técnica sin nudos, la última puntada no está atada al hilo anudado. Después de la anastomosis, el cirujano debe mantener inicialmente pequeño el estoma anastomótico. Luego, después de la reperfusión, tire de los extremos del hilo en los extremos superior e inferior para agrandarlo. Otro paso crítico que uno debe tener en cuenta es el posicionamiento de la incisión de la arteria renal donante, ya que la arteria ureteral debe identificarse para ser protegida.
Una limitación importante de esta técnica es, además de las mejoras descritas, que el operador aún necesita cumplir con altos requisitos, ya que las paredes del recipiente son pequeñas y muy tiernas. Sin una práctica intensa y perseverante, la tasa de éxito de la cirugía será baja.
En resumen, este informe demuestra la aplicabilidad de una modificación técnica del procedimiento de trasplante renal en ratones. El procedimiento quirúrgico aquí presentado ha demostrado ser un método valioso y confiable que estaba sirviendo como un componente esencial de varias publicaciones de investigación en los últimos 10 años 3,19,20. En comparación con el modelo de cirugía clásico y ampliamente establecido, el método demostrado aquí proporciona varias mejoras importantes que conducen a menores tasas de complicaciones y una tasa de supervivencia del trasplante más larga en el entorno del trasplante singénico de riñón3. Es importante mencionar que ambas técnicas (modificadas y convencionales) comparten las mismas complicaciones adicionales que afectan la mortalidad del receptor como la muerte por daño visceral, fuga de orina, hidronefrosis, infecciones, etc., que no difirieron. En resumen, esta nueva técnica quirúrgica mejora la tasa de éxito general y la supervivencia del injerto a largo plazo, lo que la convierte en una herramienta fiable para estudiar la respuesta aloinmune después del trasplante renal.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Agradecemos al equipo del Dr. Tiantian Bai por su ayuda con la voz en off, a la señorita Mian Pao por su ayuda en la ilustración médica. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) para promover colaboraciones internacionales (HO2581/4-1 a AH) y la Fundación Nacional de Ciencias de China (NSFC; # 81760291 a FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A.
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H.
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
