Summary
在这里，我们提出了一个筛选土壤生物多样性的方案，以寻找参与顽固性物质降解的真菌菌株。首先，分离能够在腐植酸或木质纤维素上生长的真菌菌株。然后在酶测定和碳氢化合物和塑料等污染物上测试它们的活性。
Abstract
环境污染是一个日益严重的问题，识别生物修复过程中涉及的真菌是一项基本任务。土壤拥有令人难以置信的微生物生命多样性，可以成为这些生物修复真菌的良好来源。这项工作旨在通过使用不同的筛选测试来寻找具有生物修复潜力的土壤真菌。补充顽固物质作为唯一碳源的矿物培养基作为生长试验。首先，将土壤稀释液镀在培养皿上，用腐植酸或木质纤维素修饰矿物培养基。分离生长的真菌菌落并在不同的基质上进行测试，例如碳氢化合物（凡士林和用过的机油）的复杂混合物和不同塑料聚合物（PET，PP，PS，PUR，PVC）的粉末。定性酶测试与生长测试相关，以研究酯酶，漆酶，过氧化物酶和蛋白酶的产生。这些酶参与顽固物质的主要降解过程，并且它们被检查的真菌菌株的组成性分泌可能被利用用于生物修复。分离和测试了100多种菌株，并发现了几种具有良好生物修复潜力的分离株。总之，所描述的筛选测试是一种从土壤中鉴定具有生物修复潜力的真菌菌株的简单且低成本的方法。此外，还可以根据要求，通过在最少的培养基中添加其他顽固物质来定制不同污染物的筛选测试。
Introduction
土壤是地球上生命的基本组成部分，也是许多生态系统的基础。土壤中的矿物质，有机物和微生物可以被认为是一个系统，它们之间发生了密切的联系和相互作用。这些化合物的相互作用对陆地过程，环境质量和生态系统健康具有重要影响1。土壤污染在世界范围内造成了严重的环境问题。不分青红皂白、长期、过量地施用农药、石油产品、塑料等有毒物质，对土壤生态产生严重影响，从而改变土壤微生物群。土壤中的微生物群落由不同生理状态的各种生物组成，其中大多数是细菌和真菌。土壤中的许多污染物具有中长期稳定性，它们的持久性可以导致适应性机制的发展，使微生物能够利用顽固物质作为养分2，3。因此，这些微生物可以考虑用于生物修复技术。
生物修复试图通过利用微生物及其酶将废物降解或转化为毒性较小或无毒的化合物来减轻污染的影响。各种古菌，细菌，藻类和真菌都具有这种生物修复能力4。由于其特殊的生物降解作用，真菌是特别有前途的生物修复生物。它们可以使用其菌丝网络攻击不同的基质，使它们能够比其他微生物更有效地穿透土壤基质。此外，它们可以到达难以接近的间隙，其中污染物难以去除5，并且它们还可以承受低湿度水平6。此外，真菌合成不同的非特异性酶盒，通常降解天然顽固物质，如纤维素，木质素和腐植酸。那些缺乏目标基质的污染物可能参与各种顽固性污染物的降解，例如碳氢化合物，塑料和杀虫剂7，8，9，10。因此，尽管许多真菌物种已被报告为生物修复剂，但人们越来越有兴趣探索尚未研究的物种，以选择抗性污染物质生物修复的候选物种。已知具有生物修复特性的物种属于子囊菌门11，12，13，担子菌14，15和粘菌科。例如，众所周知，青霉属和曲霉属参与脂肪族烃13、不同塑料聚合物16、17、18、重金属19和染料20的降解。同样，对担子菌真菌（如Phanerochaete chrysosporium和Trametes versicolor）进行的研究表明，它们参与氧化顽固性物质，如芳香烃13和塑料21。参与生物降解过程的真菌的另一个例子是合子菌根瘤菌属，Mucor spp.和Cunninghamella spp.22，23。特别是，Cunninghamella能够氧化芳香烃，被认为是研究各种异种生物13产物解毒的模式生物。
有几种真菌酶参与顽固性物质24，25的主要降解过程，如酯酶，漆酶，过氧化物酶和蛋白酶。漆酶是在细胞中产生并随后分泌的含铜氧化酶，允许氧化各种酚类和芳香族化合物。它们可以降解邻位和对二酚，含氨基的酚，木质素和含芳基的二胺26。过氧化物酶使用过氧化氢作为介质来降解木质素和其他芳香族化合物。有许多不同的过氧化物酶，但降解有毒物质的最大潜力的是木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶27。
酯酶和蛋白酶属于细胞外或外生细胞酶组，它们在其起源细胞外起作用，但仍与它们结合。这些酶可以催化大的顽固分子水解成较小的分子。由于其基质特异性低，这些酶可以在各种污染物的生物修复中发挥关键作用，例如纺织染料，纸浆和造纸工业释放的污水和皮革鞣制，石油产品，塑料和农药28，29，30。
已经发表了许多用于选择生物修复真菌菌株的筛选方法。例如，秸秆基琼脂培养基已被用于筛选多环芳烃（PAH）降解31中具有高潜力的白腐真菌;并将小块腐烂的木材放在麦芽提取物琼脂（MEA）上以分离腐烂木材的真菌32。然而，已经提出的大多数方法选择非常特定的真菌作为其感兴趣的活性。本研究提出了一种更广泛的方法，用于选择具有更广泛作用范围的土壤真菌。该方法依赖于将连续稀释的土壤样品初始镀层到用腐植酸或与抗生素混合的木质纤维素修饰的培养基上，以选择具有降解这些天然顽固物质的能力的真菌。事实上，腐植酸和木质纤维素是具有极强生物降解性的物质，因为它们具有非常复杂的分子结构，这使得它们成为被测真菌降解能力的优良指标33，34。随后，对在第一次测试中选择的真菌进行筛选，以识别那些有可能降解特定污染物的真菌，例如凡士林，用过的机油和塑料。最后，进行定性酶测试以检测能够产生参与顽固性物质生物降解过程的酶的真菌菌株。为此，进行蛋白酶和酯酶测试，同时使用没食子酸和愈创木酚作为丙酶和其他木质素分解酶产生的指标35，36。之所以使用这些底物，是因为已经发现真菌将其氧化成棕色形式的能力与拥有木质素溶解能力37，38，39之间存在很强的相关性。
通过这些方案，可以直接从土壤样品中分离出具有高降解潜力和广泛作用的真菌菌株。这些真菌菌株的分离可以帮助找到用于生物修复目的的新候选者。
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Protocol
1. 选择能够从土壤中降解顽固物质的真菌菌株
- 抗生素溶液的制备。
- 将青霉素（50毫克/升）、链霉素（40毫克/升）、金霉素（40毫克/升）、新霉素（100毫克/升）和氯霉素（100毫克/升）放入250毫升去离子无菌水中。
- 在向抗生素溶液中加入氯霉素之前，将其溶解在3mL≥99%乙醇中。
- 将抗生素溶液置于磁力搅拌器（无热量）上，并在溶液内用磁力搅拌棒10分钟。将其储存在4°C。
- 生长培养基的制备。
- 将1克商业腐植酸，3.26克Bushnell-Haas肉汤（BH）和15克琼脂放入1升去离子水中，并在121°C下高压灭菌20分钟（腐植酸琼脂）。
- 将腐植酸琼脂放入层流柜下的培养皿中。
- 将4克木质纤维素，3.26克BH和15克琼脂放入1升去离子水中，并在121°C（木质纤维素琼脂）下高压灭菌20分钟。
- 将木质纤维素琼脂放入层流柜下的培养皿中。
- 在层流柜下，培养基在培养皿中固化后，使用带有0.2μm过滤器的无菌注射器将1mL抗生素溶液转移到制备的板上以对其进行灭菌。
- 使用无菌的一次性L形细胞扩张器将抗生素溶液均匀地分布在板表面上，并使其在层流柜下风干。
- 将20克麦芽提取物肉汤和15克琼脂放入1升去离子水中，并在121°C下高压灭菌20分钟（麦芽提取物琼脂 - MEA）。
- 将MEA放入层流柜下的培养皿中。
- 土壤采样和土壤稀释。
- 在10厘米的深度对感兴趣的土壤进行采样，从顶层去除任何植物，草和枯叶，并将其放入无菌聚乙烯袋中。
- 到达实验室后，使用2毫米的网孔筛分土壤，去除任何根和植物碎片。
- 如果无法立即进行下游分析，请将筛分的土壤样品储存在4°C。
- 在层流柜下工作，将1g筛分的土壤放入装有10 mL无菌去离子水（1 x 10-1 稀释）的无菌15 mL管中。水平摇动管30分钟。
- 在层流柜下，在悬浮液沉降之前，用无菌移液管取1 mL 1 x 10-1 稀释液，并将其转移到9 mL去离子水空白（1 x 10-2 稀释液）中。彻底涡旋。
- 在悬浮液沉降之前，用无菌移液管取1 mL 1 x 10-2 稀释液，并将其转移到9 mL去离子水空白（1 x 10-3 稀释液）中。彻底涡旋。
- 在选择性介质上电镀土壤稀释液。
- 在层流柜下工作，使用具有无菌点的微量移液管收集100μL1×10-3 稀释液，并将其转移到腐殖质琼脂培养皿上。至少对4或5个培养皿这样做。
- 使用无菌的一次性L形细胞扩张器将稀释液均匀地分布在培养皿表面上。
- 让它在层流柜下风干10-15分钟。
- 重复步骤 1.4.1.-1.4.3。使用木质纤维素培养皿。
- 在25°C的黑暗中孵育最多15天。
- 分离从选择性培养基生长到生长培养基的真菌菌落。
- 从制备后3天开始，每天检查制备的选择性培养基培养皿中是否有任何真菌菌落生长，最长15天。
- 检查存在的所有真菌菌落的相似性。如有必要，准备一张载玻片，在光学显微镜下观察。
注意：目的是分离出数量最多的真菌菌落，但有必要避免总是从不同的板中分离出相同的真菌菌株，因此这种检查非常重要。寻找具有不同宏观和微观形态的菌落。 - 在层流柜下或本生燃烧器下，通过用无菌接种针从菌落中轻轻去除一小部分菌丝体并将其转移到新的MEA培养皿中来分离每个选定的真菌菌株。
注意：在这个阶段，保持细腻和精确是非常重要的，因为原始培养皿中存在的其他真菌菌落的污染风险很高。如果接种的MEA板上生长了一种以上的真菌菌株，则重复步骤1.5.3。 - 在25°C下在黑暗中孵育7天。这些是在特定顽固物质上进一步测试的真菌菌株。
2. 顽固物质的生长试验
- 凡士林生长试验。
- 将20mL液体BH（3.26g / L BH）转移到50mL小瓶中，并通过在121°C高压灭菌20分钟对其进行灭菌。
- 将7 mL去离子水转移到15 mL玻璃小瓶中，并在每个小瓶中加入一些破碎的玻璃盖玻片。
- 通过在121°C高压灭菌20分钟对其进行灭菌。
- 在层流柜下，使用无菌移液器向每个50 mL BH小瓶添加1 mL凡士林。保留一些仅用BH作为阴性对照的小瓶。
- 在层流柜下，使用无菌针从MEA板上取出具有所选真菌菌株（在步骤1.5.3中制备）的培养基表面上的菌丝体，并将其转移到具有破碎盖玻片的15mL玻璃瓶中。
- 在涡旋混合器上搅拌每个小瓶2分钟，让破碎的盖玻片切割真菌菌落的立方体，形成真菌悬浮液。
- 用200μL真菌悬浮液接种每个凡士林小瓶。为每个真菌菌株进行两次重复。
- 对于阴性对照，将200μL真菌悬浮液放入仅含有液体BH的小瓶中。此外，用凡士林保存几个小瓶，不要接种任何真菌，以检查培养基中的污染。
- 在黑暗中在25°C下孵育小瓶，并在接种后15天和30天后检查它们。
- 对用过的机油进行生长测试。
- 将3.26克BH和15克琼脂放入1升去离子水中，并在121°C（BHA）下高压灭菌20分钟。
- 将BHA放入层流柜下的培养皿中。
- 当它凝固后，将500μL用过的发动机油转移到BHA培养皿上，并使用无菌的一次性L形细胞扩张器将其均匀地分布在板表面上。
- 用每种真菌菌株接种每个用过的发动机油BHA板，从步骤1.5.3制备的板中收集菌丝体。在本生燃烧器或层流罩下工作，以避免污染。为每个真菌菌株进行两次重复。
- 对于阴性对照，仅用BHA接种培养皿。此外，保留几个用过的发动机油BHA培养皿，不要接种任何真菌，以检查介质中的污染。
- 在黑暗中在25°C下孵育培养皿，并在接种后15天和30天后检查它们。
- 塑料生长试验。
- 将200μL真菌悬浮液（步骤2.1.5.-2.1.6.）转移到96微孔板中。制作真菌菌株 - 塑料组合的三个重复。
- 向每个孔用真菌悬浮液中加入10毫克不同种类的塑料粉末（聚对苯二甲酸乙二醇酯-PET，聚氯乙烯-PVC，高密度聚乙烯-HDPE，聚苯乙烯-PS，聚氨酯-PUR）。
- 对于阴性对照，代替添加塑料粉末，而是用真菌悬浮液向孔中加入200μL灭菌的BH溶液。此外，对于每种类型的塑料粉末，在孔中填充200μL灭菌BH溶液和10mg每种塑料粉尘，以检查介质的污染。
- 在黑暗中在25°C下孵育微孔板，并在接种后15天和30天后检查它们。
3. 定性酶试验
- 定性木质素溶解酶比色法试验。
- 将27克马铃薯葡萄糖汤（PD）和15克琼脂放入1升去离子水中，并在121°C（PDA）下高压灭菌20分钟。
- 当培养基冷却一点但仍为液体时，在层流罩下加入没食子酸（5 g / L），并将培养基放入培养皿中。
- 用每种真菌菌株接种PDA +没食子酸板，从步骤1.5.3制备的板中收集菌丝体。在本生燃烧器或层流罩下工作，以避免污染。
- 作为阴性对照，仅用PDA（无没食子酸）准备培养皿，并用真菌菌株（每个真菌菌株一个）接种它们，以及一个带有PDA +没食子酸的培养皿，没有真菌接种。
- 在黑暗中在25°C下孵育培养皿，并在接种后7天后检查它们。
- 定性漆酶比色法测试。
- 将27克PD和15克琼脂放入1升去离子水中，并在121°C（PDA）下高压灭菌20分钟。
- 当培养基稍微冷却但仍为液体时，在层流罩下加入愈创木酚（400μL / L）并将其接种到培养皿中。
- 用每种真菌菌株接种PDA + 愈创木酚板，从步骤1.5.3制备的平板中收集菌丝体。在本生燃烧器或层流罩下工作，以避免任何污染。
- 作为阴性对照，仅用PDA（无愈创木酚）准备培养皿，并用真菌菌株（每个真菌菌株一个）接种它们，以及一个带有PDA + 愈创木酚的培养皿，不接种真菌。
- 在黑暗中在25°C下孵育培养皿，并在接种后7天后检查它们。
- 定性蛋白酶测试。
- 加入K2HPO4 （1 g/L）、KH2PO 4 （0.5 g/L）、MgSO4·7H2O （0.5 g/L）、MnCl2·4H2O （0.001 g/L）、CuCl2·2H2O （1.4 x 10-5 g/L）、ZnCl2 （1.1 x 10-5 g/L）、CoCl2·6H2O （2 x 10-5 g/L）， 制备YES培养基 Na2MoO4·2H2O （1.3 x 10-5 g/L）， FeCl3·6H2O （7.5 x 10-5 g/L）， 明胶/蛋白胨 （0.02 g/L） 至去离子水。
- 将YES培养基放在磁力搅拌器（无热量）上，并在培养基内用磁力搅拌棒放置10分钟。
- 当所有盐溶解到培养基中时，将5mL溶液转移到20mL无菌玻璃瓶中，并在121°C下高压灭菌20分钟。
- 对于阴性对照，用5mL BH溶液制备约20mL无菌玻璃瓶，并在121°C下高压灭菌20分钟。
- 在层流柜下，将每个菌株的200μL真菌悬浮液（步骤2.1.5.-2.1.6.）转移到YES培养基灭菌小瓶中（每个真菌菌株至少重复2次）。对于每种真菌菌株，向BH灭菌小瓶中加入200μL相同的真菌悬浮液以获得阴性对照。
- 将小瓶在25°C下在黑暗中孵育21天，每7天检查一次。
- 定性酯酶测试。
- 通过加入蛋白胨（10克/升），氯化钠（5克/升），氯化钙2 （0.1克/升）和10毫升吐温80至1升去离子水来制备吐温80培养基。
- 将吐温80培养基放在磁力搅拌器（无热）上，并在培养基内用磁力搅拌棒10分钟。
- 当所有东西在培养基内熔化时，将5 mL溶液转移到20 mL无菌玻璃瓶中，并在121°C下高压灭菌20分钟。
- 对于阴性对照，用5mL BH溶液制备约20mL无菌玻璃瓶，并在121°C下高压灭菌20分钟。
- 在层流柜下，将每个菌株的200μL真菌悬浮液（步骤2.1.5.-2.1.6.）转移到吐温80培养基灭菌小瓶中（每个真菌菌株至少进行2次重复）。对于每种真菌菌株，向BH灭菌小瓶中加入200μL相同的真菌悬浮液以进行阴性对照。
- 将小瓶在25°C下在黑暗中孵育21天，每7天检查一次。
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Representative Results
选择性培养基方法（协议第1节）允许筛选土壤丰富的生物多样性，并选择具有高生物修复潜力的真菌。用腐植酸和木质纤维素培养基，分离出100多种真菌菌株。这些真菌产生的酶参与天然顽固材料的生物降解，其化学结构类似于许多污染物。然而，用选择性培养基分离的真菌菌株需要进一步筛选。具体而言，选择性测试分离了能够降解腐植酸和木质纤维素的菌株，生长测试筛选了那些能够使用特定污染物作为其唯一碳源的分离真菌，定性酶测试描述了它们的代谢活性。
生长测试的重点是真菌降解碳氢化合物（凡士林和用过的机油）和塑料（PET，PVC，HDPE，PS，PUR）的能力。这些物质中的每一种在测试中被用作所选真菌菌株的唯一碳源。利用这些物质的真菌能力被评估为添加物质的样品与仅具有最小培养基（BH或BHA，取决于测试）的对照样品之间的菌落生长差异。使用定性量表来描述结果（图1），范围从没有与对照（0）的生长差异到低（+），中（++）和高（+++）水平的生长差异。
图1：生长试验中真菌菌株的生长成功率。 能够在凡士林，使用过的机油和塑料粉末（聚对苯二甲酸乙二醇酯，PET;聚氯乙烯，PVC;高密度聚乙烯，HDPE;聚苯乙烯，PS;聚氨酯，PUR）上生长的真菌菌株的百分比作为其唯一成功程度（无增长，0;低生长，+;中等生长，++;高生长，+++）。 请点击此处查看此图的大图。
凡士林和用过的发动机油测试评估了所选真菌菌株的碳氢化合物生物降解潜力。凡士林是长链烷烃（>C25）的混合物，被用作唯一的碳源。利用这种物质的真菌能力被评估为具有BH +凡士林的小瓶和仅具有BH的控制小瓶之间的菌落生长差异（图2）。几乎75%的测试真菌菌株能够使用凡士林作为其唯一的碳源，21%的菌株表现出最大的生长（+++， 图1）。
图2：凡士林作为唯一碳源的定性增长规模图片。 定性量表基于处理过的样品和BH对照之间的生长差异。它的范围从没有生长差异（0）到低（+），中（++）和高（+++）水平的增长差异。 请点击此处查看此图的大图。
废旧发动机油是碳氢化合物、发动机添加剂和金属的复杂混合物。它在生长测试中用于评估真菌利用复杂和有毒的碳氢化合物混合物作为碳源的能力。与其他生长测试一样，通过将板中的真菌生长与机油中的真菌生长与仅含有BHA的控制板中的生长进行比较来评估生长（图3）。生长结果证实了选择性培养基的功效（方案第1节）。事实上，几乎90%的分离真菌菌株能够在用过的机油上生长，其中39%显示出最大的生长（+++， 图1）。
图3：使用过的机油作为唯一碳源的定性增长规模的图片。 定性量表基于处理样品和BHA对照之间的生长差异。它的范围从没有生长差异（0）到低（+），中（++）和高（+++）水平的增长差异。 请点击此处查看此图的大图。
塑料粉末的生长测试用于选择可以使用特定塑料聚合物作为其主要碳源的真菌菌株;因此，这些菌株具有很高的塑料生物修复潜力。用立体显微镜观察多孔板的生长，并使用定性尺度进行评估，范围从没有生长（0）到高产菌丝（+++）。PUR是具有最高百分比的真菌菌株显示生长的塑料粉末（92%），其中31%的菌株显示出最大的生长（+ ++）。从腐植酸和木质纤维素培养基中分离出来的菌株中约有70%生长在PS粉末上，而其中近60%-65%的菌株能够使用HDPE，PVC和PET作为其唯一的碳源。因此，很大比例的真菌能够在多孔板中的不同塑料粉末上生长，但其中非常少的真菌显示出塑料的高定植度。事实上，只有10%的菌株能够在PET和HDPE上茁壮成长，13%的菌株能够在PS上茁壮成长。唯一经常观察到高真菌生长的塑料是PUR，大约30%的真菌菌株设法非常丰富地生长。
进行定性酶测试以检测可以产生参与顽固性物质生物降解过程的酶的真菌菌株。过氧化物酶和漆酶是木质素溶解酶，其产生由没食子酸和愈创木酚试验中培养基底面的褐色光晕表示（方案的步骤3.1和步骤3.2）。）。在这两项测试中，颜色强度的增加表明这些酶的产生更高（图4）。
图4：定性木质素溶解酶的定性尺度图片。定性尺度基于蚁群周围产生红色/褐色光晕。0 = 无活动，+ = 某些活动，++ = 高活动，+++ 非常高活动。 请点击此处查看此图的大图。
大约60%的测试真菌能够产生木质素溶解酶，表明选择性培养基的成功。此外，12%的分离真菌菌株在没食子酸培养基（+++）的菌落周围产生强烈的暗晕，其中17%在愈创木酚培养基（漆酶）中这样做，表明这些酶的真菌分泌量高（图5）。
图5：定性酶测试期间真菌菌株的酶活性速率。真菌菌株在其相应的定性酶测试中能够产生不同成功水平（0 =无活性，+=活性，++高活性，+++非常高活性）的木质素溶解酶，乳酶，蛋白酶和酯酶的百分比。 请点击此处查看此图的大图。
用于分析真菌活性的另一个筛选测试是蛋白酶测试，该测试基于YES培养基小瓶和BH对照瓶之间真菌生长的差异。然而，YES培养基中约70%的真菌菌株显示出与对照相似的生长，甚至生长减少。没有真菌菌株达到最大差异水平（+++）。这些结果表明，该测试可能不适合筛查蛋白酶活性。
最后，通过在吐温80培养基中形成白色沉淀物来评估酯酶活性（图5）。几乎60%的所选真菌菌株显示出酯酶活性，13%显示出沉淀物的高形成（+++），这表明应选择13%中的菌株以仔细检查其生物降解潜力（图5）。
关于所有的生长和酶测试，最成功的菌株（即那些在至少一个测试中获得+++的菌株）是最有趣的。这些真菌菌株能够有效地使用顽固性物质作为其唯一的碳源，或者它们产生高水平的酶参与顽固性物质的生物降解。事实上，在测试的115种真菌菌株中，有39种能够在碳氢化合物来源（凡士林或用过的机油）上茁壮成长（+++），58种在至少一种塑料聚合物上具有高生长。只有32人在至少一项酶测试中表现出非常高的酶活性（+++）。这些结果表明，除了蛋白酶测试外，所有报告的筛查测试都具有高疗效，该测试没有选择任何高性能菌株。
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Discussion
土壤丰富的生物多样性是真菌的丰富来源，具有许多代谢能力，其中一些可能是生物修复的潜在候选者。选择性培养基测试（协议的第1部分）是分离能够在天然复合聚合物上生长的真菌作为其唯一碳源的易于执行和有效的方法。真菌可以产生细胞外、非特异性水解酶和氧化还原酶30 ，例如木质素分解酶laccases和过氧化物酶31。这些酶可以降解木质纤维素和腐植酸，还可以降解许多不同的异种生物，包括碳氢化合物、芳香族化合物和氯化有机化合物32。
所描述的方法产生的结果易于解释并且执行成本低。这些特征允许非专家使用它们。然而，某些方面，如无菌和形态鉴定，需要特别注意。例如，土壤悬浮液的30分钟搅拌（步骤1.3.4.）是必要的，以便真菌孢子和繁殖体从土壤微观结构中释放出来并且可以悬浮在溶液中。通过这种方式，通过电镀稀释这种土壤悬浮液，可以分离出最大数量的真菌菌株。真菌菌株的宏观和微观形态鉴定对于区分菌株并避免多次分离相同的真菌菌株非常重要。此外，无菌和避免微生物污染至关重要，因为其他活性真菌菌株的存在可能歪曲所研究菌落的活性。
在选择性测试之后，对不同的顽固性物质进行了一系列生长测试，例如凡士林，用过的机油和不同的塑料聚合物。该阶段可以根据感兴趣的顽固物质进行定制。重要的步骤是将选定的物质添加到BH或BHA中作为唯一的碳源，并在不添加顽固物质的情况下对照检查真菌生长。
对塑料和碳氢化合物进行生长测试的目的是通过定性观察其在材料上的生长，评估真菌是否可以使用这些物质作为其唯一的碳源。不幸的是，由于这些材料的极端顽固性，很难量化基质重量的实际下降和真菌生物量重量的增加，特别是在相对较短的时间内。如果真菌菌株在这些筛选生长试验中表现良好，则应进行进一步的研究以量化顽固物质的降解。
选择使用的酶测试（方案的第3部分）是因为它们被证明是有效和快速执行的，但它们只产生定性结果。它们突出了真菌菌株的降解潜力，但它们无法精确地量化它。如果分离出特别感兴趣的菌株，可以进行进一步的测试，例如分光光度法定量酶论文，以更精确地描述代谢活性。唯一显示出次优疗效的酶学测试是定性蛋白酶测试，能够在YES培养基上生长的菌株数量较少。事实上，能够在PUR上生长的高百分比菌株表明真菌产生的蛋白酶参与破坏酰胺和聚氨酯键，酯酶靶向酯键40。几乎完全没有产生蛋白酶的真菌表明所使用的方法可能存在问题。其他测试可以用于蛋白酶活性，例如酪蛋白41，脱脂牛奶42或奶粉43 琼脂平板测试。没食子酸测试被证明对于检测木质素分解酶的产生非常有用，但不幸的是，它不是很具体，无法区分产生的木质素分解酶的类型（过氧化物酶或laccases）。
这项工作的结果表明，使用木质纤维素或腐植酸作为选择性培养基，可以从丰富的土壤生物多样性中分离出具有生物修复潜力的真菌菌株。事实上，通过选择性方法分离的超过70%的真菌菌株能够在凡士林或用过的发动机油上生长，60%能够在不同的塑料聚合物上生长作为唯一的碳源。此外，定性酶测试描述了这些真菌与生物降解过程相关的代谢活性。建议选择在一项或多项测试中显示+++活性的真菌菌株，因为它增加了找到在生物修复中非常活跃的真菌菌株的机会。在与通过我们的筛选测试选择的真菌菌株长时间接触后，对顽固性物质使用气相质色谱（GC-MS）的测试显示材料的实际生物降解9，44。在不同生态系统中使用这些简单的筛选测试将允许研究不同土壤中的真菌生物多样性。寻找可以降解顽固材料的真菌将增加具有生物修复潜力的已鉴定菌株的数量，并有助于解决日益严重的环境污染问题。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢帕维亚大学的Scuola di Alta Formazione Dottorale（SAFD）和Solveig Tosi教授为这项工作提供了机会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
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