Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल ओवो में एक भ्रूण चूजे के कॉर्निया को घायल करने में शामिल विभिन्न चरणों को दर्शाता है। पुनर्जन्म या पूरी तरह से बहाल कॉर्निया का विश्लेषण घाव प्रक्रिया के बाद विभिन्न सेलुलर और आणविक तकनीकों का उपयोग करके पुनर्योजी क्षमता के लिए किया जा सकता है।
Abstract
चिक भ्रूण कॉर्नियल घाव पूरी तरह से और तेजी से पुनर्जीवित करने की उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जबकि वयस्क घायल कॉर्निया फाइब्रोटिक निशान के कारण पारदर्शिता के नुकसान का अनुभव करते हैं। घायल भ्रूण कॉर्निया की ऊतक अखंडता आंतरिक रूप से कोई पता लगाने योग्य निशान गठन के साथ बहाल की जाती है। इसकी पहुंच और हेरफेर में आसानी को देखते हुए, लड़की भ्रूण स्कारलेस कॉर्नियल घाव की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है। यह प्रोटोकॉल ओवो में एक भ्रूण लड़की के कॉर्निया को घायल करने में शामिल विभिन्न चरणों को दर्शाता है। सबसे पहले, आंखों तक पहुंचने के लिए शुरुआती भ्रूण उम्र में अंडे को खिड़की दी जाती है। दूसरा, एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली के लिए ओवो शारीरिक जोड़तोड़ की एक श्रृंखला आयोजित की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आंख तक पहुंच विकास के बाद के चरणों के माध्यम से बनाए रखी जाती है, जब कॉर्निया की तीन सेलुलर परतें बनती हैं। तीसरा, रैखिक कॉर्निया घाव जो बाहरी उपकला परत और पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश करते हैं, एक माइक्रोसर्जिकल चाकू का उपयोग करके बनाए जाते हैं। पुनर्जनन प्रक्रिया या पूरी तरह से बहाल कॉर्निया का विश्लेषण घाव प्रक्रिया के बाद विभिन्न सेलुलर और आणविक तकनीकों का उपयोग करके पुनर्योजी क्षमता के लिए किया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग करके आज तक के अध्ययनों से पता चला है कि घायल भ्रूण कॉर्निया केराटोसाइट भेदभाव की सक्रियता प्रदर्शित करते हैं, अपने मूल त्रि-आयामी मैक्रोस्ट्रक्चर में ईसीएम प्रोटीन के समन्वित रीमॉडेलिंग से गुजरते हैं, और कॉर्नियल संवेदी तंत्रिकाओं द्वारा पर्याप्त रूप से पुन: आंतरिक हो जाते हैं। भविष्य में, पुनर्योजी प्रक्रिया पर अंतर्जात या बहिर्जात कारकों के संभावित प्रभाव का विश्लेषण ऊतक ग्राफ्टिंग, इलेक्ट्रोपोरेशन, रेट्रोवायरल संक्रमण या मनका प्रत्यारोपण जैसी विकासात्मक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करके कॉर्निया को ठीक करने में किया जा सकता है। वर्तमान रणनीति भ्रूण की लड़की को स्कारलेस कॉर्नियल घाव भरने के समन्वय के आणविक और सेलुलर कारकों को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक प्रतिमान के रूप में पहचानती है।
Introduction
कॉर्निया आंख का पारदर्शी, बाहरी ऊतक है जो दृश्य तीक्ष्णता के लिए अनुकूल प्रकाश को प्रसारित और अपवर्तित करता है। वयस्क कॉर्निया में, कॉर्नियल स्ट्रोमा को नुकसान या संक्रमण केराटोसाइट प्रसार, फाइब्रोसिस, साइटोकिन-प्रेरित एपोप्टोसिस के लिए अग्रणी सूजन में वृद्धि, मरम्मत मायोफिब्रोब्लास्ट की पीढ़ी, और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 1,2 के समग्र रीमॉडेलिंग की विशेषता एक तेजी से और मजबूत घाव भरने की प्रतिक्रिया की ओर जाता है . चोट लगने के बाद, इस तरह के कॉर्नियल ऊतक की मरम्मत के परिणामस्वरूप अपारदर्शी निशान ऊतक होता है जो कॉर्नियल पारदर्शिता को कम करता है और प्रकाश के पारित होने को रोकता है, इस प्रकार दृष्टि को विकृत करता है और सबसे गंभीर मामलों में, कॉर्नियल अंधापन3. इस प्रकार, घाव भरने की जटिलताओं को संबोधित करने और घाव बंद करने और ऊतक पुनर्जनन के लिए जिम्मेदार सेलुलर और आणविक कारकों की पहचान करने के लिए विश्वसनीय पशु मॉडल विकसित करने की स्पष्ट आवश्यकता है।
आज तक, कॉर्नियल घाव भरने की जांच करने वाले अधिकांश अध्ययनों ने प्रसवोत्तर4 या वयस्क पशु मॉडल 1,2,5,6,7 का उपयोग किया है। जबकि इन अध्ययनों ने कॉर्नियल घाव भरने की प्रतिक्रिया और निशान गठन अंतर्निहित तंत्र की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति की है, इन उपचार मॉडलों में क्षतिग्रस्त कॉर्नियल ऊतक पूरी तरह से पुनर्जीवित करने में विफल रहते हैं, इस प्रकार कॉर्नियल आकृति विज्ञान और संरचना को पूरी तरह से पुनरावृत्ति के लिए जिम्मेदार आणविक कारकों और सेलुलर तंत्र की पहचान करने के लिए उनकी उपयोगिता को सीमित करते हैं। इसके विपरीत, भ्रूण चिक कॉर्निया में चाकू से उत्पन्न भ्रूण के घावों में एक स्कारलेस फैशन में पूरी तरह से ठीक होने की आंतरिक क्षमता होतीहै 8. विशेष रूप से, भ्रूण चिक कॉर्निया बाह्य मैट्रिक्स संरचना और इनर्वेशन पैटर्न 8,9 के पूर्ण पुनरावृत्ति के साथ नॉनफाइब्रोटिक पुनर्जनन प्रदर्शित करता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल ओवो में एक भ्रूण लड़की के कॉर्निया को घायल करने में शामिल चरणों के अनुक्रम का वर्णन करता है। सबसे पहले, भ्रूण तक पहुंच की सुविधा के लिए शुरुआती भ्रूण उम्र में अंडे को खिड़की दी जाती है। दूसरा, एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली के लिए ओवो शारीरिक जोड़तोड़ की एक श्रृंखला आयोजित की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आंख तक पहुंच विकास के बाद के चरणों के माध्यम से बनाए रखी जाती है, जब कॉर्निया की तीन सेलुलर परतें बनती हैं और घायल होना वांछित होता है। तीसरा, कॉर्नियल उपकला के माध्यम से और पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश करने वाले रैखिक केंद्रीय कॉर्निया चीरों को माइक्रोसर्जिकल चाकू का उपयोग करके बनाया जाता है। पुनर्जनन प्रक्रिया या पूरी तरह से बहाल कॉर्निया का विश्लेषण घाव प्रक्रिया के बाद विभिन्न सेलुलर और आणविक तकनीकों का उपयोग करके पुनर्योजी क्षमता के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अंडे का तनाव व्हाइट लेगहॉर्न था, और इलिनोइस वेस्लेयन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी।
1. चूजे के अंडे का इनक्यूबेशन
- विकास को रोकने के लिए रखे जाने के बाद अंडे को 1 सप्ताह तक ~ 10 डिग्री सेल्सियस पर रखें। जब लड़की भ्रूण के विकास को शुरू करने के लिए तैयार हो, तो गंदगी और मलबे को हटाने के लिए कमरे के तापमान के पानी से संतृप्त लिंट-फ्री वाइप्स ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरे अंडे के छिलके को पोंछ दें।
- सुनिश्चित करें कि अंडे के छिलके को सैनिटाइज किया गया है। 70% इथेनॉल के साथ लिएंट-फ्री वाइप्स के साथ पूरे अंडे की सतह को पोंछ लें। अंडे को सूखने के लिए इथेनॉल को जल्दी से पोंछ लें और भ्रूण को अंडे के छिलके के माध्यम से इथेनॉल अवशोषण से बचें।
- अंडे को एक ट्रे पर क्षैतिज रूप से व्यवस्थित करें। भ्रूण की अपेक्षित स्थिति को निरूपित करने के लिए अंडे के शीर्ष को चिह्नित करें। एक 38 डिग्री सेल्सियस आर्द्र इनक्यूबेटर में, रॉकिंग फ़ंक्शन सक्रिय के साथ क्षैतिज रूप से अंडे सेते हैं।
2. झिल्ली विच्छेदन के लिए तैयार करने के लिए अंडे खिड़की
- भ्रूण के विकास (ई 3) के तीसरे दिन इनक्यूबेटर से अंडे निकालें। 70% इथेनॉल के साथ गीला लिंट मुक्त पोंछे के साथ अंडे के शीर्ष निष्फल। अंडे के छिलके की सतहों से इथेनॉल को सुखाएं।
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि खिड़की की प्रक्रिया के दौरान विकास में देरी नहीं हुई थी, 6-12 अंडे हटा दिए गए थे, और प्रक्रिया को जल्दी से इन पर किया गया था जबकि शेष अंडे इनक्यूबेटर में छोड़ दिए गए थे। - एक सुरक्षित अंडा धारक में क्षैतिज रूप से एक अंडे की स्थिति ( सामग्री की तालिका देखें)। विदारक कैंची के तेज अंत का उपयोग करके, अंडे के नुकीले छोर के पास अंडे के छिलके के शीर्ष में एक छोटा छेद बनाएं।
नोट: यह छेद एल्बुमेन को हटाने की सुविधा प्रदान करेगा, जो जर्दी और भ्रूण को आंतरिक अंडे की सतह से दूर छोड़ने के लिए आवश्यक है। अंडा धारकों के लिए, पेपर-पल्प अंडे भराव फ्लैट, जिसके भीतर अंडे भेजे जाते हैं, का उपयोग किया गया था। - छेद (चरण 2.2.) के माध्यम से, एक 18 जी बेवल हाइपोडर्मिक सुई डालें। सुई को अंडे की निचली आंतरिक सतह पर धकेल दिया जाता है और सुई के बेवल-साइड को अंडे के नुकीले छोर का सामना करना पड़ता है (उदाहरण के लिए, जर्दी के अपेक्षित स्थान से दूर और अंडे के बीच के पास भ्रूण), चिकन अंडे से 2-3 एमएल एल्बुमेन निकालें और त्यागें।
नोट: यदि किसी की सुई इस चरण के दौरान भ्रूण या उससे जुड़े वास्कुलचर को निक करती है, तो इसके परिणामस्वरूप रक्त को एल्बुमेन के साथ आकांक्षा की जाएगी। इससे भ्रूण की मृत्यु हो जाएगी। इसके अलावा, यदि इस चरण के दौरान जर्दी अनजाने में एल्बुमेन के साथ आकांक्षा की जाती है, तो भ्रूण व्यवहार्य नहीं होगा। किसी भी मामले में, अंडे को त्याग दिया जाना चाहिए यदि भ्रूण को तुरंत अन्य उद्देश्यों के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। - 70% इथेनॉल के साथ हल्के ढंग से गीला लिंट-मुक्त पोंछे के साथ छेद के चारों ओर अंडे के छिलके की सतह को साफ करें और सूखा पोंछ लें। स्पष्ट टेप के साथ एल्बुमेन को हटाने के लिए बनाए गए छेद को सील करें।
- विदारक कैंची के तेज अंत के साथ, अंकन स्थल पर अंडे के छिलके के शीर्ष में एक दूसरा "खिड़की" छेद करें (चरण 1.3।)। सुनिश्चित करें कि कैंची भ्रूण या भ्रूण वास्कुलचर से संपर्क करने और नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अंडे के छिलके में बहुत दूर तक विस्तारित न हो, जिसे अक्सर दूसरे छेद की साइट के नीचे अंडे के भीतर तैनात किया जाएगा।
- घुमावदार आईरिस संदंश का उपयोग करके, व्यास में ~ 2-3 सेमी की अवधि के लिए "खिड़की" छेद को चौड़ा करें और खोल के नीचे विकासशील भ्रूण के लिए "खिड़की" के रूप में काम करें।
- संदंश के एक छोर को छेद में डालें, इसे अंडे के छिलके के समानांतर और बारीकी से जोड़ते हुए रखें। अंडे के छिलके के बाहर स्थित अन्य संदंश अंत के साथ, ध्यान से दो संदंश समाप्त होता है चुटकी एक साथ समाप्त होता है, जिससे उन्हें अंडे के छिलके के छोटे टुकड़ों को तोड़ने और हटाने की अनुमति मिलती है। अंडे के छिलके के टुकड़ों को तोड़ना और हटाना जारी रखें जब तक कि 2-3 सेमी खिड़की न रह जाए जो सीधे भ्रूण को ओवरले करती है।
नोट: अंडे जिसमें भ्रूण चरण 2.6 में किए गए छेद के नीचे सीधे नहीं देते हैं। आगामी झिल्ली विच्छेदन को पूरा करने के लिए चुनौतीपूर्ण होगा के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। यहां तक कि क्षैतिज रूप से अंडे को रॉक करने के साथ, भ्रूण की खराब स्थिति के कारण लगभग 10% अंडे अनुपयोगी होते हैं। इन भ्रूणों का उपयोग अन्य उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है।
- संदंश के एक छोर को छेद में डालें, इसे अंडे के छिलके के समानांतर और बारीकी से जोड़ते हुए रखें। अंडे के छिलके के बाहर स्थित अन्य संदंश अंत के साथ, ध्यान से दो संदंश समाप्त होता है चुटकी एक साथ समाप्त होता है, जिससे उन्हें अंडे के छिलके के छोटे टुकड़ों को तोड़ने और हटाने की अनुमति मिलती है। अंडे के छिलके के टुकड़ों को तोड़ना और हटाना जारी रखें जब तक कि 2-3 सेमी खिड़की न रह जाए जो सीधे भ्रूण को ओवरले करती है।
- बैक्टीरियल संदूषण को सीमित करने के लिए, खिड़की के छेद (जैसे, अंडे में) के माध्यम से जोड़ें ~ 100-200 μL रिंगर के समाधान (एनएसीएल के 8 ग्राम, केसीएल के 0.37 ग्राम, और सीएसीएल2.2एच 2 0 प्रति एल आसुत एच 2 0) के0.23ग्राम पेनिसिलिन / सामग्री की तालिका देखें)।
- स्पष्ट चिपकने वाला टेप का उपयोग करके खिड़की के छेद को सील करें। छेद की लंबी धुरी पर टेप के एक कोने को संरेखित करके और टेप को खोल में दबाकर अंडे की सीलिंग करें ~ छेद के किनारे से 1-2 सेमी दूर।
- खोलने के चारों ओर सील करना जारी रखें जब तक कि एक तरफ टेप का एक लटका हुआ फ्लैप न छोड़ दिया जाए। टेप के दो टुकड़ों को एक साथ दबाएं, छेद पर एक गुंबददार आकार बनाएं, और अंडे को सील करने के लिए खोल में ओवर-हैंगिंग टेप के फ्लैप को दबाएं।
नोट: अंडे को ई 2 या ई 3 पर खिड़की की आवश्यकता होती है। अनुभव के अनुसार, ई 2 से पहले खिड़की के परिणामस्वरूप भ्रूण व्यवहार्यता कम होती है। इसके अलावा, ई 4 द्वारा, भ्रूण और एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली अंडे के छिलके10 से जुड़ी हो जाती है, और ई 4 पर खिड़की के किसी भी प्रयास या बाद में अक्सर भ्रूण क्षति या अतिरिक्त भ्रूण रक्त वाहिकाओं के फाड़ने के परिणामस्वरूप होता है, किसी भी घटना के साथ भ्रूण की मृत्यु का परिणाम होता है।
- खोलने के चारों ओर सील करना जारी रखें जब तक कि एक तरफ टेप का एक लटका हुआ फ्लैप न छोड़ दिया जाए। टेप के दो टुकड़ों को एक साथ दबाएं, छेद पर एक गुंबददार आकार बनाएं, और अंडे को सील करने के लिए खोल में ओवर-हैंगिंग टेप के फ्लैप को दबाएं।
- आगे के विकास के लिए इनक्यूबेटर को "खिड़की" अंडे लौटाएं। अंडे को क्षैतिज रखना सुनिश्चित करें और इनक्यूबेटर के रॉकिंग फ़ंक्शन को बंद करें।
- चरण 2.2.-2.9 दोहराएँ। प्रत्येक अंडे के लिए।
3. एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली के माइक्रोडिसेक्शन
- इनक्यूबेटर से एक ई 5.5 खिड़की वाले अंडे को निकालें। निष्फल विदारक कैंची के साथ खिड़की से दूर टेप काटने से भ्रूण का पर्दाफाश।
- खिड़की के माध्यम से भ्रूण और उसके अतिरिक्त झिल्ली का निरीक्षण करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो खिड़की को चौड़ा करने के लिए कैंची या घुमावदार आईरिस संदंश का उपयोग करें ताकि भ्रूण खिड़की के नीचे अच्छी तरह से तैनात हो, ध्यान रखें कि भ्रूण वास्कुलचर को नुकसान न पहुंचे।
- भ्रूण को हाइड्रेट करने और अंडे को निष्फल करने के लिए पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं वाले रिंगर के समाधान की दो बूंदें जोड़ें।
- भ्रूण उचित विकास चरण (हैमबर्गर हैमिल्टन चरण 27, ~ ई 5.5)11,12 पर है और एमनियोकोरियोनिक झिल्ली (एसीएम) और कोरियोएलेंटोइक झिल्ली (सीएएम) की स्थिति का पता लगाने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
नोट: इस स्तर पर, भ्रूण एसीएम से घिरा हुआ है, जिसमें एमनियोटिक झिल्ली और ओवरलाइंग कोरियोनिक झिल्ली शामिल है और आंशिक रूप से अत्यधिक संवहनी एलांटोइस द्वारा कवर किया गया है, जो भ्रूण के आंत क्षेत्र से फैला हुआ है और सीएएम11,12 बनाने के लिए ओवरलेइंग कोरियन के साथ फ़्यूज़ करता है। एसीएम भारी संवहनी नहीं है, जो रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना और भ्रूण को नुकसान पहुंचाए बिना भ्रूण को उजागर करने के लिए इन झिल्ली को विच्छेदित करने में सक्षम बनाता है। - इस स्तर पर एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली विच्छेदन करें (ई 5.5)।
नोट: ई 5.5 अतिरिक्त झिल्ली विच्छेदन करने के लिए आदर्श समय है। सीएएम गठन से पहले झिल्ली को पहले (जैसे, ई 4 पर) विच्छेदन बाद के चरणों में भ्रूण की पहुंच को कम करता है11. इसके अलावा, ई 5.5 पर, भ्रूण केवल आंशिक रूप से अत्यधिक संवहनी सीएएम द्वारा कवर किया जाता है, फिर भी अगले 1-2 दिनों में, सीएएम जल्दी से आच्छादित हो जाता है और भ्रूण11,12 तक आगे की पहुंच को रोकता है। इस कारण से, ई 6 या बाद में झिल्ली विच्छेदन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि रक्त वाहिकाओं को फाड़ने का खतरा बढ़ जाता है।- एसीएम को धीरे से समझने और भ्रूण से दूर खींचने के लिए निष्फल ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। फिर निष्फल सूक्ष्म विदारक कैंची का उपयोग सीधे अग्रभाग के ऊपर एसीएम में एक छेद को काटने के लिए करें जो झिल्ली से अग्रभाग को सिर के ऊपर झिल्ली तक फैलाता है।
नोट: यह कदम कोरियोन और एमनियन झिल्ली को आराम देता है, इस प्रकार उन्हें अगले चरणों में संदंश के साथ हड़पने और आगे विच्छेदन करने में आसान बनाता है। अंडे के छिलके की खिड़की के माध्यम से झिल्ली को विच्छेदित करने के तरीके के एक सहायक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें।
- एसीएम को धीरे से समझने और भ्रूण से दूर खींचने के लिए निष्फल ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। फिर निष्फल सूक्ष्म विदारक कैंची का उपयोग सीधे अग्रभाग के ऊपर एसीएम में एक छेद को काटने के लिए करें जो झिल्ली से अग्रभाग को सिर के ऊपर झिल्ली तक फैलाता है।
- एसीएम और सीएएम के बीच दो आसन्न स्थितियों में एमनियन को धीरे-धीरे पकड़ने के लिए ठीक, बाँझ संदंश के दो जोड़े का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, अग्रभाग के ऊपर किए गए कट के बीच का क्षेत्र और सीएएम के निकटतम किनारे)।
- ध्यान से संदंश की प्रत्येक जोड़ी को स्थानांतरित करें, दोनों दृढ़ता से एमनियोटिक झिल्ली को पकड़ते हैं, एक दूसरे से दूर, एक जोड़ी भ्रूण में पृष्ठीय रूप से आगे बढ़ती है और दूसरी उदर रूप से चलती है।
नोट: यह गति एसीएम (जो संदंश की एक जोड़ी द्वारा भ्रूण के संबंध में पृष्ठीय दिशा में खींची जाती है) और सीएएम (जो संदंश की दूसरी जोड़ी द्वारा भ्रूण के संबंध में उदर दिशा में खींच लिया जाता है) को अलग करते हुए एमनियन को और फाड़ने का कार्य करता है। - सुनिश्चित करें कि झिल्ली को अलग किया जाता है जब सीएएम अब भ्रूण को कवर नहीं करता है और एलांटोइक धमनी और नस, जो भ्रूण आंत से सीएएम तक निकलती है, आसानी से स्पष्ट होती है।
- ध्यान से संदंश की प्रत्येक जोड़ी को स्थानांतरित करें, दोनों दृढ़ता से एमनियोटिक झिल्ली को पकड़ते हैं, एक दूसरे से दूर, एक जोड़ी भ्रूण में पृष्ठीय रूप से आगे बढ़ती है और दूसरी उदर रूप से चलती है।
- विच्छेदन और भ्रूण को कवर किसी भी शेष एमनियन झिल्ली को हटाने के लिए निष्फल ठीक संदंश का प्रयोग करें। यह आमतौर पर देखा जाता है कि शेष एमनियन आंशिक रूप से भ्रूण के दुम आधे हिस्से को कवर करेगा।
- निष्फल संदंश का उपयोग करके, भ्रूण के मध्य-कपाल क्षेत्र के पास एमनियन को समझें और पहले विस्थापित सीएएम की ओर भ्रूण के संबंध में एक दुम दिशा में एमनियन को सावधानीपूर्वक खींचें। भ्रूण अब पूरी तरह से उजागर हो जाएगा, और सीएएम की आगे की वृद्धि मुख्य रूप से विकासशील भ्रूण से दूर होगी।
नोट: झिल्ली विच्छेदन के बाद उजागर भ्रूण कैसे दिखाई देगा पर एक उपयोगी योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें। इसके अलावा, चरण 3.3.-3.6 के उपयोगी योजनाबद्ध आरेखों के लिए पहले प्रकाशित रिपोर्ट11 देखें।
- निष्फल संदंश का उपयोग करके, भ्रूण के मध्य-कपाल क्षेत्र के पास एमनियन को समझें और पहले विस्थापित सीएएम की ओर भ्रूण के संबंध में एक दुम दिशा में एमनियन को सावधानीपूर्वक खींचें। भ्रूण अब पूरी तरह से उजागर हो जाएगा, और सीएएम की आगे की वृद्धि मुख्य रूप से विकासशील भ्रूण से दूर होगी।
- भ्रूण को हाइड्रेट करने और अंडे को निष्फल करने के लिए पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं वाले रिंगर के समाधान की कुछ बूंदें जोड़ें।
- स्पष्ट टेप का उपयोग करके विंडो छेद को फिर से सील करें, जैसा कि चरण 2.8 में वर्णित है। आगे के विकास के लिए इनक्यूबेटर को अंडे को वापस करें, अंडे को क्षैतिज रखें और इनक्यूबेटर के रॉकिंग फ़ंक्शन को निष्क्रिय रखें।
- चरण 3.1.-3.8 दोहराएँ। प्रत्येक अंडे के लिए।
नोट: ऊपर वर्णित ई 5.5 पर एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली विच्छेदन ई 7 के माध्यम से भ्रूण तक पहुंच को सक्षम करेगा, जो तब होता है जब घायल 8,9 किया जा सकता है। ई 8 द्वारा, सीएएम ऊतक की निरंतर वृद्धि भ्रूण के कपाल क्षेत्र को कवर करना शुरू कर देती है, इस प्रकार कॉर्निया तक आगे की पहुंच को रोकती है। यदि कोई पुराने ई 8-ई 9 कॉर्निया में घाव करना चाहता है, तो भ्रूण के संबंध में बढ़ते सीएएम को फिर से स्थापित करना संभव है (चरण 3.10। यदि कोई ई 7 पर घाव करना चाहता है, तो चरण 3.10। प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक नहीं है और कोई चरण 4, कॉर्नियल घाव के लिए आगे बढ़ सकता है। - इनक्यूबेटर से एक ई 7 अंडे निकालें जिसका अतिरिक्त झिल्ली पहले ई 5.5 (चरण 3.1.-3.8.) पर विच्छेदित किया गया था। निष्फल संदंश के साथ समझ सीएएम के लिए जुड़े किसी भी उपलब्ध एमनियन झिल्ली ऊतकों और धीरे भ्रूण के संबंध में एक उदर दिशा में भ्रूण के कपाल क्षेत्र से दूर एमनियन झिल्ली खींच।
नोट: चूंकि भ्रूण से दूर विस्थापित होने वाली एमनियोनिक झिल्ली सीएएम से जुड़ी हुई है, इसलिए बढ़ती और अत्यधिक संवहनी सीएएम एमनियन-लोभी संदंश का पालन करेगी और कपाल क्षेत्र से दूर चली जाएगी। भ्रूण घाव के लिए वांछित उम्र में है जब तक लगातार भ्रूण से दूर सीएएम विस्थापित करने के लिए दैनिक इस कदम को दोहराएँ।
4. कॉर्नियल घाव
- वांछित भ्रूण उम्र, ई 7-ई 9 पर घायल होने के लिए इनक्यूबेटर से एक अंडा प्राप्त करें। निष्फल विदारक कैंची के साथ खिड़की से दूर टेप काटने से भ्रूण का पर्दाफाश। भ्रूण को हाइड्रेट करने और अंडे को निष्फल करने के लिए पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं वाले रिंगर के समाधान की कुछ बूंदें जोड़ें।
- एक चीरा बनाने के लिए एक सूक्ष्म-विदारक चाकू का उपयोग करें जो दाहिनी आंख के कॉर्निया की सीमा को फैलाता है (भ्रूण अंडे में कैसे देता है, बाईं आंख सुलभ नहीं है, लेकिन एक गैर-घायल नियंत्रण के रूप में काम कर सकती है), जो कोरॉइड विदर (चित्रा 1) के समानांतर और अनुरूप है। पहला कट कॉर्नियल उपकला को पार करेगा।
- पहले चीरा 2x अधिक के रूप में एक ही स्थान पर कॉर्निया को फिर से लैस करने के लिए माइक्रो-विदारक चाकू का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, तीन कटौती कुल, कट 2 के साथ और कट 3 के साथ कॉर्निया में एक ही स्थिति के साथ कट 1)11। दूसरा लैसरेशन तहखाने की झिल्ली को पार करेगा, और तीसरा पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश करेगा।
नोट: यदि भ्रूण विच्छेदित सीएएम के तहत बस गया है, तो कोई भी सीएएम के नीचे से सिर को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करने के लिए निष्फल घुमावदार आईरिस संदंश का उपयोग कर सकता है। सिर के नीचे घुमावदार आईरिस संदंश की स्थिति, सिर के बाईं ओर के साथ संपर्क बनाते हैं। बंद घुमावदार आईरिस संदंश के शीर्ष पर पूरे सिर पालना और धीरे सीएएम के चारों ओर और ऊपर सिर उठाओ। व्यवहार्यता के साथ मदद करने के लिए, सीएएम के उचित विकास को बढ़ावा देने के लिए सर्जरी के बाद सीएएम के तहत भ्रूण को वापस टक करने के लिए घुमावदार आईरिस संदंश के साथ एक समान तकनीक का उपयोग करें।
- पहले चीरा 2x अधिक के रूप में एक ही स्थान पर कॉर्निया को फिर से लैस करने के लिए माइक्रो-विदारक चाकू का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, तीन कटौती कुल, कट 2 के साथ और कट 3 के साथ कॉर्निया में एक ही स्थिति के साथ कट 1)11। दूसरा लैसरेशन तहखाने की झिल्ली को पार करेगा, और तीसरा पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश करेगा।
- भ्रूण को हाइड्रेट करने और अंडे को निष्फल करने के लिए पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं वाले रिंगर के समाधान की 3-4 बूंदें जोड़ें।
- स्पष्ट टेप के साथ खिड़की के छेद को फिर से सील करें और अंडे को क्षैतिज छोड़कर इनक्यूबेटर पर लौटें। भ्रूण को विकसित करने और कॉर्नियल घाव को वांछित अवधि (जैसे, 0.5-11 दिन) के लिए ठीक करने की अनुमति दें, और फिर मानवीय रूप से भ्रूण को विघटन द्वारा इच्छामृत्यु दें।
- घुमावदार आईरिस संदंश का उपयोग रिंगर के खारा समाधान के पेट्री डिश में तैरने वाले इच्छामृत्यु भ्रूण से आंख को काटने के लिए धीरे-धीरे अपने पीछे की तरफ आंख को पकड़कर करें, जहां आंख और चेहरे के ऊतक मिलते हैं, और ध्यान से पूरी आंख को दूर उठाएं और चेहरे के ऊतकों से मुक्त करें।
- पूरी आंख के पीछे एक छोटे से छेद (3-5 सेमी) प्रहार करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें और हल्के आंदोलन के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में पूरी आंख को ठीक करें।
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Representative Results
विकासशील भ्रूण के कपाल क्षेत्र को उजागर करने के लिए ई 5.5 पर एसीएम और सीएएम के पहले विच्छेदन के बाद, ई 7 केंद्रीय कॉर्निया को फैलाने वाले लैसरेशन की एक श्रृंखला ओवो (चित्रा 1) में बनाई गई थी। कॉर्निया पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श घाव तीन घावों के बाद होता है, प्रत्येक कॉर्निया के एक ही स्थान पर बनाया जाता है। पहला लैसरेशन कॉर्नियल उपकला को पार करता है, जबकि दूसरा और तीसरा लैकरेशन क्रमशः अंतर्निहित तहखाने झिल्ली और पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश करता है। एक आदर्श घाव प्राप्त करने के लिए, एक तेज सूक्ष्म विच्छेदन चाकू ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करना और दबाव की सही मात्रा को लागू करना महत्वपूर्ण है क्योंकि लैसरेशन किया जाता है (चित्रा 2, आदर्श घाव देखें)। बहुत कम दबाव लागू करने से एक उथला घाव होगा जो पूर्वकाल स्ट्रोमा (चित्रा 2, उथले घाव देखें) को पर्याप्त रूप से मर्मज्ञ किए बिना कॉर्नियल उपकला को आँसू देता है। फिर भी, बहुत अधिक दबाव लागू करने से पूरे स्ट्रोमा में प्रवेश करने और बाहरी वातावरण में जलीय हास्य को उजागर करने के लिए एक पूर्ण सीमा घाव होता है (चित्रा 2, पूर्ण सीमा घाव देखें)।
उचित लेसरेटिंग चीरों को पूरा करने से एक आदर्श घाव (चित्रा 2) पैदा होता है जो शुरू में बढ़ता है (घायल होने के बाद 0-3 दिन)8 (चित्रा 3)। यह माना गया है कि घाव वृद्धि का चरण जो ई 7 चिकन कॉर्निया को घायल करके होता है, इस भ्रूण चरण8 में आंखों के आकार के तेजी से विस्तार से संबंधित है। भ्रूण चिकन आंखें ई 10 से हैचिंग तक आंखों की वृद्धि की तुलना में ई 4 से ई 10 तक काफी तेजी से बढ़ती हैं। आंखों की वृद्धि के इन शुरुआती तेज चरणों को ऊंचा इंट्राओकुलर दबाव (आईओपी) -निर्भर विकास के लिए जिम्मेदार ठहराया जाताहै 13. इसलिए, यह संभावना है कि ऊंचा आईओपी के साथ मिलकर आंख की तेजी से वृद्धि दर उपचार प्रक्रिया के शुरुआती चरणों (घाव के बाद 0-3 दिन) के दौरान घाव वापस लेने को बढ़ावा देती है, जो भ्रूण कॉर्निया घाव भरने की प्रगति के लिए अद्वितीय है। उसके बाद, फिर से उपकलाकरण और नए ऊतक गठन होते हैं (घाव के बाद 4-9 दिन) अंततः घाव8 (चित्रा 3 ए) के बाद 11 दिनों तक निशान मुक्त फैशन में घाव को बंद करने के लिए।
घाव की गहराई और उत्थान का आगे विश्लेषण एक लैमिनिन एंटीबॉडी के साथ क्रॉस-सेक्शन को धुंधला करके संभव था जो लैमिनिन समृद्ध तहखाने झिल्ली को चिह्नित करता है और परमाणु मार्कर डीएपीआई के साथ वर्गों को काउंटर-धुंधला करता है, जो कॉर्नियल उपकला8 के माध्यम से घाव की सीमा को प्रकट करता है। हाल ही में घायल कॉर्निया (0 डीपीडब्ल्यू) और जो उत्थान प्रक्रिया (3 डीपीडब्ल्यू) में जल्दी हैं, से पता चला है कि घाव उपकला परत और तहखाने झिल्ली में प्रवेश करता है, जैसा कि कॉर्नियल उपकला के भीतर परमाणु मार्कर डीएपीआई के ब्रेक-इन धुंधला होने और लैमिनिन एंटीबॉडी धुंधला होने की अनुपस्थिति से स्पष्ट है, जो कॉर्नियल उपकला और अंतर्निहित स्ट्रोमाके बीच लैमिनिन समृद्ध तहखाने झिल्ली को चिह्नित करता है ). हालांकि, डीएपीआई और लैमिनिन एंटीबॉडी के साथ दाग वाले 11 डीपीडब्ल्यू कॉर्निया के माध्यम से क्रॉस-सेक्शन ने एक पूरी तरह से ठीक कॉर्निया का खुलासा किया जिसे फिर से उपकलाकृत किया गया था और पुनर्जीवित घाव8 (चित्रा 3 बी) की साइट पर एक निरंतर लैमिनिन समृद्ध तहखाने झिल्ली शामिल थी।
कॉर्नियल चीरा के बाद, घाव भरने की प्रक्रिया का विस्तृत लक्षण वर्णन खंडित, घायल कॉर्नियल ऊतकों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करके पूरा किया गया था। बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन और टेनासिन उपकला और केराटोसाइट सेल माइग्रेशन के साथ वयस्क कॉर्नियल घावोंको ठीक करने में जुड़े हुए हैं 14,15. बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन, फाइब्रोनेक्टिन और टेनासिन का स्थानिक स्थानीयकरण उपचार घाव के भीतर स्पष्ट है और कॉर्नियल पुन: उपकलाकरण (घाव के 5 दिन बाद) 8 (चित्रा 4) के अनुरूप समय बिंदुओं पर ऊंचा पाया गया था। इस तरह के विश्लेषण से पता चलता है कि घाव बंद करने के लिए फाइब्रोनेक्टिन और टेनासिन के महत्व और विशेष रूप से, उपकला कोशिका प्रवास और अस्तित्व में उनकी भागीदारी, वयस्क कॉर्नियलघावों 16,17 में ऐसे कार्यों के अनुरूप है।
ई 8-ई 9 से शुरू होकर, कॉर्निया ट्राइजेमिनल संवेदी तंत्रिका तंतुओं द्वारा घनीभूत हो जाता है जो एक पेरिकोर्नियल तंत्रिका अंगूठी से निकलते हैं और पूर्वकाल स्ट्रोमा के माध्यम से पार करते हैं क्योंकि वे कॉर्निया के केंद्र और कॉर्नियल उपकला की ओर प्रोजेक्ट करते हैं ई12 18,19,20। चूंकि इस मॉडल में कॉर्नियल घाव ई 7 में बनाए जाते हैं, कॉर्निया में तंत्रिका प्रक्षेपण से कुछ समय पहले, यह मॉडल कॉर्नियल नसों की जांच करता है क्योंकि वे अपमान के बाद एक उपचार कॉर्निया नेविगेट करते हैं। एंटी-β तंत्रिका ट्यूबुलिन (टुज 1) एंटीबॉडी21 के साथ कॉर्नियल नसों का पता लगाने के लिए पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके, यह स्पष्ट है कि नसों को अस्थायी रूप से उपचार कॉर्नियल ऊतक से बाधित किया जाता है जो सीधे घायल, केंद्रीय कॉर्निया (घायल होने के 5 दिन बाद) 8 (चित्रा 5 ए, बी) से जुड़ता है। पहले के निषेध के बावजूद, कॉर्नियल तंत्रिकाएं अंततः पूरी तरह से ठीक कॉर्नियल ऊतक (घाव के बाद 11 दिन) को समान घनत्व के स्तर पर और चरण-मिलान, गैर-घायल नियंत्रण (ई 18 सी) (चित्रा 5 सी, डी) के समान पैटर्न में प्रवेश करती हैं।
आश्चर्यजनक रूप से, पूरी तरह से पुन: उपकला कॉर्नियल ऊतक जो एक गैर-फाइब्रोटिक, स्कारलेस फैशन में ठीक हो गए हैं, सामान्य कोलेजन ऊतक वास्तुकला का एक पूर्ण पुनरावृत्ति प्रदर्शित करते हैं। जैसा कि दूसरी पीढ़ी के हार्मोनिक इमेजिंग22,23 द्वारा प्रमाणित किया गया है, केंद्रीय कॉर्निया घाव क्षेत्र की अलग-अलग गहराई में कोलेजन फाइबर के बंडलों को ऑर्थोगोनली व्यवस्थित किया जाता है, जो गैर-घायल केंद्रीय कॉर्नियल ऊतक9 (चित्रा 6) के मूल मैक्रोस्ट्रक्चर से मेल खाता है।
चित्रा 1: ओवो एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली विच्छेदन और कॉर्नियल घाव में योजनाबद्ध। ई 5.5 पर, भ्रूण के कपाल क्षेत्र को एसीएम और सीएएम झिल्ली को विच्छेदन करके और विकासशील आंखों से एमनियन और एलेंटोइस को दूर करके उजागर किया जाता है। अंडे सील कर रहे हैं और E7 करने के लिए ऊष्मायन जब केंद्रीय कॉर्निया घायल हो जाता है, एक माइक्रोसर्जिकल चाकू की नोक के रूप में एक माइक्रोसर्जिकल चाकू की नोक केंद्रीय कॉर्निया में एक चीरा बनाता है के रूप में एक पालना के रूप में घुमावदार संदंश का उपयोग कर। घाव कोरॉइड विदर (तारांकन) के समानांतर उन्मुख है। चीरा की गहराई पूर्वकाल स्ट्रोमा तक पहुंचने के लिए, चाकू के साथ तीन समवर्ती कटौती करने की आवश्यकता होती है, प्रत्येक एक ही सापेक्ष स्थिति में, एक दूसरे पर। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा संदर्भ 8,11 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: ओवो में उत्पन्न घावों में भिन्नता (ए) ई 5.5 पर झिल्ली विच्छेदन के बाद, दाहिनी आंख ओवो में सुलभ है। (बी-डी) अलग-अलग डिग्री के लैकरेशन के तुरंत बाद एक इन ओवो भ्रूण से ली गई छवियां जो कॉर्निया की सीमा तक फैली हुई हैं और कोरॉइड फिशर (सीएफ) के अनुरूप हैं। (बी) तीन घावों के बाद जिसमें कमजोर दबाव लागू किया गया था, एक उथला घाव दिखाई देता है। एरोहेड कॉर्निया में एक साइट को चिह्नित करता है जहां उपकला को शीयर किया गया है लेकिन पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश नहीं किया गया है। एरोहेड्स एक छोटे कॉर्निया क्षेत्र को दर्शाता है जहां पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश किया गया है। (सी) तीन घावों के बाद जिसमें दबाव की एक आदर्श मात्रा लागू की गई थी, एक आदर्श घाव दिखाई देता है। एरोहेड्स कॉर्निया की पूरी सीमा में फैले घाव को दर्शाते हैं जहां पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश किया गया है। (डी) तीन घावों के बाद जिसमें अत्यधिक दबाव लागू किया गया था, एक पूर्ण सीमा घाव दिखाई देता है, और जलीय हास्य बाहरी वातावरण के संपर्क में आ गया है। संक्षिप्त नाम: टीसीए, लौकिक सिलिअरी धमनी; सीएफ, कोरॉइड विदर; सीएएम, कोरियोएलेंटोइक झिल्ली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(ए) चरण-मिलान नियंत्रणों की तुलना में घायल कॉर्निया में उपचार की प्रगति घाव (0 डीपीडब्ल्यू) और 16 घंटे के बाद घाव (एचआरपीडब्ल्यू) के समय से 3-11 दिनों के बाद घाव (डीपीडब्ल्यू) के माध्यम से दिखाई जाती है। एरोहेड्स घाव के पृष्ठीय- और उदर-सबसे सीमाओं को चित्रित करते हैं, घाव विस्तार (0-3 डीपीडब्ल्यू) की अवधि का संकेत देते हैं, इसके बाद प्रगतिशील घाव बंद (5-11 डीपीडब्ल्यू)। (बी) खंडित डीएपीआई (नीला) - और लैमिनिन (लाल) - 0, 3 और 11 डीपीडब्ल्यू पर दाग घायल कॉर्निया। कोष्ठक घायल क्षेत्र की सीमा दिखाते हैं, जो 3 डीपीडब्ल्यू द्वारा घाव के विस्तार और ई 11 द्वारा पुन: उपकला कॉर्निया की पूर्ण मरम्मत का खुलासा करता है। तारांकन कॉर्निया के चंगा क्षेत्र को दर्शाता है। स्केल बार (ए) 1 मिमी, (बी) 100 μm है। आकृति को संदर्भ8 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: घायल कॉर्निया का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। (ए) 3 डीपीडब्ल्यू और (बी) 5 डीपीडब्ल्यू के माध्यम से क्रॉस-सेक्शन। डीएपीआई-दाग (नीला) घायल कॉर्निया फाइब्रोनेक्टिन (एफएन, लाल) और टेनासिन-सी (टीएन-सी, हरा) के स्थानीयकरण को प्रकट करता है। (ए) और (बी) में कोष्ठक घायल क्षेत्र को दर्शाते हैं। स्केल बार: 100 μm. संक्षिप्त नाम: ईपी, उपकला; सेंट, स्ट्रोमा; एन, एंडोथेलियम। आकृति को संदर्भ8 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: घायल कॉर्निया का आविष्कार (ए-डी) एंटी-β तंत्रिका ट्यूबुलिन (टीयूजे 1) पूरे माउंट इम्यूनोस्टेनिंग के बाद कॉर्नियल नसों का विज़ुअलाइज़ेशन (बी) 5 डीपीडब्ल्यू और (डी) 11 डीपीडब्ल्यू कॉर्निया, साथ ही (ए) चरण-मिलान ई 12 (ई 12 सी, 5 डीपीडब्ल्यू के लिए चरण-मिलान) और (सी) ई 18 नियंत्रण (ई 18 सी) (बी) 5 डीपीडब्ल्यू कॉर्निया में टूटी हुई रेखा घाव की सीमा को दर्शाती है। घाव से सीधे सटे ब्रैकेटेड क्षेत्र कॉर्निया क्षेत्र को दर्शाता है जो अस्थायी रूप से नसों के लिए प्रतिकारक है और सक्रिय रूप से पुन: उपकलाकरण से गुजर रहा है। (बी') खुले घाव से सटे हीलिंग कॉर्नियल ऊतक के माध्यम से ऑप्टिकल स्कैन ऊतक (तीर) और उपकला तंत्रिका पट्टा (तीरहेड) में फैले एक दुर्लभ स्ट्रोमल तंत्रिका बंडल का पता चलता है। (सी, डी) 11 डीपीडब्ल्यू पर पूरी तरह से पुनर्जीवित कॉर्निया चरण-मिलान नियंत्रणों के लिए समान अंतर्वेशन पैटर्न और तुलनीय तंत्रिका घनत्व प्रदर्शित करते हैं। संक्षिप्त नाम: डब्ल्यू, घाव। आकृति को संदर्भ8 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: चंगा भ्रूण कॉर्निया में कोलेजन अल्ट्रास्ट्रक्चर( ए) दूसरी पीढ़ी के हार्मोनिक इमेजिंग (एसजीएच) का उपयोग करके पूरी तरह से चंगा 10 डीपीडब्ल्यू कॉर्निया और चरण-मिलान नियंत्रण का एन फेस स्कैन। स्कैन गहराई कॉर्निया की पूर्वकाल सतह से 2-66 μm से होती है (0 μm सबसे पूर्वकाल स्ट्रोमा है) और संबंधित छवियों के बाईं ओर सूचीबद्ध हैं। प्रत्येक छवि के लिए इनसेट उस विशेष स्कैन गहराई के लिए केंद्रीय घाव क्षेत्र के फास्ट फूरियर रूपांतरण विश्लेषण के अनुरूप हैं। (बी) दो आयामी फास्ट फूरियर रूपांतरण विश्लेषण के मैन्युअल रूप से खंडित ढेर, घायल और चरण-मिलान नियंत्रण कॉर्निया के भीतर कोलेजन संगठन का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 50 μm। आकृति संदर्भ9 से अनुमति के साथ अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
चूजा भ्रूण, स्कारलेस कॉर्निया घाव की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली है। स्तनधारियों के विपरीत, ओवो8 या पूर्व ओवो रणनीतियों24 में उपयोग करके चूजा पूरे विकास में आसानी से सुलभ है। भ्रूण चिक कॉर्निया कृंतक कॉर्निया की तुलना में बहुत बड़ा है, जिसमें लगभग 50% कपाल की मात्रा आंख25 को समर्पित है, जिससे यह घाव जैसे शारीरिक जोड़तोड़ के लिए अत्यधिक उत्तरदायी है। इसके अलावा, चिकन अंडे साल भर आसानी से उपलब्ध होते हैं, अक्सर स्थानीय खेतों से, और लागत प्रभावी होते हैं, विकास का समर्थन करने के लिए केवल एक ह्यूमिफाइड इनक्यूबेटर की आवश्यकता होती है।
यह प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला की रिपोर्ट करता है जो भ्रूण चिक कॉर्निया घायल होने को सक्षम करता है। भ्रूण की लड़की कॉर्निया के लिए किए गए घाव पूरी तरह से पुनर्जीवित होते हैं, जिससे देशी कॉर्नियल संरचना का पूर्ण पुनरावृत्ति संभव हो जाता है जिसमें कोई पता लगाने योग्य निशान नहीं होता है। इस तकनीक ने भ्रूण की लड़की को स्कारलेस कॉर्नियल घाव भरने के समन्वय करने वाले आणविक और सेलुलर कारकों को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण पशु मॉडल बना दिया है।
यहां वर्णित भ्रूण के घाव भरने के मॉडल में निहित स्पष्ट वादे के बावजूद, यह ध्यान देने योग्य है कि भ्रूण और वयस्क कॉर्नियल घाव भरने के बीच स्पष्ट अंतर हैं। भ्रूण कॉर्निया विकास कारकों और मॉर्फोजेनेटिक संकेतों को व्यक्त करता है जो वयस्क ऊतकों में चुप या अनुपस्थितहोते हैं 26. इसके अलावा, घायल वयस्क कॉर्नियल ऊतक फाइब्रोसिस का प्रदर्शन करते हैं और निशान ऊतक बनाते हैं, संभवतः साइटोकिन्स और विकास कारकों27 द्वारा मध्यस्थता की गई बढ़ी हुई भड़काऊ प्रतिक्रिया के कारण, जो भ्रूण के चरणों में नम या अभी तक स्थापित नहीं हैं। कॉर्नियल ऊतक के भीतर इस तरह के उम्र से संबंधित मतभेद वयस्क घायल ऊतक को पूरी तरह से बहाल करने के प्रयासों को जटिल कर सकते हैं। फिर भी, भ्रूण के स्कारलेस घाव भरने को विनियमित करने वाले प्रमुख आणविक कारकों और मैट्रिक्स प्रोटीन का निर्धारण उन उपचारों के लिए मार्ग प्रशस्त करेगा जो सामान्य ऊतक वास्तुकला के कम निशान और बेहतर पुनरावृत्ति के साथ अधिक पुनर्स्थापनात्मक उपचार प्रक्रिया को बढ़ावा देते हैं।
यहां वर्णित घाव विधि स्पर्लिन एट अल .11 द्वारा विकसित एक तकनीक पर बनाती है ताकि देर से चरण के चूजे भ्रूण (जैसे, >ई 6) तक ओवो पहुंच प्राप्त की जा सके। अंडे को खिड़की करके और कपाल क्षेत्र से दूर अतिरिक्त झिल्ली को विच्छेदन करके, भ्रूण की आंख ई 7 के रूप में देर से चरणों के लिए सुलभ है। जैसा कि हमने पहले बताया है, क्रमशः एमनियोकोरियोनिक और कोरियोएलेंटोइक झिल्ली को हटाने और विस्थापन, भ्रूण के विकास को प्रभावित नहीं करते हैं11. उजागर भ्रूण व्यवहार्य हैं और शारीरिक हेरफेर के लिए आसानी से उत्तरदायी हैं। इस स्तर पर, कॉर्निया में तीन अलग-अलग परतें (उपकला, स्ट्रोमा और एंडोथेलियम) होती हैं, जो इसे पूर्वकाल स्ट्रोमा में रैखिक चीरा के बाद घाव भरने के अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाती हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, समय के साथ एलांटोइस वृद्धि में वृद्धि के कारण, आंख तक पहुंच अंततः ई 8 पर रुक जाती है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, यदि घाव के लिए बाद के चरण की आंखों तक पहुंच वांछनीय है, तो हमने पाया है कि आंख तक पहुंच ई 9 के माध्यम से अतिरिक्त झिल्ली (जैसे, ई 7, ई 8, आदि पर) के दैनिक हेरफेर को पूरा करके बनाए रखी जा सकती है, जिसमें एलांटोइस को सावधानीपूर्वक कपाल क्षेत्र से दूर रखा जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इसकी वृद्धि भ्रूण से दिशात्मक रूप से दूर होती है। यह कॉर्निया को इन बाद के चरणों में घायल होने में सक्षम बनाता है (उदाहरण के लिए, निम्नलिखित)
कुल मिलाकर, इस तकनीक में भ्रूण व्यवहार्यता और उत्तरजीविता कई कारकों पर निर्भर करती है, जैसे कि यह सुनिश्चित करना कि भ्रूण रक्त वाहिकाओं या एलांटोइस को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधानी बरतते हुए एक बाँझ और हाइड्रेटेड अंडे का वातावरण बनाए रखा जाए। बाँझपन बनाए रखने के लिए खिड़की से पहले पूरे अंडे की सतह को इथेनॉल के साथ निष्फल किया जाना चाहिए। ऐसा इसलिए है क्योंकि छोटे अंडे के छिलके, जो अक्सर रोगाणुओं से भरे होते हैं, आमतौर पर खिड़की की प्रक्रिया के दौरान अंडे में गिर जाएंगे। इसी तरह, खिड़की, झिल्ली विच्छेदन और कॉर्नियल चीरा बनाने में शामिल सभी उपकरणों को इथेनॉल में अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए और उनके उपयोग से पहले सूखे या लौ-निष्फल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एंटीबायोटिक दवाओं को अंडे में जोड़ा जाना चाहिए जब भी भ्रूण बाहरी वातावरण के संपर्क में आता है। यह और महत्वपूर्ण है कि भ्रूण खिड़की के बाद उचित जलयोजन को बरकरार रखता है। यह सुनिश्चित करने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए कि खिड़की पूरी तरह से टेप के साथ सील है और कोई हवा का अंतराल नहीं रहता है। अंडे के छिलके की सतह का पूरी तरह से पालन करने और छेद को पूरी तरह से सील करने वाले टेप के महत्व को देखते हुए, टेप लगाने से पहले छेद के चारों ओर अंडे के छिलके की सतह को साफ और सूखने की आवश्यकता होती है। अंत में, यह जरूरी है कि कोई रक्त वाहिकाओं को अनजाने में नहीं काटा जाता है और यह कि भ्रूण से तरल अपशिष्ट को संग्रहीत करने वाला एलांटोइस, एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली के विच्छेदन के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं होता है क्योंकि या तो भ्रूण के लिए घातक होता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भ्रूण की व्यवहार्यता तब अधिक होती है जब कोरियोन और एमनियन के छोटे आँसू बनाए जाते हैं, हालांकि आंसू कपाल क्षेत्र से दूर एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली की स्थिति के लिए पर्याप्त रूप से बड़ा होना चाहिए। यदि उच्च गुणवत्ता वाले अंडे से झिल्ली के विच्छेदन और हटाने के दौरान ये सावधानीपूर्वक कदम उठाए जाते हैं, तो कोई भी लगभग सभी भ्रूणों को खिड़की की प्रक्रिया (~ 99%) से बचने की उम्मीद कर सकता है, जबकि उजागर भ्रूण का ~ 40% ई 9 और ~ 30% ई 1211 तक जीवित रहता है। हमारे अनुभव में, ई 7-ई 9 झिल्ली विच्छेदित भ्रूण के कॉर्निया को घायल करने से भ्रूण व्यवहार्यता पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है, और पर्याप्त भ्रूण ई 18 के माध्यम से व्यवहार्य रहते हैं, जिस बिंदु पर कॉर्निया घाव पूरी तरह से ठीक हो जाता है।
कॉर्नियल उपकला को पार करने वाले घावों को प्राप्त करना और पूर्वकाल स्ट्रोमा में प्रवेश करना विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। एक उच्च गुणवत्ता वाले सूक्ष्म विदारक चाकू आवश्यक है ताकि बहुत कम दबाव लागू करने की आवश्यकता हो। घुमावदार आईरिस संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना धीरे-धीरे सिर को पालने में सहायक हो सकता है क्योंकि लैकरेशन दूसरे हाथ से बनाया जाता है। इस तरह, घुमावदार आईरिस संदंश एक बैकस्टॉप के रूप में काम करते हैं ताकि कॉर्निया घाव के दौरान स्थिर रहे। स्ट्रोमा में घाव का प्रवेश परिवर्तनशील है, खासकर जब सीखना, लेकिन अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो जाता है क्योंकि शोधकर्ता कॉर्नियल उपकला को तोड़ने का अनुभव और रूप सीखता है। जैसा कि कोई सीख रहा है, क्रॉस-सेक्शन में घायल कॉर्निया को देखने में मददगार हो सकता है ताकि कॉर्नियल स्ट्रोमा में घाव प्रवेश की गहराई का आकलन किया जा सके (कॉर्नियल लैसरेशन के तुरंत बाद आदर्श घाव की गहराई प्रदर्शित करने वाले क्रॉस-सेक्शनेड कॉर्निया के उदाहरण के लिए चित्रा 3 बी देखें)।
जब शास्त्रीय विकासात्मक जीव विज्ञान तकनीकों के साथ संयुक्त किया जाता है, जैसे कि ऊतक ग्राफ्टिंग और मनका प्रत्यारोपण, या जीन हेरफेर के लिए आधुनिक दृष्टिकोण, जैसे डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन और रेट्रोवायरल संक्रमण, कॉर्नियल पुनर्जनन का यह पशु मॉडल क्षति के बाद कॉर्नियल ऊतक की पूर्ण वसूली प्राप्त करने के लिए आवश्यक आणविक कारकों और सेलुलर तंत्र को प्रकट करने का वादा करता है। इसके अलावा, इस पशु मॉडल का उपयोग कॉर्नियल पुनर्जनन को बढ़ाने के लिए बहिर्जात चिकित्सीय यौगिकों की संभावित उपयोगिता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास इस पांडुलिपि में प्रस्तुत जानकारी के बारे में कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को इलिनोइस वेस्लेयन विश्वविद्यालय के माध्यम से टीएस के लिए एक कलात्मक और विद्वानों के विकास अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और एनआईएच-आर 01 ईवाई 022158 (पीएल) द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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