Summary
Det nuvarande protokollet visar de olika stegen som är involverade i att såra hornhinnan hos en embryonal kyckling i ovo. De regenererande eller helt återställda hornhinnorna kan analyseras för regenerativ potential med hjälp av olika cellulära och molekylära tekniker efter sårproceduren.
Abstract
Chick embryonala hornhinnesår visar en anmärkningsvärd förmåga att helt och snabbt regenerera, medan vuxna sårade hornhinnor upplever en förlust av transparens på grund av fibrotisk ärrbildning. Vävnadsintegriteten hos skadade embryonala hornhinnor återställs i sig utan detekterbar ärrbildning. Med tanke på dess tillgänglighet och lätthet att manipulera är kycklingembryomet en idealisk modell för att studera ärrlös hornhinnesårreparation. Detta protokoll visar de olika stegen som är involverade i att såra hornhinnan hos en embryonal kyckling i ovo. Först fönsteras ägg i tidiga embryonala åldrar för att komma åt ögat. För det andra utförs en serie in ovo fysiska manipuleringar till de extraembryoniska membranen för att säkerställa att tillgången till ögat upprätthålls genom senare utvecklingsstadier, vilket motsvarar när de tre cellulära skikten i hornhinnan bildas. För det tredje tillverkas linjära hornhinnesår som tränger in i det yttre epitelskiktet och den främre stroma med hjälp av en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprocessen eller helt återställda hornhinnor kan analyseras för regenerativ potential med hjälp av olika cellulära och molekylära tekniker efter sårproceduren. Studier hittills med hjälp av denna modell har visat att sårade embryonala hornhinnor visar aktivering av keratocytdifferentiering, genomgår samordnad ombyggnad av ECM-proteiner till deras ursprungliga tredimensionella makrostruktur och blir tillräckligt re-innerverade av hornhinnans sensoriska nerver. I framtiden kan den potentiella effekten av endogena eller exogena faktorer på den regenerativa processen analyseras vid läkning av hornhinnor med hjälp av utvecklingsbiologiska tekniker, såsom vävnadstransplantation, elektroporering, retroviral infektion eller pärlimplantation. Den nuvarande strategin identifierar den embryonala kycklingen som ett avgörande experimentellt paradigm för att belysa de molekylära och cellulära faktorer som samordnar ärrlös hornhinnesårläkning.
Introduction
Hornhinnan är den transparenta, yttre vävnaden i ögat som överför och bryter ljus som bidrar till synskärpa. I den vuxna hornhinnan leder skada eller infektion i hornhinnans stroma till ett snabbt och robust sårläkningssvar som kännetecknas av keratocytproliferation, fibros, ökad inflammation som leder till cytokininducerad apoptos, generering av reparationsmyofibroblaster och övergripande ombyggnad av den extracellulära matrisen (ECM)1,2 . Efter skada resulterar sådan reparation av hornhinnan i vävnad i ogenomskinlig ärrvävnad som minskar hornhinnans transparens och täcker ljusets passage, vilket snedvrider synen och i de allvarligaste fallen leder till hornhinneblindhet3. Det finns således ett tydligt behov av att utveckla tillförlitliga djurmodeller för att ta itu med komplexiteten i sårläkning och för att identifiera de cellulära och molekylära faktorer som är ansvariga för sårstängning och vävnadsregenerering.
Hittills har de flesta studier som undersöker hornhinnans sårläkning använt postnatal4 eller vuxna djurmodeller 1,2,5,6,7. Även om dessa studier har lett till en betydande utveckling i förståelsen av hornhinnans sårläkningssvar och mekanismerna bakom ärrbildning, misslyckas de skadade hornhinnevävnaderna i dessa läkningsmodeller att regenerera helt, vilket begränsar deras användbarhet för att identifiera de molekylära faktorer och cellulära mekanismer som är ansvariga för att fullständigt rekapitulera hornhinnans morfologi och struktur efter skada. Däremot har fostersår som genereras med en kniv i den embryonala kycklinghinnan en inneboende förmåga att läka helt på ett ärrlöst sätt8. Specifikt uppvisar den embryonala kycklinghinnan icke-fibrotisk regenerering med fullständig rekapitulation av den extracellulära matrisstrukturen och innervationsmönstren 8,9.
Det nuvarande protokollet beskriver en sekvens av steg som är involverade i att såra hornhinnan hos en embryonal kyckling i ovo. Först fönsteras ägg i tidiga embryonala åldrar för att underlätta tillgången till embryot. För det andra utförs en serie in ovo fysiska manipuleringar till de extraembryoniska membranen för att säkerställa att tillgången till ögat upprätthålls genom senare utvecklingsstadier, vilket motsvarar när de tre cellulära skikten i hornhinnan bildas och sår önskas. För det tredje görs linjära centrala hornhinnesnitt som tränger igenom hornhinneepitelet och in i den främre stroma med hjälp av en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprocessen eller helt återställda hornhinnor kan analyseras för regenerativ potential med hjälp av olika cellulära och molekylära tekniker efter sårproceduren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Äggstammen som användes i detta protokoll var White Leghorn, och alla djurprocedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Illinois Wesleyan University.
1. Inkubation av kycklingägg
- Håll äggen vid ~ 10 ° C i upp till 1 vecka efter att de har lagts för att stoppa utvecklingen. När du är redo att initiera utvecklingen av kycklingembryon, torka av hela äggskalet med luddfria våtservetter (se materialtabell) mättade med rumstemperaturvatten för att ta bort smuts och skräp.
- Se till att äggskalet är sanerat. Torka av hela äggytan med luddfria våtservetter dämpade med 70% etanol. Torka snabbt av etanolen för att torka ägget och undvik etanolabsorption genom äggskalet till embryot.
- Ordna äggen horisontellt på en bricka. Markera toppen av ägget för att beteckna embryonets förväntade position. Inkubera äggen horisontellt, med gungfunktionen aktiverad, i en fuktad inkubator på 38 °C.
2. Fönsterlägg äggen för att förbereda sig för membrandissektion
- Ta bort ägg från inkubatorn på den tredje dagen av embryonal utveckling (E3). Sterilisera toppen av äggen med luddfria våtservetter dämpade med 70% etanol. Torka etanolen från äggskalsytorna.
OBS: För att säkerställa att utvecklingen inte försenades under fönsterproceduren avlägsnades 6-12 ägg, och proceduren utfördes snabbt på dessa medan de återstående äggen lämnades i inkubatorn. - Placera ett ägg horisontellt i en säker ägghållare (se materialtabell). Använd den skarpa änden av dissekerande sax och skapa ett litet hål i toppen av äggskalet nära äggets spetsiga ände.
OBS: Detta hål kommer att underlätta avlägsnandet av albumen, vilket är nödvändigt för att släppa äggulan och embryot bort från den inre äggskalytan. För ägghållare användes äggfyllnadsplattor av pappersmassa, inom vilka äggen levereras. - Genom hålet (steg 2.2.), sätt in en 18 G fasad hypodermisk nål. Med nålen tryckt mot äggets nedre inre yta och nålens avfasningssida mot äggets spetsiga ände (t.ex. bort från äggulans och embryots förväntade plats nära mitten av ägget), ta bort 2-3 ml albumen från kycklingägget och kassera.
OBS: Om ens nål nickar embryot eller dess tillhörande kärl under detta steg, kommer det att resultera i att blod aspireras med albumen. Detta kommer att leda till embryodöd. Vidare, om äggulan oavsiktligt aspireras tillsammans med albumen under detta steg, kommer embryot inte att vara livskraftigt. I båda fallen ska ägget kasseras om embryot inte omedelbart kan användas för andra ändamål. - Rengör äggskalsytan som omger hålet med luddfria våtservetter lätt dämpade med 70% etanol och torka torrt. Försegla hålet som är gjort för att ta bort albumen med klar tejp.
- Med den skarpa änden av dissekerande sax, gör ett andra "fönster" -hål i toppen av äggskalet på markeringsstället (steg 1.3.). Se till att saxen inte sträcker sig för långt in i äggskalet för att undvika att komma i kontakt med och skada embryot eller embryonal vaskulaturen, som ofta kommer att placeras i ägget direkt under platsen för det andra hålet.
- Använd böjda iristångar, bredda "fönster" -hålet så att det sträcker sig ~ 2-3 cm i diameter och fungerar som ett "fönster" till det utvecklande embryot under skalet.
- Sätt in ena änden av tången i hålet, håll den parallell med och tätt intill äggskalet. Med den andra tångänden placerad utanför äggskalet, kläm försiktigt ihop de två tångändarna, så att de kan bryta och ta bort små bitar av äggskalet. Fortsätt bryta och ta bort äggskalfragment tills det finns kvar ett 2-3 cm fönster som direkt överlagrar embryot.
OBS: Ägg där embryon inte ligger direkt under hålet i steg 2.6. får inte användas eftersom de kommande membrandissektionerna skulle vara utmanande att slutföra. Även med att gunga äggen horisontellt är cirka 10% av äggen oanvändbara på grund av embryots dåliga placering. Dessa embryon kan användas för andra ändamål.
- Sätt in ena änden av tången i hålet, håll den parallell med och tätt intill äggskalet. Med den andra tångänden placerad utanför äggskalet, kläm försiktigt ihop de två tångändarna, så att de kan bryta och ta bort små bitar av äggskalet. Fortsätt bryta och ta bort äggskalfragment tills det finns kvar ett 2-3 cm fönster som direkt överlagrar embryot.
- För att begränsa bakteriell kontaminering, tillsätt genom fönsterhålet (t.ex. i ägget) ~ 100-200 μL Ringers lösning (8 g NaCl, 0,37 g KCl och 0,23 g CaCl2,2H 20 per L destillerat H20) innehållande penicillin / streptomycinantibiotika (50 U / ml penicillin och 50 μg / ml Streptomycin, se materialtabell).
- Täta fönsterhålet med tydlig tejp. Utför äggtätningen genom att rikta in ett hörn av tejpen på hålets långa axel och trycka tejpen mot skalet ~ 1-2 cm från hålets kant.
- Fortsätt tätningen runt öppningen tills en hängande tejpklaff finns kvar på ena sidan. Tryck ihop de två tejpbitarna, skapa en kupolformad form över hålet och tryck på klaffen på överhängande tejp mot skalet för att försegla ägget.
OBS: Ägg måste fönsteras på antingen E2 eller E3. Enligt erfarenhet resulterar fönster före E2 i låg embryoviabilitet. Dessutom, vid E4, blir embryot och extraembryoniska membran fästa vid äggskal10, och alla försök att fönstera vid E4 eller senare resulterar ofta i embryoskador eller rivning av extraembryoniska blodkärl, med endera händelsen som leder till resultatet av embryodöd.
- Fortsätt tätningen runt öppningen tills en hängande tejpklaff finns kvar på ena sidan. Tryck ihop de två tejpbitarna, skapa en kupolformad form över hålet och tryck på klaffen på överhängande tejp mot skalet för att försegla ägget.
- Returnera de "fönsterade" äggen till inkubatorn för vidare utveckling. Se till att hålla äggen horisontella och stäng av inkubatorns gungfunktion.
- Upprepa steg 2.2.-2.9. för varje ägg.
3. Mikrodissektioner av de extraembryoniska membranen
- Ta bort ett E5.5-fönsterägg från inkubatorn. Exponera embryot genom att klippa tejpen bort från fönstret med steriliserad dissekeringssax.
- Använd ett dissekerande mikroskop för att observera embryot och dess extraembryoniska membran genom fönstret. Använd vid behov sax eller böjd iristång för att vidga fönstret så att embryot är väl placerat under fönstret, var noga med att inte skada embryonal vaskulaturen.
- Tillsätt två droppar Ringers lösning som innehåller penicillin/streptomycinantibiotika för att återfukta embryot och sterilisera ägget.
- Använd ett dissekeringsmikroskop för att säkerställa att embryot befinner sig i rätt utvecklingsstadium (Hamburger Hamilton steg 27, ~ E5.5)11,12 och lokalisera positionerna för det amniochorioniska membranet (ACM) och det korioallantoiska membranet (CAM).
OBS: I detta skede är embryot omgivet av ACM, som består av fosterhinnan och det överliggande korionmembranet smält och delvis täckt av den mycket vaskulära allantoisen, som sträcker sig från embryots tarmregion och smälter samman med den överliggande korionen för att bilda CAM11,12. ACM är inte kraftigt vaskulariserad, vilket gör att man kan dissekera dessa membran för att exponera embryot utan att skada blodkärlen och skada embryot. - Utför extraembryoniska membrandissektioner i detta skede (E5.5).
OBS: E5.5 är den perfekta tiden att utföra de extraembryoniska membrandissektionerna. Dissekering av membranen tidigare (t.ex. vid E4) före CAM-bildning minskar embryotillgängligheten i senare skeden11. Dessutom, vid E5.5, är embryot endast delvis täckt av den mycket vaskulära CAM, men under de kommande 1-2 dagarna omsluter CAM snabbt och utesluter ytterligare tillgång till embryot11,12. Av denna anledning är membrandissektion vid E6 eller senare utmanande eftersom risken för att riva blodkärl ökar.- Använd ett par steriliserade fina pincett för att försiktigt ta tag i ACM och dra bort den från embryot. Använd sedan steriliserad mikrodissekerande sax för att skära ett hål i ACM direkt ovanför frambenet som sträcker sig från membranet som ligger över frambenet till membranet som ligger över huvudet.
OBS: Detta steg slappnar av korion- och amnionmembranen, vilket gör dem lättare att ta tag i och ytterligare dissekera med pincett i nästa steg. Se figur 1 för ett användbart schema över hur membran dissekeras genom äggskalsfönstret.
- Använd ett par steriliserade fina pincett för att försiktigt ta tag i ACM och dra bort den från embryot. Använd sedan steriliserad mikrodissekerande sax för att skära ett hål i ACM direkt ovanför frambenet som sträcker sig från membranet som ligger över frambenet till membranet som ligger över huvudet.
- Använd två par fina, sterila pincett för att försiktigt ta tag i amnionen i två intilliggande positioner mellan ACM och CAM (t.ex. ett område mellan snittet ovanför frambenet och närmaste kant på CAM).
- Flytta försiktigt varje par pincett, båda greppar fosterhinnan ordentligt, bort från varandra, med ett par som rör sig dorsalt till embryot och det andra ventralt.
OBS: Denna rörelse tjänar till att riva amnionen ytterligare samtidigt som den separerar ACM (som dras i ryggriktningen med avseende på embryot av ett par pincett) och CAM (som dras i ventral riktning med avseende på embryot av det andra paret tång). - Se till att membranen separeras när CAM inte längre täcker embryot och den allantoiska artären och venen, som kommer från embryonal tarm till CAM, är lätt uppenbara.
- Flytta försiktigt varje par pincett, båda greppar fosterhinnan ordentligt, bort från varandra, med ett par som rör sig dorsalt till embryot och det andra ventralt.
- Använd steriliserade fina pincett för att dissekera och ta bort eventuellt kvarvarande amnionmembran som täcker embryot. Det observeras oftast att den återstående amnionen delvis täcker den kaudala halvan av embryot.
- Använd steriliserade tångar, ta tag i amnionen nära embryots mittkraniella region och dra försiktigt amnionen i en kaudal riktning med avseende på embryot mot den tidigare förskjutna CAM. Embryot kommer nu att exponeras fullt ut, och ytterligare tillväxt av CAM kommer huvudsakligen att ske bort från det utvecklande embryot.
OBS: Se figur 1 för en användbar schematisk bild av hur det exponerade embryot kommer att se ut efter membrandissektion. Se också en tidigare publicerad rapport11 för användbara schematiska diagram över steg 3.3.-3.6.
- Använd steriliserade tångar, ta tag i amnionen nära embryots mittkraniella region och dra försiktigt amnionen i en kaudal riktning med avseende på embryot mot den tidigare förskjutna CAM. Embryot kommer nu att exponeras fullt ut, och ytterligare tillväxt av CAM kommer huvudsakligen att ske bort från det utvecklande embryot.
- Tillsätt några droppar Ringers lösning som innehåller penicillin / streptomycinantibiotika för att återfukta embryot och sterilisera ägget.
- Återförslut fönsterhålet med klar tejp, enligt beskrivningen i steg 2.8. Återför ägget till inkubatorn för vidare utveckling, håll ägget horisontellt och håll inkubatorns gungfunktion inaktiverad.
- Upprepa steg 3.1.-3.8. för varje ägg.
OBS: De extraembryoniska membrandissektionerna vid E5.5 som beskrivs ovan kommer att möjliggöra åtkomst till embryot genom E7, vilket är när sår kan utföras 8,9. Vid E8 börjar den fortsatta tillväxten av CAM-vävnaden att täcka embryonets kranialregion, vilket utesluter ytterligare tillgång till hornhinnan. Om man vill utföra sår i äldre E8-E9 hornhinnor är det möjligt att omplacera den växande CAM ventralt i förhållande till embryot (Steg 3.10.). Om man vill såra vid E7, Steg 3.10. är inte nödvändigt att utföra och man kan gå vidare till steg 4, hornhinnesår. - Ta bort ett E7-ägg från inkubatorn vars extraembryoniska membran tidigare dissekerades vid E5.5 (steg 3.1.-3.8.). Ta tag i med steriliserade tångar alla tillgängliga amnionmembranvävnader som smälts samman med CAM och dra försiktigt bort amnionmembranet från embryots kranialregion i ventral riktning med avseende på embryot.
OBS: Eftersom det amnioniska membranet som förskjuts bort från embryot smälts samman med CAM, kommer den växande och mycket vaskulära CAM att följa de amniongripande tångarna och röra sig bort från kranialområdet. Upprepa detta steg dagligen för att kontinuerligt förskjuta CAM bort från embryot tills embryot är i önskad ålder för sår.
4. Sår i hornhinnan
- Få ett ägg från inkubatorn för sårning vid önskad embryonal ålder, E7-E9. Exponera embryot genom att klippa tejpen bort från fönstret med steriliserad dissekeringssax. Tillsätt några droppar Ringers lösning som innehåller penicillin / streptomycinantibiotika för att återfukta embryot och sterilisera ägget.
- Använd en mikrodissekerande kniv för att göra ett snitt som sträcker sig över hornhinnans hornhinna i höger öga (på grund av hur embryot ligger i ägget är det vänstra ögat inte tillgängligt men kan fungera som en icke-sårad kontroll), vilket är parallellt med och i linje med koroidsprickan (figur 1). Det första snittet kommer att korsa hornhinneepitelet.
- Använd den mikrodissekerande kniven för att återigen snöra hornhinnan på samma plats som det första snittet 2x mer (t.ex. tre snitt totalt, med snitt 2 och snitt 3 som förekommer tillsammans med samma position i hornhinnan som snitt 1)11. Den andra lacerationen kommer att korsa källarmembranet, och den tredje kommer att tränga in i den främre stroma.
OBS: Om embryot har lagt sig under den dissekerade CAM kan man använda steriliserade böjda iristångar för att försiktigt flytta huvudet ut under CAM. Placera de böjda iristångarna under huvudet och få kontakt med vänster sida av huvudet. Vagga hela huvudet ovanpå slutna böjda iristångar och lyft försiktigt huvudet runt och över CAM. För att hjälpa till med livskraften, använd en liknande teknik med de böjda iristångarna för att stoppa tillbaka embryot under CAM efter operationen för att främja korrekt tillväxt av CAM.
- Använd den mikrodissekerande kniven för att återigen snöra hornhinnan på samma plats som det första snittet 2x mer (t.ex. tre snitt totalt, med snitt 2 och snitt 3 som förekommer tillsammans med samma position i hornhinnan som snitt 1)11. Den andra lacerationen kommer att korsa källarmembranet, och den tredje kommer att tränga in i den främre stroma.
- Tillsätt 3-4 droppar Ringers lösning som innehåller penicillin / streptomycinantibiotika för att hydrera embryot och sterilisera ägget.
- Återförslut fönsterhålet med klart tejp och återgå till inkubatorn och lämna ägget horisontellt. Låt embryot utvecklas och hornhinnesåret läka under en önskad period (t.ex. 0,5-11 dagar) och avliva sedan embryot humant genom halshuggning.
- Använd böjda iristångar för att skörda ögat från ett avlivat embryo som flyter i en petriskål av Ringers saltlösning genom att försiktigt ta tag i ögat på dess bakre sida, där ögat och ansiktsvävnaden möts, och försiktigt lyfta hela ögat bort och fritt från ansiktsvävnaden.
- Använd fina pincett för att sticka ett litet hål (3-5 cm) på baksidan av hela ögat och fixera hela ögat i 4% paraformaldehyd vid 4 °C över natten med mild omrörning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den tidigare dissektion av ACM och CAM vid E5.5 för att exponera kranialregionen hos det utvecklande embryot gjordes en serie lacerationer som sträckte sig över E7 centrala hornhinnan i ovo (figur 1). Ett idealiskt sår för att studera hornhinneregenerering sker efter tre lacerationer, var och en gjord på samma plats av hornhinnan. Den första lacerationen passerar hornhinneepitelet, medan den andra och tredje lacerationen tränger in i det underliggande källarmembranet respektive främre stroma. För att uppnå ett idealiskt sår är det viktigt att använda en vass mikrodissektionskniv (se materialtabell) och applicera rätt mängd tryck när lacerationen görs (figur 2, se idealiskt sår). Att applicera för lite tryck kommer att resultera i ett grunt sår som river hornhinneepitelet utan att tillräckligt tränga in i den främre stroma (figur 2, se grunt sår). Men att applicera för mycket tryck resulterar i att ett sår i full utsträckning tränger in i hela stroma och utsätter den vattenhaltiga humorn för den yttre miljön (Figur 2, se full omfattning sår).
Att utföra rätt snörning snitt ger ett idealiskt sår (figur 2) som initialt förstoras (0-3 dagar efter sårning)8 (figur 3). Det har postulerats att fasen av sårförstoring som uppstår genom att såra E7 kycklingkornor är relaterad till den snabba expansionen av ögonstorlek vid detta embryonala stadium8. Embryonala kycklingögon växer i betydligt snabbare takt från E4 till E10 jämfört med ögontillväxten från E10 till kläckning. Dessa tidiga snabba faser av ögontillväxt tillskrivs förhöjd intraokulärt tryck (IOP) -beroende tillväxt13. Därför är det troligt att den snabba tillväxthastigheten i ögat i kombination med den förhöjda IOP främjar sårindragning under de tidiga faserna av läkningsprocessen (0-3 dagar efter sårbildning), vilket är unikt för den embryonala hornhinnans sårläkningsprogression. Därefter sker återepitelisering och ny vävnadsbildning (4-9 dagar efter sårning) för att slutligen stänga såret på ett ärrfritt sätt 11 dagar eftersårning 8 (figur 3A).
Ytterligare analys av sårdjup och regenerering var möjlig genom färgning av tvärsnitt med en lamininantikropp som markerar det lamininrika källarmembranet och motfärgning av sektionerna med kärnmarkören DAPI, vilket avslöjar sårets omfattning genom hornhinneepitelet8. Nyligen sårade hornhinnor (0 dpw) och de som är tidiga i regenereringsprocessen (3 dpw) visade att såret trängde in i epitelskiktet och källarmembranet, vilket framgår av inbrottsfärgningen av kärnmarkören DAPI i hornhinneepitelet och frånvaron av lamininantikroppsfärgning, vilket markerar det lamininrika källarmembranet mellan hornhinneepitelet och underliggande stroma8 (figur 3B ). Tvärsnitt genom 11 dpw hornhinnor färgade med DAPI och lamininantikropp avslöjade emellertid en helt läkt hornhinna som hade återepiteliserats och innehöll ett kontinuerligt lamininrikt källarmembran på platsen för det regenererade såret8 (figur 3B).
Efter hornhinnesnittet åstadkoms detaljerad karakterisering av sårläkningsprocessen genom att utföra immunhistokemi på snittade, sårade hornhinnevävnader. De extracellulära matrisproteinerna fibronektin och tenascin är associerade med epitel- och keratocytcellmigration till läkning av vuxna hornhinnesår14,15. Spatiotemporal lokalisering av de extracellulära matrisproteinerna, fibronektin och tenascin är uppenbar i det helande såret och befanns vara förhöjd vid tidpunkter motsvarande hornhinnans reepitelisering (5 dagar efter sårning)8 (figur 4). En sådan analys tyder på betydelsen av fibronektin och tenascin för sårstängning och specifikt deras engagemang i epitelcellmigration och överlevnad, i överensstämmelse med sådana funktioner i vuxna hornhinnesår 16,17.
Från och med E8-E9 blir hornhinnan tätt innerverad av trigeminala sensoriska nervfibrer som härrör från en pericorneal nervring och passerar genom den främre stroma när de skjuter ut mot hornhinnans centrum och hornhinneepitelet med E12 18,19,20. Eftersom hornhinnesår i denna modell tillverkas vid E7, strax före nervprojektion i hornhinnan, undersöker denna modell ytterligare hornhinnenerver när de navigerar i en helande hornhinna efter förolämpning. Genom att använda helmonterad immunhistokemi för att spåra hornhinnenerver med anti-β neurala tubulin (Tuj1) antikroppar21, är det uppenbart att nerver tillfälligt hämmas från den helande hornhinnevävnaden som direkt ställer den sårade, centrala hornhinnan (5 dagar efter sårning)8 (figur 5A,B). Trots tidigare hämning innerverar hornhinnenerven så småningom den helt läkta hornhinnevävnaden (11 dagar efter sårning) till liknande densitetsnivåer och i liknande mönster som stadiummatchade, icke-sårade kontroller (E18C) (figur 5C, D).
Slående, helt re-epitelialiserade hornhinnevävnader som har läkt i ett icke-fibrotiskt, ärrlöst sätt visar en fullständig rekapitulation av den normala kollagenvävnadsarkitekturen. Som framgår av andra generationens harmonisk avbildning22,23 är buntar av kollagenfibrer genom varierande djup i det centrala hornhinnans sårområde anordnade ortogonalt, vilket matchar den ursprungliga makrostrukturen hos icke-sårad central hornhinnevävnad9 (Figur 6).
Figur 1: Schematisk över in ovo extraembryoniska membrandissektioner och hornhinnesår. Vid E5.5 exponeras embryots kranialregion genom att dissekera ACM- och CAM-membranen och placera amnion och allantois bort från det utvecklande ögat. Ägg förseglas och inkuberas till E7 när den centrala hornhinnan skadas, med böjda pincett som vagga för embryohuvudet eftersom spetsen på en mikrokirurgisk kniv gör ett snitt i den centrala hornhinnan. Såret är orienterat parallellt med choroidsprickan (asterisk). För att säkerställa att snittets djup når den främre stroma måste tre samtidiga skärningar göras med kniven, var och en i samma relativa position, över varandra. Skalstreck = 1 mm. Siffran är anpassad med tillstånd frånreferenserna 8,11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Variationer i sår som genereras i ovo. (B-D) Bilder tagna av ett in ovo-embryo omedelbart efter lacerationer av varierande grad som sträcker sig över hornhinnans utbredning och är i linje med koroidsprickan (jfr). (B) Efter tre lacerationer där svagt tryck applicerades är ett grunt sår synligt. Pilspetsen markerar en plats i hornhinnan där epitelet har klippts men den främre stroma inte har penetrerats. Pilspetsar betecknar en liten hornhinneregion där den främre stroma har penetrerats. (C) Efter tre lacerationer där en idealisk mängd tryck applicerades är ett idealiskt sår synligt. Pilspetsar betecknar ett sår som spänner över hela hornhinnans utbredning där den främre stroma har penetrerats. (D) Efter tre sår där överdrivet tryck applicerades är ett sår i full utsträckning synligt och den vattenhaltiga humorn har blivit utsatt för den yttre miljön. Förkortningar: tca, temporal ciliär artär; jfr, choroid spricka; CAM, korioallantoiskt membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) Progression av läkning i sårade hornhinnor jämfört med stadiummatchade kontroller visas från tidpunkten för sårning (0 dpw) och 16 h efter sårning (hrpw) till 3-11 dagar efter sårning (dpw). Pilspetsar avgränsar sårets dorsala och ventrala mest gränser, vilket indikerar en period av sårutvidgning (0-3 dpw) följt av progressiv sårstängning (5-11 dpw). (B) Snittade DAPI (blå) - och laminin (röd) -färgade sårade hornhinnor vid 0, 3 och 11 dpw. Parenteser visar omfattningen av den sårade regionen, vilket avslöjar sårutvidgning med 3 dpw och full reparation av den återepiteliserade hornhinnan med E11. Asterisker betecknar hornhinnans läkta region. Skalstrecket är (A) 1 mm, (B) 100 μm. Figuren är anpassad med tillstånd från referens8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Histologisk analys av sårade hornhinnor. Tvärsnitt genom (A) 3 dpw och (B) 5 dpw. DAPI-färgade (blå) sårade hornhinnor avslöjar lokaliseringen av fibronektin (FN, röd) och Tenascin-C (TN-C, grön). Parenteser i (A) och (B) betecknar den sårade regionen. Skalstång: 100 μm. Förkortningar: ep, epitel; st, stroma; sv, endotel. Figuren är anpassad med tillstånd från referens8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A-D) Visualisering av hornhinnenerverna efter anti-β neural tubulin (Tuj1) helmonterad immunfärgning i (B) 5 dpw och (D) 11 dpw hornhinnor, samt (A) stegmatchad E12 (E12C, stegmatchad för 5 dpw) och (C) E18 kontroller (E18C, stegmatchad för 11 dpw). (B) Den brutna linjen i 5 dpw hornhinnan anger sårets omfattning. Det parenteserade området direkt intill såret betecknar hornhinnan som är tillfälligt avvisande för nerver och aktivt genomgår återepitelisering. (B') Optisk skanning genom den helande hornhinnevävnaden direkt intill det öppna såret avslöjar ett sällsynt stromalt nervknippe som sträcker sig in i vävnaden (pil) och epiteliala nervkoppel (pilspets). (C,D) Helt regenererade hornhinnor vid 11 dpw uppvisar liknande innervationsmönster och jämförbara nervtätheter med scenmatchade kontroller. Förkortning: w, sår. Figuren är anpassad med tillstånd från referens8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Kollagen ultrastruktur i läkta embryonala hornhinnor(A) En ansiktsskanning av helt läkta 10 dpw hornhinnor och stegmatchade kontroller med andra generationens harmonisk avbildning (SGH). Skanningsdjupen sträcker sig från 2-66 μm från hornhinnans främre yta (0 μm är den mest främre stroma) och listas till vänster om respektive bild. Indrag för varje bild motsvarar Fast Fourier-transformanalys av det centrala sårområdet för just det skanningsdjupet. (B) Manuellt segmenterade staplar av tvådimensionell Fast Fourier-transformanalys, som representerar kollagenorganisation inom den sårade och stegmatchade kontrollhinnan. Skalstreck = 50 μm. Figuren är anpassad med tillstånd från referens9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kycklingen är ett idealiskt modellsystem för att studera fostrets, ärrlösa hornhinne sårreparation. Till skillnad från däggdjur är kycklingen lättillgänglig under hela utvecklingen med hjälp av i ovo8 eller ex ovo strategier24. Den embryonala kycklinghinnan är mycket större än gnagare hornhinnor, med nästan 50% av kranialvolymen tillägnad ögat25, vilket gör den mycket mottaglig för fysiska manipulationer som sår. Dessutom är kycklingägg lättillgängliga året runt, ofta från lokala gårdar, och kostnadseffektiva, vilket endast kräver en humifierad inkubator för att stödja utvecklingen.
Detta protokoll rapporterar en serie förfaranden som möjliggör embryonal kyckling hornhinna sår. Sår gjorda på den embryonala kycklinghinnan regenererar helt, vilket möjliggör en fullständig rekapitulation av den ursprungliga hornhinnestrukturen utan detekterbar ärrbildning. Denna teknik har gjort den embryonala kycklingen till en viktig djurmodell för att belysa de molekylära och cellulära faktorer som samordnar ärrlös hornhinnesårläkning.
Trots det tydliga löftet som är inneboende i fostrets sårläkningsmodell som beskrivs häri är det värt att notera att det finns tydliga skillnader mellan foster- och vuxen hornhinnesårläkning. Den embryonala hornhinnan uttrycker tillväxtfaktorer och morfogenetiska signaler som tystas eller saknas i vuxna vävnader26. Dessutom uppvisar sårade vuxna hornhinnevävnader fibros och bildar ärrvävnad, sannolikt på grund av ett ökat inflammatoriskt svar medierat av cytokiner och tillväxtfaktorer27, som dämpas eller ännu inte är etablerade i embryonala stadier. Sådana åldersrelaterade skillnader i hornhinnevävnaden kan komplicera ansträngningarna att återställa vuxen sårad vävnad helt. Ändå kommer bestämning av viktiga molekylära faktorer och matrisproteiner som reglerar fostrets ärrlösa sårläkning att bana väg för terapier som främjar en mer återställande läkningsprocess med mindre ärrbildning och bättre rekapitulation av den normala vävnadsarkitekturen.
Sårmetoden som beskrivs här bygger på en teknik som först utvecklades av Spurlin et al.11 för att få tillgång till kycklingembryon i sen fas (t.ex. >E6). Genom att fönstera ägget och dissekera extraembryoniska membran bort från kranialområdet är det embryonala ögat tillgängligt för steg så sent som E7. Som vi tidigare har rapporterat påverkar avlägsnandet och förskjutningen av de amniochorioniska respektive korioallantoiska membranen inte embryonal utveckling11. Exponerade embryon är livskraftiga och är lätt mottagliga för fysisk manipulation. I detta skede har hornhinnan tre distinkta lager (epitel, stroma och endotel), vilket gör den lämplig för sårläkningsstudier efter linjär snitt i den främre stroma. Det bör noteras att på grund av ökande allantois tillväxt över tid, tillgång till ögat så småningom ockluderas vid E8. För att kringgå detta problem, om tillgång till ögon i senare skeden för sår är önskvärt, har vi funnit att åtkomst till ögat kan bibehållas genom E9 genom att utföra daglig manipulation av de extraembryoniska membranen (t.ex. vid E7, E8, etc.), där allantois försiktigt omplaceras bort från kranialområdet för att säkerställa att dess tillväxt sker riktning bort från embryot. Detta gör att hornhinnor kan skadas i dessa senare skeden (t.ex. efter innervation).
Sammantaget är embryoviabilitet och överlevnadsförmåga i denna teknik beroende av flera faktorer, såsom att säkerställa att en steril och hydratiserad äggmiljö upprätthålls samtidigt som man är försiktig så att man inte skadar embryonala blodkärl eller allantois. Hela äggytan bör steriliseras med etanol före fönster för att bibehålla steriliteten. Detta beror på att små äggskalfragment, som ofta är laddade med mikrober, vanligtvis kommer att falla in i ägget under fönsterproceduren. På samma sätt måste alla verktyg som är involverade i fönster, membrandissektioner och tillverkning av hornhinnans snitt sköljas noggrant i etanol och torkas eller flamsteriliseras innan de används. Dessutom bör antibiotika läggas till ägget när embryot utsätts för den yttre miljön. Det är vidare viktigt att embryot behåller korrekt hydrering efter fönster. Stor försiktighet måste vidtas för att säkerställa att fönstret är helt förseglat med tejp och att inga luftspalter kvarstår. Med tanke på vikten av att tejpen förblir helt vidhäftad med äggskalytan och helt tätar hålet, måste äggskalytan som omger hålet rengöras och torkas innan tejpen appliceras. Slutligen är det absolut nödvändigt att inga blodkärl skärs oavsiktligt och att allantois, som lagrar flytande avfall från embryot, inte skadas under dissektion av de extraembryoniska membranen eftersom antingen är dödligt för embryot. Det bör noteras att embryoviabiliteten är högre när mindre tårar till korionen och amnionen görs, även om tåren måste vara tillräckligt stor för att placera de extraembryoniska membranen bort från kranialområdet. Om dessa noggranna steg vidtas under dissektion och avlägsnande av membran från högkvalitativa ägg kan man förvänta sig att nästan alla embryon överlever fönsterproceduren (~ 99%), medan ~ 40% av de exponerade embryona överlever till E9 och ~ 30% till E1211. Enligt vår erfarenhet har sårning av hornhinnorna på E7-E9-membrandissekerade embryon liten inverkan på embryots livskraft, och gott om embryon förblir livskraftiga genom E18, vid vilken tidpunkt hornhinnans sår är helt läkt.
Att uppnå sår som passerar hornhinneepitelet och tränger igenom den främre stroma är viktigt för att producera tillförlitliga och reproducerbara resultat. En högkvalitativ mikrodissekeringskniv är nödvändig så att mycket lite tryck behöver appliceras. Att använda ett par böjda iristångar kan vara till hjälp för att försiktigt vagga huvudet eftersom lacerationen görs med den andra handen. På detta sätt fungerar de krökta iristångarna som en backstop så att hornhinnan förblir stillastående under såringen. Sårets penetration i stroma är variabel, särskilt vid inlärning, men blir mer reproducerbar när forskaren lär sig känslan och utseendet på att bryta hornhinneepitelet. Som man lär sig kan det vara till hjälp att se sårade hornhinnor i tvärsnitt så att djupet av sårpenetrationen i hornhinnans stroma kan bedömas (se figur 3B för ett exempel på en tvärsnitt hornhinna som visar idealiskt sårdjup omedelbart efter hornhinnans laceration).
I kombination med klassiska utvecklingsbiologiska tekniker, såsom vävnadstransplantation och pärlimplantation, eller moderna metoder för genmanipulation, såsom DNA-elektroporering och retroviral infektion, lovar denna djurmodell för hornhinneregenerering att avslöja de molekylära faktorer och cellulära mekanismer som är nödvändiga för att uppnå fullständig återhämtning av hornhinnevävnaden efter skada. Vidare kan denna djurmodell användas för att testa den potentiella användbarheten av exogena terapeutiska föreningar för att öka hornhinneregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen när det gäller informationen som presenteras i detta manuskript.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett konstnärligt och vetenskapligt utvecklingsbidrag genom Illinois Wesleyan University till TS och finansierades delvis av NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A.
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
