Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Konfokal och superupplöst avbildning av polariserad intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner under Drosophila Oogenesis

Published: May 19, 2022 doi: 10.3791/63778
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

Summary

Källarmembranet är viktigt för vävnads- och organmorfogenes under utvecklingen. För att bättre förstå mekanismerna som leder till korrekt placering av denna struktur beskriver det presenterade protokollet metoder för att visualisera och karakterisera intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner i epitelceller med hjälp av konfokal och superupplösningsmikroskopi.

Abstract

Källarmembranet (BM) - ett specialiserat ark av extracellulär matris närvarande vid basalsidan av epitelceller - är avgörande för etablering och underhåll av epitelvävnadsmorfologi och organmorfogenes. Dessutom är BM avgörande för vävnadsmodellering, som fungerar som en signalplattform och ger yttre krafter för att forma vävnader och organ. Trots de många viktiga roller som BM spelar under normal utveckling och patologiska tillstånd, är de biologiska vägarna som styr den intracellulära handeln med BM-innehållande vesiklar och hur basalsekretion leder till polariserad avsättning av BM-proteiner dåligt förstådda. Follikulärt epitel av Drosophila-äggstocken är ett utmärkt modellsystem för att studera den basala avsättningen av BM-membranproteiner, eftersom den producerar och utsöndrar alla huvudkomponenter i BM. Konfokal och superupplösningsavbildning i kombination med bildbehandling i fasta vävnader möjliggör identifiering och karakterisering av cellulära faktorer som är specifikt involverade i intracellulär handel och avsättning av BM-proteiner. Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll för färgning och avbildning av BM-innehållande vesiklar och deponerad BM med användning av endogent märkta proteiner i follikulärt epitel i Drosophila-äggstocken . Detta protokoll kan tillämpas för att ta itu med både kvalitativa och kvantitativa frågor och det utvecklades för att tillgodose screening med hög genomströmning, vilket möjliggör snabb och effektiv identifiering av faktorer som är involverade i polariserad intracellulär handel och utsöndring av vesiklar under epitelvävnadsutveckling.

Introduction

Källarmembranet (BM) är ett tunt ark av skiktad cellanhängande extracellulär matris (ECM) som är kritisk för epitelstruktur och morfogenes1. Den består av ~ 50 proteiner och finns allestädes närvarande under epitel- och endotelcellerna och ensheathing skelett-, slät- och hjärtmuskelceller och adipocyter 1,2,3. De tre huvudkomponenterna i BM vid epitelcellernas basala sida är kollagen IV, perlekan och lamininer. BM ligger till grund för epitelcellerna och ansvarar för många funktioner, inklusive vävnadsseparation och barriär, tillväxt och stöd och cellpolarisering 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Dess roll som signalplattform reglerar morfologin och differentieringen av epitelceller och vävnader under utveckling 3,13,14. Dessutom är felreglering av BM och / eller ett brott mot dess integritet de främsta orsakerna till många patologiska tillstånd, inklusive tumörmetastas 2,15,16. Trots de väsentliga funktioner som utförs av BM under vävnads- och organmorfogenes är komponenterna i de biologiska vägarna som är avsedda för den polariserade intracellulära handeln och utsöndringen av BM-proteiner vagt kända.

För att studera intracellulär handel med BM-innehållande vesiklar och utsöndringen av BM-proteiner genom epitelceller är follikulärt epitel (FE) i Drosophila-äggstocken ett kraftfullt modellsystem (Figur 1). En Drosophila-äggstock består av 16-20 långa, rörliknande strukturer, kallade ovarioler (figur 1A,B)17,18,19. Varje ovariol kan ses som en äggmonteringslinje, med åldersprogressionen för äggkammare (som var och en ger upphov till ett ägg) som börjar vid den främre änden och rör sig bakåt tills det mogna ägget går ut genom äggledaren. Varje äggkammare är inkapslad av FE, ett monolager av somatiska follikelceller (FC), som omger de centrala könscellerna (GCs). FE är starkt polariserad med en distinkt apikal-basal polaritet där den apikala domänen vetter mot könslinjen och BM-proteinerna utsöndras basalt18,19. FC utsöndrar aktivt alla huvudkomponenter i BM, inklusive kollagen IV, perlekan och lamininer20,21. I epitelceller såsom FC produceras BM-komponenterna och kräver en specialiserad polariserad utsöndringsväg för deras avsättning extracellulärt. Till exempel, när det gäller den vanligaste komponenten i BM, Kollagen IV (Coll IV), är detaljerna kring dess polariserade intracellulära handel och utsöndring vaga trots att dess produktion och avsättning är i fokus för många studier. Coll IV översätts i endoplasmatisk retikulum (ER), vilket också är där varje fibril - bestående av tre polypeptider (två α1-kedjor och en α2-kedja) - monteras i en trippelhelix22. Korrekt Coll IV-vikning och funktion kräver ER-chaperoner och enzymer, inklusive lysyl- och prolyl-hydroxylaser såsom Plod och PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Dessa posttranslationella enzymer reglerar ER-sorteringen av Coll IV, eftersom förlusten av var och en gör att Coll IV fångas i basal ER 20,23,24,25,26. Sedan lämnar nyligen syntetiserade Coll IV ER för Golgi i COPII-belagda vesiklar. Lastreceptorn Tango1 hjälper till att förpacka kollagener i stora Golgi-bundna vesiklar som rymmer stora multimera proteiner20,27. När Coll IV har förpackats i intracellulära exocytiska vesiklar utsöndras den specifikt basalt från epitelceller. För att rikta BM-avsättning till basalsidan kräver epitelceller en annan uppsättning faktorer som är specifikt dedikerade till polariserad BM-utsöndring. Med hjälp av FE för Drosophila-äggstocken har några komponenter i denna nya cellulära process karakteriserats, inklusive nukleotidutbytesfaktorerna (GEFs) Crag och Stratum, GTPaserna Rab8 och Rab10, liksom nivåerna av fosfoinositid PI (4,5) P2 och Kinesin 1 och 3 motorproteiner 20,28,29,30,31 . Dessa komponenter är avgörande för att säkerställa polariserad fördelning av BM-proteiner.

För att övervaka den intracellulära lokaliseringen av BM-proteiner i FE kan endogent märkta källarmembranproteiner (proteinfällor), såsom Viking-GFP (Vkg-GFP eller α2 Coll IV-GFP) och Perlecan-GFP (Pcan-GFP) användas32,33. Dessa proteinfälllinjer har visat sig exakt återspegla den endogena fördelningen av BM-proteiner och möjliggör mer känslig upptäckt av vesikulär handel28,30. Komponenterna som är involverade i den polariserade avsättningen av BM i FE karakteriserades först med hjälp av proteinfälllinjer för Vkg-GFP och Pcan-GFP 20,28,29,30. Proteinfällor kan användas i olika genetiska bakgrunder, inklusive mutanter och Gal4-linjer 34. Dessutom kan proteinfällor användas i kombination med fluorescerande färgämnen och / eller fluorescensimmunfärgning, vilket möjliggör exakt karakterisering av lokaliseringen av BM-proteiner vid jämförelse av vildtyp och mutantförhållanden35.

För att exakt och effektivt bedöma distribution och lokalisering av BM-proteininnehållande vesiklar utgör konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) och superupplösande bildtekniker en betydande fördel för andra avbildningsmetoder. Dessa tillvägagångssätt kopplar samman högupplöst avbildning med relativ användarvänlighet. CLSM är en mikroskopiteknik som möjliggör en förbättrad optisk upplösning genom att skanna provet med en laser på ett rasterskanningssätt med galvanometrar. Pinhålets bländare är en kärnkomponent i ett konfokalmikroskop. Genom att blockera de ofokuserade signalerna som kommer uppifrån eller under fokalplanet resulterar hålöppningen i en mycket överlägsen upplösning i z-axeln36. Detta gör det också möjligt att få en serie bilder i z-planet, kallad en z-stack, motsvarande en serie optiska sektioner. z-stacks skapar därefter en 3D-bild av exemplaret, via 3D-rekonstruktion, med hjälp av bildprogramvara. Konventionella epifluorescensmikroskop (widefield), till skillnad från konfokalmikroskop, tillåter ljus utanför fokus att bidra till bildkvalitet, minska bildupplösningen ochkontrasten 36,37. Detta gör epifluorescensmikroskopi till en mindre attraktiv kandidat när man studerar proteinlokalisering eller samlokalisering.

Även om CLSM är ett lämpligt tillvägagångssätt för olika applikationer, inklusive avbildning och karakterisering av intracellulär handel med BM-proteiner, utgör det fortfarande ett problem när avbildningsprover under Abbes diffraktionsgräns för ljus (200-250 nm). Vid avbildning av sådana prover kan konfokalmikroskopi, särskilt vid användning av ett oljemål, resultera i hög upplösning. Superupplösningstekniker överskrider dock gränsen för konfokalmikroskopi. Det finns olika tillvägagångssätt för att uppnå superupplösningsmikroskopi, var och en med specifika upplösningsgränser, och var och en lämplig för olika analyser. Dessa tillvägagångssätt inkluderar fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), stimulerad emissionsutarmningsmikroskopi (STED), strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) och Airyscan (superupplösning) mikroskopi 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Även om Airyscan har en grövre upplösning än PALM/STORM, STED och SIM, kan den fortfarande uppnå en upplösning på upp till ~120 nm (ungefär dubbelt så hög upplösning som CLSM). Dessutom har denna superupplösande mikroskopimetod visat sig ha en fördel jämfört med SIM och andra superupplösningstekniker vid avbildning av tjocka prover och prover med ett lågt signal-brusförhållande47,48.

Airyscan är en relativt ny superupplöst konfokalmikroskopiteknik46. Till skillnad från traditionella CLSM, som använder pinhåls- och enpunktsdetektorer för att avvisa ljus som inte är i fokus, använder denna superupplösningsmetod en 32-kanals galliumarsenidfosfid (GaAsP) fotomultiplikatorrörsdetektor som samlar allt ljus vid varje skanningsposition45. Var och en av de 32 detektorerna fungerar som ett litet hål, vilket minskar hålstorleken från den traditionella 1.0 Airy Unit (A.U.) till en förbättrad 0.2 A.U., vilket möjliggör en ännu högre upplösning och signal-brusförhållande, samtidigt som effektiviteten hos en 1.25 A.U. diameter45 bibehålls. Dessutom resulterar den linjära dekonvolutionen som används av Airyscan i upp till 2x ökning av upplösning45. Med hänsyn till detta är CLSM, och specifikt superupplösningsmikroskopi, väl lämpade för att studera BM-proteiner och proteiner som reglerar den basala avsättningen av BM-proteiner, eftersom de kan producera mycket högupplösta bilder för lokaliserings- och samlokaliseringsstudier, vilket ger nya insikter i de rumsliga, tidsmässiga och molekylära händelser som styr dessa processer.

Ett alternativt tillvägagångssätt för konfokalmikroskopi som kan användas för att utföra lokaliseringsexperiment är bilddekonvolution. Eftersom widefield-mikroskopi tillåter out-of-focus-ljus att nå detektorerna, kan matematiska och beräkningsmässiga dekonvolutionsalgoritmer tillämpas för att ta bort eller omtilldela ljus utanför fokus från bilder som erhållits genom widefield-mikroskopi, vilket förbättrar upplösningen och kontrasten i bilden49. Dekonvolutionsalgoritmer kan också tillämpas på konfokala bilder för att ytterligare öka upplösningen och kontrasten, vilket ger slutliga bilder nästan jämförbara med superupplösningsmikroskopi50. Airyscan använder weiner-filterbaserad dekonvolution tillsammans med Sheppards pixelomplacering, vilket resulterar i en mycket förbättrad rumslig upplösning och signal-brusförhållande. Jämfört med konfokalmikroskopi observeras en ökning med 2x i upplösning i alla tre rumsliga dimensioner (120 nm i x och y och 350 nm i z) när man använder denna superupplösande mikroskopiteknik45,51.

Detta manuskript ger detaljerade och optimerade protokoll för att fläcka, förvärva och visualisera intracellulär handel och avsättning av BM-proteiner med hjälp av FE för Drosophila-äggstocken som ett modellsystem i kombination med konfokal och superupplösande mikroskopi. Drosophila-linjer som uttrycker endogent märkta källarmembranproteiner, t.ex. Vkg-GFP och Pcan-GFP, är effektiva och exakta verktyg för att visualisera BM-proteinhandel och utsöndring. Dessutom kan de enkelt användas i olika genetiska bakgrunder, inklusive mutant- och Gal4 / UAS-linjer 34. Även om endogent märkta källarmembranproteiner rekommenderas, är användningen av antikroppar mot specifika BM-proteiner också kompatibel med de beskrivna protokollen. Dessa protokoll är särskilt användbara för forskare som är intresserade av att studera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i intakt epitelvävnad med hjälp av konfokal och superupplösningsavbildning. Dessutom gör förmågan att kombinera epitelvävnadsanalys med de expansiva verktygen för Drosophila-genetik detta tillvägagångssätt särskilt kraftfullt. Slutligen kan dessa protokoll enkelt anpassas för att studera vesikulär handel och sortering av andra proteiner av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Flugberedning för äggstocksdissektioner

  1. Lägg 10-15 Drosophila melanogaster honflugor (1-2 dagar gamla) av önskad genotyp i en smal injektionsflaska innehållande ~ 8 ml Drosophila flugmedium strös med en liten mängd granulerad bagerijäst 2-3 dagar före dissektion vid 25 ° C. Att lägga till några hanar i injektionsflaskan kan öka äggkammarens utbyte. Se dock till att det totala antalet flugor inte överstiger 20 eftersom detta kan påverka äggstocksutvecklingen negativt.
    OBS: Beskrivning av Drosophila män och kvinnor, och användbara tips och råd för forskare utan tidigare Drosophila erfarenhet finns i de citerade artiklarna34,52. Att tillsätta jäst kommer att stimulera äggproduktionen och generera äggstockar med olika steg representerade. Dessutom kommer det också att göda äggstockarna och göra dem lättare att skära ut. Våtjäst kan också användas istället för granulerad jäst, men för svagare bestånd kan flugorna fastna och dö.

2. Äggstocksdissektion och fixering

OBS: För ytterligare resurser om dissektion och färgning av äggstockar riktas läsarna till de citerade protokollen 53,54,55.

  1. På dissektionsdagen, förbered ny fixeringslösning med en slutlig koncentration av 4% paraformaldehyd (PFA) genom att späda PFA-stamlösningen i 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS).
  2. Bedöva flugorna med CO2 och placera dem på en flugkudde. Håll flugorna bedövade tills dissektion. Tänk på flugor som sövts ordentligt när deras rörelser har upphört, vilket vanligtvis tar 10-20 s.
    OBS: Även om användning av CO2 rekommenderas som ett säkrare och snabbare alternativ, kan flugor bedövas med is.
  3. Placera en glaskonkav bild eller färgningsskål med grunda fördjupningsbrunnar under ett dissekerande mikroskop och fyll brunnarna med 1x PBS.
  4. Ta tag i en kvinnlig fluga vid nedre bröstkorgen med ett par pincett. Se till att flugornas kön genom frånvaro av manliga könsorgan i den bakre änden av buken och frånvaron av könskammar på frambenen som en sekundär egenskap52. Dissekera flugor individuellt med ett annat par pincett (steg 2.5) medan du sänker dem i brunnar fyllda med 1x PBS under dissekeringsmikroskopet (20x förstoring rekommenderas).
  5. När du tittar genom dissekeringsmikroskopet, använd ett annat par tångar för att dra i den bakre delen av flugbuken, vilket gör de inre organen (t.ex. äggstockar, tarm) synliga.
  6. Pressa försiktigt den främre delen av flugbuken (som med ett rör tandkräm) för att tvinga äggstockarna ut ur buken. Denna metod bör hålla äggstockarna intakta. Lossa och ta försiktigt bort andra organ och flyga skräp.
  7. Använd pincett eller dissekerande nålar, separera äggstockens ovarioler samtidigt som den övergripande äggstocksstrukturen hålls intakt. Syftet med detta steg är att bryta muskelmanteln som täcker äggstockarna och möjliggöra en mer effektiv och homogen färgning.
  8. Överför snabbt äggstockarna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 1x PBS och håll röret på is tills alla flugor dissekeras. Förvara inte röret på is om mikrotubuli eller mikrofilament (eller vesiklar som trafikeras av dessa cytoskelettkomponenter) ska visualiseras eftersom detta kan orsaka depolymerisering.
  9. När alla äggstockar har dissekerats och överförts till ett mikrocentrifugrör, låt dem sjunka till botten av röret och ta bort alla utom ~ 50 μL av PBS. Tillsätt 1 ml 4% PFA och placera på en mutterplattformsvippa i 15 minuter. Det är viktigt att kontrollera om äggstockarna rör sig fram och tillbaka i fixeringslösningen för att möjliggöra korrekt fixering eftersom ofullständig fixering kan leda till färgnings- och avbildningsproblem.
    OBS: Mutterns hastighet är inte avgörande. Medan vissa nutatorer har en hastighetskontroll, kommer andra med en förinställd hastighet. Den förinställda hastigheten är tillräcklig, och om den är justerbar, ställ in på 40-50 rpm.
  10. Ta bort fixeringslösningen (som i steg 2.9) och utför sedan två snabbtvättar med 1 ml 1x PBS innehållande 0,1% Triton-X 100 (1x PBST), genom att försiktigt invertera mikrofugerören 5-6 gånger. Fortsätt sedan med fyra 10-15 min tvättar (lång tvätt) med 1 ml 1x PBST (40-60 min totalt).
    OBS: Det rekommenderas att använda 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 för tvättar eftersom en ökning av andelen tvättmedel kan leda till GFP-denaturering, vilket leder till minskad fluorescens och detektion av GFP-märkta BM-proteiner.
  11. För färgfärgning, t.ex. DNA- och F-aktinfärgning, fortsätt till steg 3. För immunfärgning, fortsätt till steg 4. Äggstockarna kan förvaras i 1x PBST vid 4 °C i upp till 24 timmar innan de fortsätter.

3. Standard DNA / F-aktinfärgning

  1. Efter fixering och tvättning, ta bort PBST. Tillsätt 500 μL DNA- och F-Aktinfärgningslösning. För att bereda DNA/F-Actin-lösningen, blanda Hoechst (DNA-fläck; 1:1000 utspädning av 1 mg/ml stamlösning) och fluoroformärkt falloidin (F-aktinfläck; 1:500 utspädning för Alexa Fluor 546 eller 1:100 utspädning för Alexa Fluor 647, var och en av 66 μM stamlösning) i 500 μL PBST.
  2. Täck rören med aluminiumfolie för att hålla äggstockarna och färgämnena i mörkret för att bibehålla fluorescensen för effektiv avbildning och inkubera på en nötplattformsvippa i 15 minuter.
  3. Efter inkubation, ta bort DNA / F-Actin-lösningen (som i steg 2.9). Utför två snabbtvättar och tre långa (10-15 min) tvättar i 1x PBST enligt beskrivningen i steg 2.10. Fortsätt till montering enligt beskrivningen i steg 5.

4. Fluorescensimmunfärgning

OBS: Detta är ett standard immunfärgningsprotokoll för fluorescerande avbildning och är kompatibelt med de flesta primära antikroppar.

  1. Blockering och primär antikroppsimmunfärgning (dag 1)
    1. Efter fixering och tvättning, ta bort PBST enligt beskrivningen i steg 2.9. Tillsätt 1 ml blockeringslösning (PBS + 5% BSA) och blockera äggstockarna på en mutterplattformsvippa i minst 1 timme.
      OBS: Förutom BSA kan fetalt bovint serum (FBS) eller normalt getserum (NGS) tillsättas till blockeringslösningen. Alternativt kan äggstockarna blockeras över natten på en nutating plattformsvippa vid 4 °C.
    2. Avlägsna blockerande lösning enligt steg 2.9 och tillsätt 300 μl primär antikroppslösning innehållande primära antikroppar utspädda vid lämpliga koncentrationer (specifika för den använda antikroppen) i den blockerande lösningen. Inkubera över natten på en nutating plattformsvippa vid 4 °C. Nästa dag, ta bort den primära antikroppslösningen och fortsätt till sekundär antikroppsimmunfärgning.
      OBS: Vissa primära antikroppar kan sparas och återanvändas. I vissa fall kan återanvända primära antikroppar minska bakgrundsfärgning, vilket resulterar i bättre avbildning. Återanvändning bör dock testas för varje antikropp för att säkerställa effektivitet.
  2. Sekundär antikroppsimmunfärgning (dag 2)
    1. Efter att ha tagit bort den primära antikroppslösningen, utför två snabbtvättar och fyra långa (10-15 min) tvättar som i steg 2.10. Noggrant utförda repetitiva tvättar med färsk 1x PBST kommer att minska ospecifik bakgrund och leda till optimal avbildning.
    2. Ta bort PBST som i steg 2.9 och tillsätt 500 μL sekundär antikroppslösning innehållande fluorescerande sekundära antikroppar som kommer att detektera de primära antikropparna som används. Skydda röret från ljus genom att täcka det i aluminiumfolie från och med nu för optimal bevarande av fluorescens, vilket är avgörande för bildförvärv och analys.
      OBS: Den sekundära antikroppslösningen bör innehålla sekundära antikroppar konjugerade med fluoroforer som inte överlappar med endogent märkta proteiner. Om du till exempel använder GFP-märkta proteiner rekommenderas användning av Alexa Fluor sekundära antikroppar vid röda eller långröda våglängder (t.ex. 546, 568 eller 647 nm). Fluorescerande färgämnen, såsom Hoechst och Alexa Fluor 546 eller 647 konjugerat falloidin, kan tillsättas till sekundärlösningen. Dessa fläckar kan vara till hjälp för att markera den övergripande cellstrukturen (dvs kärnor och F-Actin). Se steg 3.1 för koncentrationerna.
    3. Inkubera äggstockarna i den sekundära antikroppslösningen på en mutterplattformsvippa i 2 timmar vid rumstemperatur. Utför två snabbtvättar och fyra långa (10-15 min) tvättar i 1x PBST som i steg 2.10. Fortsätt till montering som i steg 5.

5. Montering av färgade äggstockar

OBS: Denna metod fungerar mycket bra om äggstockarna är välutvecklade och rikliga. Noggrann montering av äggstockarna på bilden är avgörande för optimal avbildning.

  1. Efter den sista tvätten, använd en p1000-pipett för att försiktigt pipettera äggstockarna upp och ner i röret för att separera äggkamrarna. Låt äggkamrarna sjunka till botten genom att hålla röret i upprätt läge i 5-10 minuter. Noggrann separering av enskilda äggkammare är avgörande för att uppnå optimal bildförvärv.
  2. Ta bort PBST med en Pasteur-pipett och lämna ~50 μL. Ta bort så mycket av den återstående PBST som möjligt med en p200-pipett. Tillsätt två droppar monteringsmedium, tillräckligt för att sprida jämnt på en 22 mm x 22 mm täckglas. Äggstockarna kan förvaras i monteringsmedium i mikrocentrifugrör vid 4 °C i upp till 1 månad före montering.
    OBS: Flera olika monteringsmedier finns tillgängliga kommersiellt; Användning av hårdinställningsmonter, såsom Aqua-Poly/Mount eller ProLong Glass Antifade Mountant, rekommenderas för att uppnå optimala bildförhållanden. Användningen av glycerol som monteringsmedium avråds eftersom det kan leda till dåliga avbildningsförhållanden (t.ex. fluoroforinstabilitet). För monteringsmedia som inte polymeriseras, försegla täckglaset med ett täckglas tätningsmedel / nagellack för att säkra det på plats.
  3. Märk en glasskiva och torka av den med mjukt, dammfritt papper för att ta bort damm och fingeravtryck. Klipp av änden på en p200-pipettspets för att möjliggöra enkel överföring av det viskösa monteringsmediet till bilden från mikrocentrifugröret. Överför sedan långsamt alla äggkamrar i monteringsmediet till glasskivan, så att du inte skapar bubblor.
  4. Under ett dissekeringsmikroskop sprider du försiktigt ut monteringsmediet och separerade äggkamrarna med en ny p200-spets eller pincett för att täcka ett område som är ungefär lika stort som täckglaset.
  5. Använd pincett och placera försiktigt täckglaset (rengjort med dammfritt papper) på äggkamrarna i en vinkel för att undvika bubblor.
  6. Förvara bilden vid rumstemperatur på en plan yta i mörkret i 2 dagar för att polymerisera. När monteringsmediet har härdat kan bilden förvaras vid 4 °C i mörker i några veckor för avbildning.
    OBS: Det är viktigt för hårdinställningsmonteringsmedium att polymerisera före avbildning. Om mediet ännu inte har polymeriserats kommer äggstockarna att flyta under täckglaset, vilket påverkar bildförvärvet. Dessutom uppnås det optimala reflekterande indexet för monteringsmedia först efter att det har ställts in helt (se tillverkarens information för detaljer).
  7. Alternativ monteringsmetod: Denna metod rekommenderas för att minska vävnadsförlusten om äggstockarna inte är rikliga. I denna metod (som beskrivs nedan), separera ovariolerna och äggkamrarna på bilden under montering, istället för att separera dem i ett mikrocentrifugrör genom pipettering enligt beskrivningen i steg 5.1.
    1. Efter den sista tvätten, ta bort alla utom ~ 100 μL av tvättlösningen. Använd en Pasteur-pipett eller p1000-pipett och överför de intakta äggstockarna i PBS till bilden. Använd en p200-pipett och ta försiktigt bort så mycket PBST från bilden som möjligt. Använd ett dammfritt papper för att torka bort PBST, om det behövs. Rör inte äggstockarna.
    2. Tillsätt två droppar monteringsmedia. Separera försiktigt ovariolerna och äggkamrarna med pincett eller dissekeringsnålar. Ta bort och kassera främmande vävnad och sprid sedan ut äggkamrarna och ovariolerna i monteringsmediet. Fortsätt till steg 5.5-5.6.

6. Konfokal bildförvärv

OBS: Detta avsnitt innehåller nyckelparametrar för att uppnå optimal bildinsamling med hjälp av något konfokalmikroskop (figur 2).

  1. Ställ in mikroskopet och leta reda på provet enligt beskrivningen nedan.
    1. Innan avbildning är det viktigt att lokalisera intresseområdet (ROI) med hjälp av okularet i fluorescensmikroskopet. Använd ett mål med låg förstoring (20x) eller målet som ska användas för bildinsamling (dvs. 40x eller 63x). Välj en äggkammare att avbilda.
      Obs: För bildinsamling rekommenderas att använda mål med hög förstoring som 40x eller 63x (se 6.2.1).
    2. När avkastningen har valts fortsätter du till bildförvärv; Fortsätt till steg 6.2 för konfokal avbildning och steg 7 för avbildning med superupplösning.
  2. Välj nyckelparametrar för optimal bildinsamling enligt beskrivningen nedan (exempel på nyckelparametrar för de representativa bilderna ges i tabell 1).
    1. Välja ett mål: För konfokal bildförvärv av intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i FE, använd ett 40x eller 63x mål.
      OBS: För att uppnå bästa möjliga upplösning rekommenderas starkt användning av Plan-Apochromat-mål, med hög numerisk bländare (NA) som ger den högsta akromatiska korrigeringen.
    2. Välja lasrar för varje kanal /spår: För GFP, använd laser 488 nm; för DAPI eller Hoechst, använd laser 405 nm; för Alexa Fluor 546 eller 568, använd laser 561 nm; och för Alexa Fluor 647, använd laser 640 nm.
      OBS: Varje laserval kommer att resultera i en annan kanal / spårbildning. Här hänvisar termen kanal till bilden som bildas av den inspelade intensitetsfördelningen för exciterade fluoroforer för den valda avkastningen vid den specifika våglängden för varje kanal.
    3. Pinhole-inställning: För att minska ljuset som inte är i fokus under bildinsamlingen, ställ in pinhålet för varje kanal på 1 AU.
    4. Inställningar för laserintensitet och detektorförstärkning: För att finjustera bildkänsligheten använder du både detektorns huvudförstärkning och lasereffekt. För att korrekt ställa in bildkänsligheten rekommenderas en intervallindikator. Ställ in både huvudförstärkningen och laserkraften så att de har en korrekt känslighet där strukturerna av intresse (t.ex. BM-innehållande vesiklar) är tydligt synliga samtidigt som detektormättnad undviks.
      OBS: För att undvika fotoblekning, använd den minimala lasereffekt som krävs. Det rekommenderas att öka detektorförstärkningen först när du använder lägsta möjliga lasereffekt. Om en ökning av detektorförstärkningen inte kan uppnå önskad intensitet, öka sedan lasereffekten. Lasereffektintensitet mellan 0,5% -1,2% rekommenderas.
    5. Ramstorlek: det rekommenderas att använda den optimala bildstorleken som bestäms av förvärvsprogramvaran. För de flesta applikationer, använd en maximal upplösning på 1024 x 1024. Högre upplösning kommer att öka förvärvstiden avsevärt.
    6. Skanningshastighet: Använd en skanningshastighet mellan 6-9, vilket är säkert för de flesta prover. Om provet är bullrigt använder du en långsammare skanningshastighet för att förbättra signal-brusförhållandena. Låga skanningshastigheter ökar dock fotobleknings- och förvärvstiden.
    7. Medelintensitetsmedelvärde: För att förbättra bildkvaliteten använder du medelintensitetsmedelvärde via successiva skanningar med identiska inställningar. I de flesta fall använder du ett genomsnitt på två för att förbättra signal-brusförhållandena utan att fotoblechera provet.
    8. Zooma: Justera skanningsområdet med zoomfunktionen. Använd en zoom mellan 2x-4x med både 40x och 63x mål som det mest effektiva värdet för att tydligt visualisera BM-innehållande vesiklar i FE. Välj noggrant den minimala avkastningen för att minska förvärvstiden.
  3. För att skaffa en z-stack med Zeiss Zen-programvaran, använd följande Z-sektioneringsparametrar och ställ in dem enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Vesiklar och andra intracellulära strukturer som innehåller BM-proteiner är 3-dimensionella (3D) strukturer. Att skaffa en z-stack genom FE kommer att förbättra bildkvaliteten och upplösningen avsevärt. Vanligtvis är ett intervall som spänner över vävnadens tjocklek / djup tillräckligt för att effektivt visualisera intracellulär lokalisering. För optimal 3D-rekonstruktion rekommenderas att använda det optimala intervallet som bestäms av programvaran. För 40x- och 63x-mål, undvik intervall högre än 0,5 μm mellan varje z-sektion för att möjliggöra optimal 3D-rekonstruktion.
    1. Klicka på kryssrutan z-Stack i huvudområdet under fliken Förvärv . Välj skanningsläget Alla spår per segment för z-stacken. Detta resulterar i en ändring av kanalspåren för varje z-positionssegment.
    2. Välj önskad kanal för att observera provet och klicka på Live för att starta en live-skanning. Användning av den kanal som behövs för att detektera det GFP-märkta BM-proteinet rekommenderas.
    3. Ange ett intervall för z-stacken enligt beskrivningen. Använd finjusteringsknappen på mikroskopet, hitta z-platsen för ena änden av provet och klicka på Set First. På samma sätt hittar du z-platsen för den andra änden av provet och klickar på Ställ in senast.
    4. För varje plats i z-stacken klickar du på varje kanal separat med den valda intervallindikatorn och justerar laserns intensitet och huvudförstärkningen efter behov, enligt beskrivningen i steg 6.2.4.
    5. Ställ in intervallet för z-stacken för att tilldela stegstorleken enligt rekommendationerna i ANMÄRKNING nedan steg 6.3. Klicka på Starta experiment för att påbörja z-stack förvärv.

7. Bildförvärv med superupplösning

  1. Välj ett Airyscan-kompatibelt mål. För att visualisera den intracellulära lokaliseringen av BM-protein är användningen av ett 63x oljemål optimalt (figur 3). Ställ in målet på 63x och placera försiktigt en droppe nedsänkningsolja på linsen. Placera bilden på målet med täckglaset mot målet för att hitta provet.
  2. Välj en konfiguration med lämpliga inställningar för fluoroforen till bilden enligt beskrivningen nedan.
    1. Klicka på knappen Smart Setup på fliken Förvärv för att konfigurera ett nytt experiment. Välj Airyscan (superupplösning); När detta väljs krävs ytterligare ett val mellan Upplösning (Airyscan SR), SNR/känslighet (Airyscan Confocal) och Hastighet (Multiplex SR-2Y). För fast vävnad väljer du Upplösning eftersom det resulterar i det bästa förvärvet.
    2. Klicka på + i rutan Konfigurera experimentet för att lägga till spår/kanaler. Välj spåren för specifika färgämnen från Färgdatabasen. För ett flerkanaligt experiment lägger du till varje spår efter behov genom att välja lämpliga färgämnen.
    3. När alla spår har lagts till väljer du ett av experimentförslagen från programvaran. För detta experiment, använd Bästa signal, eftersom även om hastigheten blir lite långsammare jämfört med det smartaste (Linje) förslaget, kommer det att skapa de bästa hårdvaruinställningarna för varje färgämne, vilket resulterar i maximal signalförstärkning och minimal emission överhörning. När experimentet har ställts in och lästs in visas det i fönstret Imaging Setup på fliken Förvärv.
    4. När en smart installation har valts väljs våglängdsområdet för detektorn GaAsP-PMT automatiskt. Justera intervallet genom att flytta rullningslisten längst ned för att öka eller minska intervallet eller helt flytta intervallet till ett annat område efter behov. Använd detta för att se till att intervallen för två olika kanaler inte överlappar varandra för att undvika överhörning. Spara konfigurationen för återanvändning i framtiden.
  3. När konfigurationen är inställd fortsätter du med att justera zoom- och skanningsområdet som i steg 6.2.8. Optimera skanningsområdet för att fokusera på det intressanta området för att minska skanningstiden och lagringsutrymmet. Fortsätt till att skaffa bilder.
  4. För varje enskild kanal väljer du ett spår under Kanal och klickar på Live. Justera huvudförstärkningen och lasereffekten med hjälp av intervallindikatorverktyget enligt beskrivningen i steg 6.2.4 och följ alla riktlinjer som beskrivs för att undvika mättade pixlar. Bekräfta att den sexkantiga detektorvyn är centrerad och justerad genom att klicka på Airyscan Detector View-knappen . I de flesta fall centreras och justeras den sexkantiga detektorvyn automatiskt. Upprepa för ytterligare kanaler.
  5. I växlingsfönstret Förvärvsläge, under Bildstorlek, klickar du på SR (superupplösningsbegränsat pixelantal) för att maximera detektorns funktioner. Detta justerar ramstorleken automatiskt.
  6. Håll medelvärdet till Ingen eftersom det vanligtvis inte är nödvändigt, och detta kommer att minska skanningstiden. I vissa fall kan ett genomsnitt på 2x förbättra signal-brusförhållandet.
  7. Samla in rådata med 8-bitars datadjup. Klicka på Snap för att få en bild. För att skaffa en z-stack, följ steg 6.3.
  8. Utför bildbehandling enligt beskrivningen nedan. Detta ger en 16-bitars bild.
    1. När bilden eller z-stacken har erhållits klickar du på bearbetningsmetoden > och väljer Airyscan Processing.
    2. Utför autofilter till att börja med och utför ytterligare manuell bearbetning genom att ändra SR-värdet för att få bästa resultat för provet. När det optimala SR-värdet har fastställts klickar du på Apply för att generera en bearbetad bild. När det gäller z-stack-bilder, bearbeta antingen som ett z-segment (Aktuell bild [2D]) eller som hela z-stacken genom att klicka på rutan 3D-bearbetning .

8. Bildbehandling och dataanalys (ortogonal projektion, 3D-rekonstruktion och intensitetsprofil)

OBS: För den här metoden beskrivs stegen som används för att generera ortogonala projektioner, 3D-rekonstruktioner och intensitetsprofiler för Zen-programvaran (se materialtabell). Liknande dataanalyser kan också utföras med ImageJ-programvara56.

  1. Utför ortogonal projektion enligt beskrivningen nedan (figur 4).
    1. När en z-stack har erhållits med hjälp av konfokal eller superupplösningsmikroskopi, generera en ortogonal projektion för att se blåsorna i cellens z-axel i en 2D-vy (jämfört med 3D-rekonstruktion). För att göra detta, klicka på Bearbetning > metod och välj Ortogonal projektion.
    2. Under parametrar väljer du det projektionsplan som krävs. För en projektion av z-axeln (z-stacken) väljer du frontplanet (XY ). Under Metod väljer du Maximalt för att resultera i projektion av högsta kvalitet.
    3. Därefter bestämmer du projektionens tjocklek genom att välja startposition (start z-skiva) och bestämmer tjockleken (totalt antal z-skivor) i projektionen. Det är idealiskt att välja tjockleken lika med den för en cell i z-axeln.
    4. När parametrarna har ställts in klickar du på Apply för att skapa projektionen av z-stacken på ett XY-plan sätt.
      OBS: När du skapar ortogonala projektioner av flera z-stackar för att jämföra mängden av ett visst objekt av intresse är det absolut nödvändigt att hålla projektionens tjocklek densamma (eller så nära som möjligt) för datanoggrannhet.
  2. Utför 3D-rekonstruktion enligt beskrivningen nedan (figur 5).
    1. Skapa 3D-rekonstruktioner av z-stackar för att observera lokalisering och form av strukturer. Gör detta för z-stackar som förvärvats med hjälp av konfokala och superupplösningsmetoder. Bearbeta z-stackar med superupplösning först med 3D-bearbetning som i steg 7.8 för 3D-rekonstruktion.
    2. För att skapa en 3D-bild, klicka på 3D-ikonen i förhandsgranskningsfönstret. När du väl har klickat visas en 3D-flik i avsnittet om displaykontroll längst ned på skärmen. 3D-vyer, till exempel Genomskinlighet, Volym, Maximum, Yta och Blandat visas. Använd yt- eller blandade vyer när du visar vesiklarnas struktur (att föredra).
    3. För bild av högsta kvalitet väljer du inställningen Exakt , eftersom den snabbaste inställningen blir mindre exakt och leder till dålig 3D-rendering.
    4. När bilden har genererats manipulerar du den genom att rotera och zooma för att fokusera på en önskad plats för att visa objekten av intresse. Ändra 3D-bilden under fliken Utseende .
    5. När en tillfredsställande vy har erhållits, under fliken 3D, välj Visad upplösning och klicka sedan på Skapa bild. Detta skapar en ögonblicksbild av bilden i samma riktning som den visades och kan sparas och exporteras i olika filformat.
  3. Generera en intensitetsprofil enligt beskrivningen nedan (bild 7).
    OBS: Distributions- och intensitetsprofilerna för pixlarna som är associerade med de olika fluorescerande signalerna kan ses som en överlagringsbild för att bestämma deras samlokalisering.
    1. När en optimal bild har förvärvats via konfokal eller superupplöst avbildning klickar du på Profil i panelen Visa i förhandsgranskningsfönstret. I förhandsgranskningsfönstret visas ett histogram som visar intensitetsprofilen som en funktion av avståndet, liksom en tabell som visar avstånd och intensitetsvärden.
    2. I visningskontrollområdet längst ner på skärmen klickar du på pilverktyget på fliken Profildefinition . Rita en pil längs objektets längd för vilken intensitetsprofilen för de olika pixlarna måste bedömas. Om du vill rita pilen zoomar du in på bilden.
    3. Intensitetsprofilen visas till vänster om bildförhandsgranskningen, där avståndet och motsvarande toppar längs pilens väg visas. Om du vill ta bort histogrammet som visas på själva bilden avmarkerar du rutan Visa profil i grafik .
    4. På fliken Dimensioner i visningskontrollområdet avmarkerar du alla kanaler som inte ska ingå i intensitetsprofilen.
    5. På fliken Grafik dubbelklickar du på Profil som visas under rutan Anteckningar / mätningar för att öppna popup-rutan Formatera grafiska element . Använd detta för att ändra pilens färg samt dess stil och linjetjocklek. Stäng rutan efter att du har valt önskade inställningar.
    6. Klicka på fliken Profilvy . I det nya bildavsnittet klickar du på Aktuell vy och sedan på Spara som för att spara filen. Vi rekommenderar att du sparar filen som en .tif fil för att undvika datakomprimering och förlust.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoderna som beskrivs häri kan användas för att effektivt och exakt avbilda och karakterisera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i polariserade epitelceller, såsom FE hos Drosophila-äggstocken . Därefter ger vi förväntade resultat som erhållits med hjälp av de beskrivna metoderna, samt användbara råd och potentiella fallgropar. För att göra det används Vkg-GFP, en endogent märkt Vkg (Drosophila Col IV). Samma resultat kan dock uppnås med andra endogent märkta BM-proteiner såsom Pcan-GFP.

Ställa in optimala förvärvsparametrar (bild 2)
För att exakt karakterisera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner, såsom Vkg och Pcan, i epitelceller är det viktigt att korrekt ställa in förvärvsparametrarna för konfokalmikroskopet enligt beskrivningen i de tillhandahållna metoderna.

Med hjälp av konfokalmikroskopi kan den intracellulära lokaliseringen av Vkg-GFP detekteras innan den utsöndras och deponeras basalt i FE (figur 2A). Det har visat sig att efter översättning i ER transporteras Coll IV till Golgi innan den förpackas i intracellulära exocytiska vesiklar. Med hjälp av denna avbildningsmetod observerar vi att Vkg-GFP ackumuleras i intracellulära fack med olika former, vilket potentiellt representerar olika organeller, endosomala fack och vesikeltyper (figur 2A, pilar). I exocytiska vesiklar är Coll IV redan sammansatt i fibriller som består av tre polypeptider: två α1-kedjor och en α2-kedja (Vkg i Drosophila), vilket leder till bildandet av sträckta vesiklar som också kan visualiseras med hjälp av konfokal avbildning (Figur 2A, pilar). Därefter utsöndras Coll IV specifikt basalt från epitelceller där det deponeras i BM (figur 2, pilspetsar).

Om anskaffningsparametrarna inte är korrekt inställda är det inte möjligt att exakt observera de olika morfologierna och positionerna under intracellulär handel med BM-proteiner (figur 2B,C). Till exempel, om förvärvsparametrarna är optimerade för att visualisera den extracellulära BM och inte intracellulära strukturerna, verkar de BM-proteininnehållande endosomala facken och vesiklarna (här markerade med Vkg-GFP) svaga eller är inte synliga (Figur 2B). Omvänt, om detektorerna är alltför mättade, kan den intracellulära lokaliseringen av Vkg-GFP detekteras som i optimalt tillstånd (jämför figur 2A och figur 2C), men en ökning av bakgrundsfluorescensbrus gör det svårare att tolka BM-proteinlokaliseringen, särskilt för samlokaliseringsexperiment (se figur 7 ). Sammantaget illustrerar dessa data vikten av korrekta förvärvsparametrar för att uppnå korrekt lokalisering av BM-proteiner i epitelet.

Ställa in optimala superupplösnings- och dekonvolutionsparametrar (bild 3)
Som illustreras för konfokal bildförvärv är det också viktigt att ställa in förvärvsparametrarna korrekt när du använder superupplösningsmikroskopi för att undvika under- eller övermättnad. Denna superupplösande avbildningsmetod involverar också noggrann konfiguration av dekonvolutionsparametrar för att uppnå superupplösningsavbildning (figur 3). När dekonvolutionsbehandling är optimalt konfigurerad ökar superupplösningsavbildning signifikant upplösningen av intracellulära strukturer som innehåller BM-proteiner (figur 3A, pilar), såsom vesiklar eller Golgi-strukturer (figur 3A och figur 7C), själva BM (figur 3A, pilspetsar) och förbättrar signal-brusförhållandet45 . Superupplösningsmikroskopi leder till en ~ 2x ökning av upplösningen i alla tre rumsliga dimensioner jämfört med konfokalmikroskopi. Denna ökning av upplösningen illustreras tydligt av de bättre definierade bilderna av intracellulär handel med BM-proteiner och BM tagna med superupplösningsavbildning jämfört med de som tagits med standard CSLM (jämför figur 2A och figur 3A).

Om dekonvolutionsparametrar inte är korrekt inställda uppnås inte superupplösningen optimalt och ökningen av upplösningen går förlorad. Underbearbetning av bilder med superupplösning leder till suddiga bilder, vilket resulterar i att den intracellulära lokaliseringen av BM-proteiner verkar svag och inte lika väldefinierad som under optimala förhållanden (jämför figur 3B med figur 3A). Omvänt leder överbearbetning av bilderna till korniga bilder, där den intracellulära lokaliseringen av BM-proteiner verkar pixelerad (figur 3C). Dessa data belyser vikten av att använda korrekta dekonvolutionsparametrar för att uppnå meningsfulla och representativa bilder som återspeglar den intracellulära fördelningen av BM-proteiner.

Sammantaget visar och belyser dessa data tydligt den förbättrade upplösningen av intracellulär handel med BM-proteiner med hjälp av superupplöst bildbehandling jämfört med konfokalmikroskopi. Specifikt möjliggör detta tillvägagångssätt bättre visualisering av intracellulär handel med BM-proteiner genom att förbättra upplösningen av de involverade intracellulära strukturerna. Detta möjliggör jämförelse av olika storlekar och former av strukturer för att bättre identifiera och karakterisera nya faktorer som är involverade i polariserad avsättning av BM-proteiner i FE.

Ortogonal projektion och 3D-rekonstruktion av optiska z-sektioner (z-stack) genom FE för att förbättra visualiseringen av den intracellulära fördelningen av BM-proteiner (figur 4 och figur 5)
Eftersom den intracellulära fördelningen av BM-proteiner är närvarande i hela FE i 3D (x-, y- och z-axlar) kan ortogonal projektion och / eller 3D-rekonstruktion av optiska z-sektioner genom FE, med antingen superupplösning eller konfokalmikroskopi, användas för att bedöma lokaliseringen och fördelningen av BM-proteiner inuti vildtyp eller mutanta celler (t.ex. i figur 4 och figur 5).

Ortogonal projektion gör det möjligt att projicera alla z-sektioner som förvärvats i ett enda plan. Denna metod är särskilt användbar för att visa den totala fördelningen av vesiklar och fack som innehåller BM-proteiner i en enda bild med hjälp av konfokal (figur 4A) eller superupplösning (figur 4B) avbildning. En betydligt bättre upplösning och mindre bakgrundsbrus resulterar dock när man använder superupplöst mikroskopi än konfokalmikroskopi (jämför figur 4B och figur 4A).

Ett annat tillvägagångssätt för att visualisera den totala fördelningen av BM-innehållande fack och vesiklar är att generera en 3D-rekonstruktion genom att montera en stapel optiska z-sektioner tagna av konfokal (figur 5A) eller superupplösning (figur 5B) avbildning. Detta tillvägagångssätt kan också vara mycket effektivt för att bedöma lokalisering och distribution av intracellulära BM-proteiner och formen på fack och vesiklar som innehåller Vkg-GFP, särskilt vid användning av superupplösningsmikroskopi (figur 5). Traditionell konfokalmikroskopi (figur 5A) resulterar i högre bakgrundsbrus jämfört med superupplösning (figur 5B), vilket när det redovisas i 3D-rendering kan resultera i artefakter. Dessutom resulterar den lägre upplösningen av konfokal också i att de skapade bilderna är mindre smidiga och definierade än de som genereras av superupplösning (jämför figur 5A och figur 5B).

Karakterisering av fenotyperna associerade med förlusten av komponenter som är involverade i den polariserade utsöndringen av BM-proteiner med användning av superupplösningsavbildning (Figur 6)
Som hittills visats (figur 2, figur 3, figur 4 och figur 5) kan superupplösningsmikroskopi och bildbehandling användas för att bedöma den intracellulära lokaliseringen och fördelningen av BM-proteiner i vildtypen FE i Drosophila-äggstocken . Dessutom kan detta tillvägagångssätt också användas för att bestämma och jämföra lokaliseringen av BM-proteiner under mutanta eller knockdown-förhållanden. Detta är därmed en effektiv metod för att karakterisera rollen /rollerna för nyligen identifierade komponenter dedikerade till polariserad intracellulär handel, utsöndring och avsättning av BM-proteiner.

GTPase exchange factor (GEF) Crag har visat sig vara en nyckelkomponent i en biologisk väg dedikerad till polariserad avsättning av BM-proteiner28. I Crag knockdown FCs ackumuleras BM-proteiner både apikalt och basalt, vilket indikerar att Crag kontrollerar den polariserade utsöndringen av BM-proteiner såsom Vkg-GFP (Figur 6). Användningen av superupplösningsmikroskopi möjliggör bättre karakterisering av fenotypen till följd av förlusten av Crag. Till exempel observeras en stark apikal ackumulering av BM-proteiner, liksom organisationen av den ektopiska apikala BM, i Crag-knockdown FCs (Figur 6B, pilspetsar). Dessutom, när fenotypen är mindre avvikande, detekteras BM-membran som ackumuleras apikalt i små fläckar i FC (figur 6B, pilar). Sammantaget illustrerar dessa data att superupplösningsmikroskopi kan användas för att karakterisera mutanta fenotyper för att bättre förstå rollerna för komponenter som är involverade i den polariserade avsättningen av BM.

Samlokaliseringsexperiment med antikroppar och endogent taggade BM-proteiner avbildade med konfokal och superupplösningsmikroskopi (figur 7)
Slutligen kan användningen av antikroppar mot specifika intracellulära markörer eller nyligen identifierade komponenter i kombination med endogent märkta BM-proteiner användas för att bättre karakterisera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i det polariserade epitelet. GM-130, en cis-Golgi-markör, används för att illustrera denna punkt. Innan den förpackas i sekretionsblåsor transporteras Coll IV till Golgi. När den subcellulära fördelningen av Vkg-GFP bedöms med hjälp av konfokal (figur 7A,B) eller superupplösning (figur 7C,D) avbildning, visar båda metoderna att Vkg-GFP delvis samlokaliseras med GM-130, vilket bekräftar att Coll IV sorteras till Golgi före utsöndring. En ökning av signal-brusförhållandet och en bättre upplösning av samlokaliseringen mellan Vkg-GFP och GM130 observeras dock vid användning av superupplösningsavbildning (jämför figur 7A med figur 7C).

Dessutom, när den rumsliga fördelningen och nivåerna av gröna (Vkg-GFP) och röda (GM-130) pixlar kvantifieras genom att mäta fluorescensintensiteten hos en optisk sektion genom FC: er tagna med konfokal (figur 7B) och superupplösning (figur 7D) mikroskopi, observeras samlokaliseringen av Vkg-GFP och GM-130. Fördelningen av Vkg-GFP- och GM-130-pixlar ritas i histogram där överlappningar av topparna Vkg-GFP och GM-130 indikerar deras samlokalisering (figur 7B', D'). Med hjälp av detta bildanalysverktyg kan således placeringen av Vkg-GFP i specifika intracellulära fack bestämmas exakt. Jämförelsen av histogram som genereras från konfokala bilder (figur 7B') med bilder med superupplösning (figur 7D') bekräftar dock att superupplösningsmikroskopi ger bättre resultat, vilket framgår av topparnas högre intensitet och minskade bakgrundsbrus som representeras av bristen på mindre toppar (jämför figur 7B' och figur 7D' ) associerade med histogram som genereras av superupplösning. Sammantaget belyser dessa data att även om konfokalmikroskopi kan användas för att kvantifiera samlokalisering, är superupplösning ett kraftfullare tillvägagångssätt, vilket leder till en mer effektiv och exakt kvantifiering av lokaliseringen.

Figure 1
Figur 1: Follikulärt epitel (FE) i Drosophila-äggstocken : ett modellsystem för att studera polariserad avsättning av källarmembran (BM) -proteiner. (A) Bild av intakta äggstockar efter dissektion och excision tagen med ett fluorescenssteremikroskop. Äggstockar uttrycker ett endogent GFP-märkt BM-protein (Vkg-GFP). Skalstång = 1 mm. (A') Två äggstockar av en kvinnlig fluga är fästa vid äggledaren. Varje äggstock innehåller 16-20 ovarioler. En enda ovariol är skisserad (rektangel). Skalstång = 1 mm. (B) Längsgående sektion, tagen med ett konfokalmikroskop, genom en ovariol som uttrycker Vkg-GFP och färgad för DNA (blå) och F-Aktin (röd). Ovarioler består av äggkammare i olika steg. Äggkammare består av ett monolager follikulärt epitel (FE) som omger bakteriecellerna (GCs). FE syntetiserar och utsöndrar basalt BM-proteiner (t.ex. Pcan och Vkg). Skalstreck = 100 μm. (C) Schematisk för FE. FE är ett klassiskt epitel med en distinkt apikal-basal polaritet där den apikala domänen vetter mot könscellerna och basaldomänen vetter mot BM (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Avbildning av intracellulär handel med BM-proteiner med hjälp av konfokal avbildning. (A'-C') Intracellulära fack och vesiklar som innehåller Vkg-GFP (pilar) och den basalt och extracellulärt avsatta BM (pilspetsar) visas med hjälp av konfokalmikroskopi. (A) Optimalt förvärvad bild för vilken intracellulär handel med Vkg-GFP är synlig. (A') Vkg-GFP är lokaliserad i hela cytoplasman hos FC i olika cellulära fack (t.ex. Golgi) och i vesiklar. På grund av fibrilorganisationen av kollagen IV verkar Vkg-GFP-innehållande vesiklar långsträckta (pilar). (B) Underexponerad bild för vilken förvärvsparametrarna är optimerade för att visualisera den extracellulära BM och inte den intracellulära fördelningen av BM-proteiner. Vkg-GFP (grön) verkar svag i hela cytoplasman (B '), vilket resulterar i omätbara Vkg-GFP-innehållande vesiklar jämfört med (A). (C) Överexponerad bild för vilken GFP-detektorn är mättad, vilket resulterar i en ökning av bakgrundsfluorescensen. Även om den intracellulära fördelningen av Vkg-GFP (grön) kan ses lokaliserad i hela cytoplasman hos FC: erna (pilar), resulterar överexponering i bildartefakter där de intracellulära strukturerna verkar större än de är, som i (A-A '). Skalstreck = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Avbildning av intracellulär handel med BM-proteiner med hjälp av superupplösande avbildning och bearbetning. (A-C) Längsgående sektion genom en äggkammare som uttrycker Vkg-GFP (grön) och färgad för DNA (blå) och F-Aktin (röd). (A) Optimalt bearbetad superupplöst bild, där den intracellulära handeln med Vkg-GFP tydligt observeras. (A') Vkg-GFP är lokaliserad i hela cytoplasman hos FC: erna i olika cellulära fack (t.ex. Golgi) och vesiklar (pilar) och vid BM (pilspetsar). (B) Underbehandlad bild som resulterar i högre bakgrundsfluorescens än i (A). Den intracellulära lokaliseringen av Vkg-GFP (grön) verkar svag och mindre definierad (jämför B med A). (C) Överbehandlad bild som resulterar i en bild där den intracellulära lokaliseringen av Vkg-GFP verkar pixelerad och kornig. Skalstreck = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Ortogonal projektion av en z-stack som förvärvats och bearbetats med hjälp av konfokala och superupplösande mikroskopimetoder. (A) Projektion av en z-stack som förvärvats med hjälp av optimala konfokala parametrar. Den intracellulära lokaliseringen av Vkg-GFP kan observeras i hela z-axeln i FC: erna (A ', pilar). BM är också synlig och verkar mycket ljus (A ', pilspetsar). (B) Projektion av en z-stack som förvärvats med hjälp av optimal superupplösningsbehandling. Väldefinierade intracellulära fack och vesiklar som innehåller Vkg-GFP kan observeras i hela z-axeln i FC:erna (B', pilar). BM är också mycket väldefinierad (B', pilspetsar). Skillnaden mellan standard konfokal avbildning och superupplösningsavbildning är uppenbar, eftersom den intracellulära lokaliseringen av Vkg-GFP och BM är betydligt mer definierad när man använder superupplösning än standard konfokalmikroskopi. Dessutom har bilden som tagits med konfokalmikroskopi högre bakgrundsfluorescens. Skalstreck = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: 3D-rekonstruktion av en z-stack som förvärvats och bearbetats med hjälp av konfokala och superupplösande mikroskopimetoder. (A) 3D-rendering av en z-stack som förvärvats via konfokalmikroskopi. Placeringen och formen på fack och vesiklar som innehåller Vkg-GFP kan ses i hela cellerna (A '). (B) 3D-rendering av en z-stack som förvärvats via optimal superupplösningsbehandling. Placering och form på fack och vesiklar som innehåller Vkg-GFP kan ses (B'). Formen på vesiklar, liksom BM och kärnor, är smidigt definierade, och upplösningen är högre jämfört med konfokalmikroskopi (jämfört B 'och A'). Formen och storleken på facken och vesiklarna som innehåller Vkg-GFP kan också bestämmas bättre med hjälp av superupplösningsmikroskopi (jämfört B 'och A'). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Bild 6: Karakterisering av Vkg-GFP-lokalisering i Crag nedslagna FC: er. (A-B) Längsgående sektion genom en äggkammare som uttrycker Vkg-GFP (grön), färgad för DNA (blå) och F-Aktin (röd) och förvärvad via optimal superupplösningsbehandling. (A) Kontrolllinje som uttrycker vildtyp Crag, ett protein som är avgörande för korrekt BM-deponering. FE visar typisk BM-proteinlokalisering, där Vkg-GFP är intracellulärt fördelad och deponeras basalt i FE (A '). (B) Transgen Drosophila-linje som uttrycker RNAi för Crag i FE, vilket resulterar i en Crag-knockdown. Förlusten av Crag leder till fellokalisering av BM-proteiner (t.ex. Vkg-GFP) apikalt i FE (B', pilar och pilspetsar). Superupplösningsbild används för att karakterisera BM-fellokaliseringsfenotyperna associerade med förlusten av Crag. Specifikt visar vissa Crag RNAi FCs en stark apikal fellokalisering av BM-proteiner (B', pilspetsar), medan andra Crag RNAi FCs presenterar en svagare apikal fellokalisering (B ', pilar). Superupplösningsavbildning avslöjar tydligt fenotyperna som är associerade med förlusten av Crag (B ', pilspetsar vs pilar). Skalstreck = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Samlokalisering av Vkg-GFP och GM-130 (Golgi-markör) med hjälp av konfokala och superupplösande mikroskopimetoder. (A,B) Konfokal avbildning visar att intracellulär Vkg-GFP delvis samlokaliseras med en cis-Golgi-markör (A, pilspets). (B) Inzoomat område i (A). Fördelningarna av gröna (Vkg-GFP) och röda (GM-130) pixlar längs den vita pilen ritas i ett histogram (B'). Histogrammets x-axel representerar avståndet (μm) längs pilen medan y-axeln representerar pixelintensiteten. De överlappande gröna och röda topparna (*) visar var Vkg-GFP och GM-130 samlokaliseras. (C,D) Superupplösningsavbildning visar också att intracellulär Vkg-GFP delvis samlokaliseras med en cis-Golgi-markör (C, pilspets). (D) Inzoomat område av (C). Fördelningarna av gröna (Vkg-GFP) och röda (GM-130) pixlar längs den vita pilen ritas i ett histogram (D'). Histogrammets x-axel representerar avståndet (μm) längs pilen medan y-axeln representerar pixelintensiteten. De överlappande gröna och röda topparna (*) visar var Vkg-GFP och GM-130 samlokaliseras. Dessa data visar att superupplösningsavbildning är ett mer effektivt och exakt tillvägagångssätt än konfokal avbildning för att karakterisera och kvantifiera samlokalisering. Skalstreck = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Konfokala och superupplösta mikroskopiförvärvs- och bearbetningsparametrar för de representativa bilderna. Alla de viktigaste bildparametrarna sammanställs för de representativa bilderna som tillhandahålls. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BM är avgörande för embryonal och organmorfogenes och vuxna fysiologiska funktioner. Dessutom fungerar BM som en signalplattform för etablering och underhåll av epitelpolaritet och ger vävnader stöd2. Ändå är mekanismerna som reglerar korrekt placering av BM-proteiner dåligt förstådda. En bättre förståelse av de biologiska vägarna som är dedikerade till intracellulär handel och polariserad utsöndring av BM-proteiner kräver en noggrann analys av komponenterna i dessa vägar och deras roller i BM-bearbetning. Ett sätt att uppnå detta är att använda konfokal och superupplöst avbildning. Här beskrev vi metoder för beredning och färgning eller immunfärgning av Drosophila-äggstockar för att effektivt avbilda intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i FE med hjälp av konfokal och superupplösande mikroskopi.

Fördelar med proteinfälla och endogent märkta proteiner för att visualisera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i vildtyp och mutanta förhållanden
Det tillhandahållna protokollet drar full nytta av proteinfällor och endogent märkta BM-proteiner (t.ex. Vkg-GFP och Pcan-GFP) för att avbilda och bedöma lokaliseringen och fördelningen av BM-proteiner i FE i vildtyp (kontroll) och mutantförhållanden. Dessa linjer har viktiga fördelar jämfört med användningen av antikroppar mot BM-proteiner. För det första är antikroppar mot specifika proteiner av intresse ofta sällsynta och i låg mängd. Dessutom finns det ofta problem med vävnadspenetrans i samband med antikroppar som kan leda till felaktig observation och bedömning av proteinet av intresse. Dessutom kan proteinfälllinjer införas i olika genetiska bakgrunder som används för att bestämma funktionerna hos faktorer som krävs för korrekt avsättning av BM, såsom (i) metoder för att manipulera genuttryck (t.ex. UAS / Gal4), (ii) mutanter och (iii) RNA-interferens (RNAi) linjer. Slutligen kan dessa proteinfällor användas för att visualisera lokaliseringen och funktionen av BM med hjälp av live imaging57.

Fusionen av en fluorescerande tagg till ett protein av intresse kan emellertid störa dess lokalisering och funktioner. Således är det viktigt att utvärdera eventuella avvikande effekter av taggen på proteinet. Ett sätt att säkerställa att tillsatsen av en fluorescerande tagg inte stör funktionen och lokaliseringen av BM-proteiner är att avgöra om den transgena Drosophila-linjen är homozygot livskraftig. Både Vkg-GFP- och Pcan-GFP-linjerna som används i de olika experimenten som beskrivs här och tidigare är homozygota livskraftiga, vilket indikerar att tillsatsen av en GFP-tagg inte stör funktionen hos dessa väsentliga proteiner 29,30.

Betydelsen av vävnadsberedning, fixering och färgning för avbildning
För att effektivt och korrekt avbilda FE är det viktigt att förbereda, fixa och färga äggstocksvävnaden ordentligt enligt anvisningarna i denna metod. Först, efter dissektion, ta försiktigt bort alla andra organ och flyga skräp före fixering. Att använda paraformaldehyd (PFA) för att fixera vävnad rekommenderas, eftersom det leder till ljus GFP-fluorescens och är kompatibel med de flesta antikroppar. PFA kanske dock inte är kompatibelt med alla antikroppar; vissa kan kräva glutaraldehyd eller metanolfixering. För att undvika bakgrundsfluorescens på grund av icke-specifik bindning av den primära antikroppen bör äggstocksvävnaden dessutom inkuberas på en nötningsplattformsvippa i minst 1 timme i blockerande lösning och tvättas i stor utsträckning flera gånger efter primär och sekundär antikroppsinkution enligt beskrivningen i protokollet. Slutligen är korrekt montering av äggstocksvävnaden avgörande för att uppnå optimal avbildning. Detta kräver noggrann separering av enskilda äggkammare för att undvika att de staplas ovanpå varandra. Det är också viktigt att låta monteringsmediet polymerisera helt före avbildning för att undvika att vävnaden flyter under täckglaset. Detta gör det ytterligare möjligt för monteringsmediet att nå sitt optimala reflekterande index, vilket är mycket viktigt för avbildning med superupplösning. Om du inte gör det kommer bildkvaliteten att påverkas. Dessutom kan de beredda objektglasen förvaras i upp till 1 månad vid 4 °C innan fluorescensen släcks. Förutom det tillhandahållna protokollet finns flera andra protokoll tillgängliga för äggstocksdissektion och färgning 53,54,55.

Användningen av korrekta anskaffnings- och bearbetningsparametrar är avgörande för optimal avbildning och för att bedöma lokaliseringen av BM-proteiner med hjälp av konfokal och superupplösningsavbildning
Som beskrivits tidigare är det viktigt att korrekt ställa in förvärvsparametrarna för konfokal och superupplösningsavbildning för att få optimala bilder av provet. För bildförvärv måste ROI väljas noggrant med zoomfunktionen och sedan ställa in bildstorleken och förvärvshastigheten optimalt. Dessutom, som illustreras i figur 2, är det viktigt att justera lasereffekten och detektorförstärkningen på lämpligt sätt för att visualisera intracellulär handel utan att mätta detektorerna. Dessa parametrar måste ställas in mycket noggrant för att undvika underexponerade eller överexponerade bilder (figur 2). Underexponerade bilder kommer att resultera i bilder med låg upplösning, där de intracellulära strukturerna kommer att vara svåra att visualisera och karakterisera (figur 2B). Överexponerade bilder på grund av detektorns mättnad leder till feltolkning av data och samlokaliseringsartefakter (figur 2C). Om målet är att bestämma vesikulär lokalisering av endogent märkta BM-proteiner mättar fluorescensen från GFP-märkta proteiner (t.ex. Vkg-GFP och Pcan-GFP) i basal BM snabbt detektorn. Vesiklar som innehåller mindre GFP-märkta BM-proteiner kommer dock att verka svaga. Därför är det viktigt att ställa in bildkänsligheten med hjälp av de BM-innehållande intracellulära strukturerna (t.ex. vesiklar) och inte på BM (figur 2). Att välja pinhålstorlek är också mycket viktigt. Helst bör en hålstorlek på 1 AU för varje kanal väljas för bilder av bästa kvalitet, särskilt när upplösningen i z-axeln är viktig. Den mindre hålstorleken är optimal för tunnare optiska sektioner. Men när optimal z-axelupplösning inte krävs eller en z-stack inte fångas, kan nålhålsstorleken ökas för att undvika fotoblekning. Dessutom, för mycket svaga signaler, kan en ökning av hålstorleken hjälpa på grund av ett högre signal-brusförhållande och fångst av fler fotoner, vilket hjälper till med datatolkning.

För avbildning med superupplösning bör särskild uppmärksamhet ägnas åt dekonvolutionsbehandling för att undvika att under- eller överbearbetade bilder genereras som är dåligt lösta, vilket illustreras i figur 3. Slutligen, för att uppnå en optimal 3D-rekonstruktion, rekommenderas starkt att ställa in det bästa intervallet som bestäms av programvaran. Ett för stort intervall mellan z-sektioner (dvs högre än 0,5 μm) kommer att leda till dålig 3D-rendering och kommer att påverka den efterföljande analysen av fenotypen.

Fördel med superupplösning jämfört med traditionell konfokalmikroskopi vid avbildning av BM intracellulär handel
Som illustreras i resultatavsnittet, även om lokaliseringen och distributionen av BM-proteiner kan bedömas exakt med hjälp av konfokal avbildning, genererar den beskrivna superupplösningsmetoden mer exakta bilddata med en signifikant ökning av upplösningen av intracellulära strukturer som innehåller BM-proteiner, samt ett förbättrat signal-brusförhållande. Dessutom är denna superupplösande mikroskopiteknik relativt enkel att använda. Eftersom superupplösningsavbildning avsevärt ökar upplösningen jämfört med konfokalmikroskopi, upp till 120 nm i x- och y-axlarna och 350 nm i z-axeln, kommer detta tillvägagångssätt att påverka vår förståelse av den polariserade avsättningen av BM genom att mer exakt karakterisera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i epitelceller såsom FC.

Dessutom har en annan superupplösande bildmetod (Structured Illumination Microscopy, SIM) och användningen av dekonvolutionsalgoritmer utformade för punktskanning av konfokalmikroskopi (dvs Nikons förbättrade upplösningsprogrammodul) tidigare använts för att karakterisera rollen som faktorer som är involverade i BM-deponering29. Den ökade upplösningen i samband med dessa tekniker har gett viktig insikt i vår förståelse av den intracellulära handeln med BM-proteiner och organisationen av BM. Dessa metoder har dock vissa begränsningar jämfört med Airyscan-mikroskopi. Till exempel är SIM inte särskilt effektivt för att få optimala bilder när man får optiska z-sektioner djupt i vävnaden. Detta gör SIM svårt att använda vid screening för nya komponenter som är involverade i BM-deponering. Dessutom uppnår användningen av dekonvolutionsalgoritmer som tillämpas på konfokala bilder inte samma nivå av superupplösning. Sammantaget är Airyscan superupplösningsavbildning på fast vävnad ett kraftfullt och överlägset tillvägagångssätt för att studera BM intracellulär handel och deponering.

Men som med alla andra superupplösningsmikroskopier är några olägenheter också förknippade med detta tillvägagångssätt och måste beaktas vid avbildning. För det första kräver superupplösningsläget vanligtvis längre anskaffningstid för provet än konfokalläge. Således måste förvärvsparametrarna och intresseområdet ställas in noggrant för att minimera fotoblekning av provet. Dessutom är bildfiler som genereras av superupplösningsmikroskopi mycket större än filer som genereras av konfokalmikroskopi och kan behöva specialiserade datorer eller servrar för bildbehandling och lagring.

Slutligen har levande avbildning av BM-proteinerna under Drosophila oogenes använts för att karakterisera nya faktorer som är involverade i BM-polaritet57. Detta tillvägagångssätt har dock begränsningar, särskilt i upplösningen av intracellulära strukturer under BM-proteinhandel. Superupplösningsmikroskopi är ett kraftfullt tillvägagångssätt att använda i samband med levande avbildning för att exakt bestämma rollerna för identifierade faktorer i polariserad avsättning av BM-proteiner.

Andra tillämpningar av denna metod för att studera lokaliseringen av intracellulära komponenter dedikerade till vesikulär handel med hjälp av endogent taggade proteiner och superupplösningsavbildning
Etablering och underhåll av vävnader och organ under utveckling och i en vuxen organism är delvis beroende av cell-till-cell-signalering och cellulär spänning och vidhäftning. Dessa processer beror på intracellulär handel, endocytos, exocytos och utsöndring av specifika proteiner. Således kan de metoder som beskrivs häri för att dechiffrera den intracellulära handeln med BM med hjälp av endogent taggade proteiner och konfokal och superupplösningsmikroskopi enkelt anpassas för att studera varje process. Dessutom gör användarvänligheten av CRISPR / Cas9-medierad genetisk redigering för att generera endogent märkta proteiner detta tillvägagångssätt ännu mer mångsidigt och kraftfullt58.

Sammanfattningsvis har vi beskrivit metoder för beredning och avbildning av BM-proteiner i FE i Drosophila-äggstocken med hjälp av konfokal och superupplösningsmikroskopi. Dessa protokoll kan tillämpas för screening med hög genomströmning för att identifiera nya komponenter som är dedikerade till korrekt placering av BM-proteiner. Slutligen har användningen av denna metod potential att ge betydande bidrag till vår förståelse av hur epitelceller styr den polariserade utsöndringen av BM-proteiner, en nyckelprocess vid etablering och underhåll av epitelarkitektur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma mot Julie Merkle för hennes hjälpsamma kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R15GM137236 till O.D. De konfokala och superupplösta bilderna förvärvades med hjälp av en Zeiss LSM 900 med Airyscan 2, köpt med NSF MRI grant 2018748.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin Invitrogen A22283 F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin Invitrogen A22287 F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody abcam ab30637 For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount Polysciences, Inc. 1860620 Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast) Genesee Scientific 62-103 To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution) Sigma-Aldrich A7284 For blocking solution
Depression wells Electron Microscopy Sciences 7156101 For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle Fisher scientifc 13-820-024
Drosophila Incubator Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) Bloomington Drosophila Stock Center 33594 RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5) Fine Science Tools 11251-30 For dissection
Glass Concavity Slide Electron Microscopy Sciences 7187804 For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 Invitrogen A11036 Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342) Invitrogen H3570 DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes Kimtech Fisher Scientific: 06-666 Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC Leica For ovary imaging
Microscope Slides Corning 294875X25 Microscope Slides
Nutating platform rocker Corning Life Sciences 6720 For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF Genesee Scientific 66-121 Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific: 15713 For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets Fisher scientific BP2944100 For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant Invitrogen P36980 Mounting Medium
Square Cover Glass Corning 285022 Cover glass for microscope slides
Triton x-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 Zeiss Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope Zeiss Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) Zeiss Image acquisition and processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), Cambridge, England. 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, Clifton, N.J. 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, Clifton, N.J. 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

Tags

Utvecklingsbiologi Utgåva 183 Källarmembran Drosophila Äggstock Epitel Konfokalmikroskopi Superupplösningsmikroskopi Trafficking
Konfokal och superupplöst avbildning av polariserad intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner under <em>Drosophila</em> Oogenesis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal… More

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis. J. Vis. Exp. (183), e63778, doi:10.3791/63778 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter