Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

סינתזה של ננו-קומפוזיטים של גרפן-הידרוקסיאפטיט לשימוש פוטנציאלי בהנדסת רקמות עצם

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63985
Automatic Translation
1,2,3, 3, 4, 1, 3,5,6,7
1Department of Physics, Faculty of Science, Kasetsart University, 2Department of Microbiology, School of Science, RK. University, 3Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 4Defence Institute of Advanced Technology Campus, Navyukti Innovations Pvt. Ltd., 5Department of Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 6Department of Chemistry, Saveetha School of Engineering, Institute of Medical and Technical Science, Saveetha University, 7UFPI - Universidade Federal do Piauí

Summary

ננו-קומפוזיטים חדשניים של ננו-ננו-חלקיקי גרפן והידרוקסיאפטיט הוכנו באמצעות סינתזה של שלב התמיסה. בני כלאיים אלה כאשר הם מועסקים בפיגומים ביו-אקטיביים יכולים להציג יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות והתחדשות עצם.

Abstract

פיתוח חומרים חדשניים להנדסת רקמות עצם הוא אחד מתחומי הדחף החשובים ביותר של ננו-רפואה. מספר ננו-קומפוזיטים יוצרו בהידרוקסיאפטיט כדי להקל על הדבקות תאים, התפשטותם ואוסטאוגנזה. במחקר זה פותחו בהצלחה ננו-קומפוזיטים היברידיים באמצעות ננו-ננו-נוריבונים של גרפן (GNRs) וננו-חלקיקים של הידרוקסיאפטיט (nHAPs), שכאשר הם משמשים בפיגומים ביו-אקטיביים עשויים לשפר את התחדשות רקמות העצם. ננו-מבנים אלה יכולים להיות ניתנים להתאמה ביולוגית. כאן שימשו שתי גישות להכנת החומרים החדשים. בגישה אחת, נעשה שימוש באסטרטגיית קו-פונקציונליזציה שבה nHAP סונתז והוצמד ל-GNR בו-זמנית, וכתוצאה מכך נוצרו ננו-היברידים של nHAP על משטחי GNR (המסומנים כ-nHAP/GNR). מיקרוסקופיית אלקטרונים ברזולוציה גבוהה (HRTEM) אישרה כי מרוכב nHAP/GNR מורכב ממבנים דקים ודקים של GNRs (אורך מרבי של 1.8 מיקרומטר) עם טלאים בדידים (150-250 ננומטר) של nHAP דמוי מחט (40-50 ננומטר אורך). בגישה האחרת, nHAP זמין מסחרית הוצמד עם GNR היוצרים nHAP מצופה GNR (מסומן כ- GNR / nHAP) (כלומר, עם כיוון הפוך יחסית לננוהיבריד nHAP / GNR). הננוהיבריד שנוצר בשיטה האחרונה הציג ננו-ספירות nHAP בקוטר שנע בין 50 ננומטר ל-70 ננומטר ומכוסות ברשת של GNR על פני השטח. ספקטרום פיזור אנרגיה, מיפוי יסודי וספקטרום אינפרה-אדום של התמרת פורייה (FTIR) אישרו את השילוב המוצלח של nHAP ו-GNR בשני הננו-היברידים. אנליזה תרמוגרווימטרית (TGA) הצביעה על כך שההפסד בטמפרטורות חימום גבוהות עקב נוכחות של GNRs היה 0.5% ו-0.98% עבור GNR/nHAP ו-nHAP/GNR, בהתאמה. הננוהיברידים nHAP-GNR בעלי אוריינטציות מנוגדות מייצגים חומרים משמעותיים לשימוש בפיגומים ביו-אקטיביים כדי לקדם באופן פוטנציאלי תפקודים תאיים לשיפור יישומים הנדסיים של רקמות עצם.

Introduction

לגרפן יש מבנים דו-ממדיים דמויי יריעה המורכבים מפחמן היברידי. ניתן לייחס מספר אלוטרופים אחרים לרשת חלת הדבש המורחבת של גרפן (לדוגמה, ערימה של יריעות גרפן יוצרת גרפיט תלת-ממדי תוך גלגול אותו חומר גורמת להיווצרות ננו-צינוריות חד-ממדיות1). כמו כן, 0D fullerenes נוצרים עקב עטיפה2. לגרפן יש תכונות פיסיקוכימיות ואופטו-אלקטרוניות אטרקטיביות הכוללות אפקט שדה אמביפולרי ואפקט הול קוונטי בטמפרטורת החדר 3,4. זיהוי אירועי ספיחה של מולקולה בודדת וניידות נשא גבוהה במיוחד מוסיפים לתכונות האטרקטיביות של גרפן 5,6. יתר על כן, ננו-נוריבונים של גרפן (GNRs) עם רוחב צר ומסלול חופשי ממוצע גדול, התנגדות נמוכה עם צפיפות זרם גבוהה וניידות אלקטרונים גבוהה נחשבים לחומרים מקשרים מבטיחים7. לפיכך, GNRs נבחנים ליישומים במספר עצום של מכשירים, ולאחרונה בננו-רפואה, במיוחד הנדסת רקמות ואספקת תרופות8.

מבין המחלות הטראומטיות השונות, פגיעות בעצמות נחשבות לאחת המאתגרות ביותר בשל קשיים בייצוב השבר, התחדשות והחלפה בעצם חדשה, התנגדות לזיהום ויישור מחדש של עצמות שאינן מאוגדות 9,10. הליכים כירורגיים נותרו האלטרנטיבה היחידה לשברים בפיר הירך. יש לציין כי כמעט 52 מיליון דולר מושקעים מדי שנה בטיפול בפציעות עצם במרכז אמריקה ובאירופה11.

פיגומים ביו-אקטיביים ליישומים של הנדסת רקמות עצם יכולים להיות יעילים יותר על ידי שילוב ננו-הידרוקסיאפטיט (nHAP), מכיוון שהם דומים לתכונות המיקרו והננו-אדריכליות של העצם עצמה12. HAP, המיוצג כימית כ- Ca10(PO4)6(OH)2 עם יחס טוחנת Ca/P של 1.67, הוא המועדף ביותר עבור יישומים ביו-רפואיים, במיוחד לטיפול בפגמים פריודונטליים, החלפת רקמות קשות וייצור שתלים לניתוחים אורתופדיים13,14. לפיכך, ייצור של ביו-חומרים מבוססי nHAP המחוזקים ב- GNR יכול להיות בעל תאימות ביולוגית מעולה ועשוי להיות יתרון בשל יכולתם לקדם osseointegration ולהיות אוסטאו-מוליכים15,16. פיגומים מרוכבים היברידיים כאלה יכולים לשמר תכונות ביולוגיות כגון הדבקות בתאים, התפשטות, התפשטות, התפשטות והתמיינות17. בהמשך, אנו מדווחים על ייצור של שני ננו-קומפוזיטים חדשים להנדסת רקמות עצם על-ידי שינוי רציונלי של הסידור המרחבי של nHAP ו-GNRs כפי שמודגם באיור 1. התכונות הכימיות והמבניות של שני הסדרי nHAP-GNRs השונים הוערכו כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של nHAP על ידי משקעים

  1. סינתזו את ה-nHAP הבתולי באמצעות 50 מ"ל של תערובת התגובה המכילה 1 M Ca(NO3)2∙4H2O ו-0.67 M (NH4)H2PO4 ואחריו תוספת טיפתית של NH4OH (25%) כדי לשמור על pH בסביבות 1018.
  2. לאחר מכן, התסיסו את תערובת התגובה על ידי הקרנת אולטרסאונד (UI) למשך 30 דקות (הספק של 500 W ותדר אולטרסאונד של 20 קילוהרץ).
  3. אפשרו לתמיסה המתקבלת להבשיל במשך 120 שעות בטמפרטורת החדר עד שהמזרז הלבן של nHAP ישקע. שחזר את ה- nHAP על ידי צנטריפוגה ב- 1398 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. שטפו את המשקעים במים שעברו דה-יוניזציה (DI) 3x וליופיליזציה למשך 48 שעות. אחסנו את האבקה היבשה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. הכנת ננו-קומפוזיטים nHAP/GNR

הערה: הדברים הבאים מתארים שתי גישות לייצור ננו-קומפוזיטים של nHAP/GNR (כלומר, nHAP על משטחי GNR) וננו-קומפוזיטים מסוג GNR/nHAP (nHAP מצופה GNR) המייצגים שני סידורים מרחביים שונים של nHAP ו-GNR (איור 1).

  1. סינתזה של nHAP/GNR
    1. כדי להכין את הננו-קומפוזיט nHAP/GNRs, השתמש באסטרטגיית פונקציונליזציה משותפת שבה ניתן לסנתז את nHAP ולהצמיד אותו ל-GNRs בו-זמנית, כדלקמן.
    2. ממיסים 5 מ"ג של GNRs (טבלת חומרים) בתערובת של 1 M סידן חנקתי טטרהידרט [Ca(NO3)2·4H2O] ו-0.67 M דיאמוניום מימן פוספט [(NH4)2HPO4] לנפח סופי של 50 מ"ל19.
    3. במהלך תגובה זו, הוסף 25% של NH4OH באופן טיפתי כדי לשמור על ה- pH ב ~ 10. התסיסו את התערובת המתקבלת על ידי ממשק משתמש למשך 30 דקות.
    4. לאחר השלמת התגובה, השאירו את התמיסה ללא הפרעה במשך 120 שעות בטמפרטורת החדר עד להתבגרות.
    5. שימו לב להיווצרותו של משקע ג'לטיני של nHAP אשר מצפה את ה- GNRs, ולאחר מכן משקע לבן של nHAP / GNR מתיישב.
    6. לשטוף את המשקע 3x על ידי צנטריפוגה ב 1398 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו פיזור מחדש במים DI.
    7. Lyophilize את משקע שטף התאושש במשך 48 שעות. אחסנו את האבקה היבשה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    8. השתמש ב- nHAP ו- GNR בתוליים כדוגמאות בקרה.
  2. סינתזה של ננו-קומפוזיט GNR/nHAP
    1. השהו את ה-nHAP הזמינים מסחרית בריכוז של 5 מ"ג/מ"ל ב-50 מ"ל של מי DI בתוספת 5 מ"ג של GNR.
    2. התסיסו את התערובת המתקבלת על ידי ממשק משתמש למשך 30 דקות ולאחר מכן השאירו את התערובת ללא הפרעה למשך 120 שעות בטמפרטורת החדר.
    3. לאחר ההבשלה, שחזרו את המשקע הלבן של ה-GNR/nHAP שנוצר על ידי צנטריפוגה ב-1398 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. שטפו את הדגימה 3x באמצעות מי DI, שימו אותה במשך 48 שעות ואחסנו את האבקה היבשה ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף.

3. אפיון nHAP, nHAP/GNR ו-GNR/nHAP

  1. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים להולכה ברזולוציה גבוהה (HRTEM) (ראה טבלת חומרים) כדי לאפיין את המורפולוגיה והגודל של הננו-קומפוזיטים11.
  2. נתחו את ההרכב היסודי של הננו-קומפוזיטים תוך שימוש בספקטרוסקופיה של פיזור אנרגיה (EDS) ובצעו מיפוי יסודי באמצעות מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק (STEM)11.
  3. בצע ספקטרוסקופיית אינפרה-אדום של התמרת פורייה (FTIR) עבור הדגימות המסודרות במספרי גלים של 500-4000 ס"מ−1 כדי לנתח את הקבוצות הכימיות בננו-קומפוזיט16.
  4. בצע ניתוח עקיפת קרני רנטגן (XRD) של nHAP מסונתז כפי שסונתז באמצעות אורך גל של קרני רנטגן של 1.5406 Å, הגדרות זרם ומתח של 40 mA ו- 40 kV, בהתאמה, ו- 2θ הנעות בין 20° ל- 90°.
  5. הערך את אחוז ההעמסה של GNR בננו-קומפוזיט באמצעות אנליזה תרמוגרווימטרית (TGA) על ידי חימום הדגימות מטמפרטורת החדר ל-1000 מעלות צלזיוס בקצב של 10 °C (74 °F) לדקה תחת זרימת חנקן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח HRTEM
בנפרד, GNRs היו מבנים דקים דמויי במבוק עם כמה כיפופים במרחק מסוים כפי שנצפה באיור 2. ה-GNR הארוך ביותר היה 1.841 מיקרומטר ואילו ה-GNR הכפוף הקטן ביותר היה 497 ננומטר. הננו-נוריבונים הראו לעתים קרובות שונות נראית לעין ברוחב שניתן לייחס לפיתול ליצירת תצורות סליליות במקומות רבים. יישור חד-כיווני כזה של GNRs עשוי לסייע בהשגת תכונות אטרקטיביות כגון תכונות מגנטיות, מוליכות או הובלת חום7.

ה-nHAPs שעברו סינתזה באמצעות סידן חנקתי טטרהידרט ודיאמוניום מימן פוספט בטמפרטורת החדר (שלב 1) היו בצורת מוט או דמויי מחט בגודל שנע בין 40 ננומטר ל-50 ננומטר (איור 3). הננו-חומרים המסונתזים נמצאו בגושים עקב צבירה וצמיחה גבישית. מצד שני, ה-nHAPs הזמינים מסחרית שבהם נעשה שימוש היו כדוריים (איור 4); ננו-כדורים אלה היו בקוטר של 50-70 ננומטר ונוכחו בצבירים בדידים של 15-20 כדורים.

nHAP הופקד באתרו על ה-GNRs (המיוצגים כ-nHAP/GNR) באסטרטגיית הקו-פונקציונליזציה (שלב 2.1). הננו-קומפוזיטים שנוצרו כתוצאה מכך של GNRs ו-nHAP כללו ננו-מבנים מחוברים נקבוביים ביותר. הדומיננטיות של nHAPs דמויי מחט המכסים את משטח ה-GNR במדבקות (איור 5) מיוחסת ל-GNR המשמשים כפיגום בעל תכונות ננו-תכונות עבור נוקלאציה של nHAP. נמצאו כתמי nHAP באורך וברוחב של בין 150 ננומטר ל-250 ננומטר (איור 5A,B). מיפוי היסודות אישר כי המדבקות הנודליות המתווכות על ה-GNRs אכן היו nHAP בשל נוכחותם של סידן יסודי וזרחן (איור 5C).

בשיטה השנייה (שלב 2.2), nHAP שנוצר מראש הוצמד ל-GNR מה שהוביל להיווצרות של nHAP מצופה GNR (המיוצג כ-GNR/nHAP, כלומר, עם כיוון הפוך בהשוואה ל-nHAP/GNR מרוכב). במקרה זה, ה-GNRs יצרו סרטים דקים על פני השטח של ננו-חלקיקי nHAP כדוריים (איור 6).

באופן מעניין, הכיפופים והפיתולציות שהבחינו בהם בשולי ה-GNR כפי שהם ניכרים באיור 2A מיוחסים בעיקר לתכונות יציבות נמוכות שעשויות היו לשפר באופן משמעותי את האינטראקציה המכנית ואת החיבור עם ה-nHAP כפי שניתן לראות באיור 5 ובאיור 6. יתר על כן, שטח הפנים הגדול של ה- GNRs הבתוליים מסייע גם בהעמסה רבה יותר של nHAP. כמו כן, ההזדקנות של התמיסות המרוכבות במשך 120 שעות הביאה להמרה מלאה של האפטיס להידרוקסיאפטיט גבישי מאוד (איור 3 ואיור 5). הקבוצות הפונקציונליות מבוססות החמצן של משטח ה-GNR מתקשרות באופן אלקטרוסטטי עם Ca2+, ומשמשות כאתר הקולטן. ניתן להשיג עוד יותר ננו-מבנים של אפטיט בשל תגובת in situ בין קטיונים מעוגנים אלה לבין יוני הפוספט (שלב 2.1). האוריינטציה של ה-nHAP המיקרו-מובנה על פני השטח של ה-GNR נשלטת על ידי מספר גורמים הכוללים את הכמות והסוג של קבוצות חמצן בתבניות מבוססות הגרפן, הריכוז היחסי של המבשרים (Ca2+ ו-HPO42-), pH של תערובת התגובה וזמן ההבשלה. ההשפעה המצטברת של תנאי התגובה הביאה לעטיפת ה-GNRs השקופים על פני השטח של הננו-ספירות nHAP, אולי בגלל ספיחה פיזית לא קוולנטית.

ניתוח ספקטרום פיזור אנרגיה (EDS)
כדי לאשר את המרכיבים העיקריים ואת ההרכב היסודי של הננו-קומפוזיטים, בוצע ניתוח ספקטרלי של פיזור אנרגיה. באיור 7A, ספקטרום ה-EDS של GNRs בתוליים הראה שיא פחמן שמתאים ל-GNRs בעוד שלא נצפו פסגות אחרות מלבד הנחושת שיוחסה לרשת ששימשה להרכבת דגימות במהלך ניתוח HRTEM. איור 7B מראה את ספקטרום ה-EDS של ננו-כדוריות nHAP שנוצרו מראש באופן מסחרי, שבהן פסגות הפחמן והנחושת מיוחסות לרשתות הנחושת מצופות הפחמן המשמשות להרכבת הדגימות במהלך ניתוח HRTEM. באיור 7C, עלייה ברורה בתכולת הפחמן יוחסה ל-GNRs, בעוד שהפסגות האחרות הספציפיות לסידן וזרחן נבעו מ-nHAP בננו-קומפוזיטים של GNR/nHAP. איור 8 מראה את ספקטרום ה-EDS של ה-nHAP המסונתז (שלב 1) (איור 8A) ו-nHAP/GNR מרוכב (איור 8B). העלייה הניכרת בתכולת הפחמן בספקטרום ה-nHAP/GNR נובעת מרוב ה-GNR שעליהם נצפו רק טלאים קטנים של nHAP מסונתז טרי.

ניתוח FTIR

הצמדה של nHAP עם GNRs אושרה באמצעות ספקטרום FTIR. איור 9 מציג את ספקטרום FTIR של nHAP, GNR, nHAP/GNR ו-GNR/nHAP. פסגת הכיפוף של ה-OH מחוץ למישור ב-600 ס"מ-1 נראית ב-FTIR של GNR12. השיא בגובה 1030 ס"מ-1, המיוחס למתיחות P-O נצפה ב-nHAP, ואישר את ההרכב הכימי שלו15. יש לציין כי שיא המתיחה האופייני ל-P-O של nHAP נמצא גם ב-nHAP/GNR וב-GNR/nHAP, מה שמעיד על נוכחות של nHAP בשני החומרים המרוכבים. שתי הפסגות האחרות, 1413 ו-1447 ס"מ-1 שנמצאו רק בחומרים המרוכבים, מיוחסות לתנודות δCH2 ולקבוצה קרבונטית (CO32−), בהתאמה, המאשרות את ההצמדה של GNR ו-nHAP16.

ניתוח עקיפת קרני רנטגן (XRD)
תבנית ה-XRD של ה-HAP (שלב 2.1) מוצגת באיור 10. הפסגות החזקות הצביעו על גבישיות טובה של החומר. מיקומי השיא היו בהסכמה טובה עם אלה שבנתונים הסטנדרטיים של ICDD (כרטיס PDF2: 00-009-0432). זה אישר עוד יותר את המבנה הגבישי המשושה (P63/m קבוצת מרחב) של nHAP, בעל ערכי פרמטרים של סריג של a = b = 0.940 ננומטר ו- c = 0.615 ננומטר. חלק מהפסגות הבולטות והחזקות ב-2θ ערכים של 25.8°, 28.2°, 31.8°, 32.9°, 34.1°, 39.7°, 43.9°, 46.6°, ו-49.4° המקבילים ל-(002), (102), (211), (300), (202), (310), (113), (222) ו-(213), בהתאמה, אישרו את טוהר המישורים המסונתזים של nHAP 16,20,21.

אנליזה תרמוגרווימטרית (TGA)
אנליזה תרמוגרווימטרית (TGA) שימשה להערכת אחוז ההעמסה במצומדים (איור 11). שלושה הפסדים בולטים במסה ניכרו במהלך ניתוח TGA. ההפסד הראשוני במסה בטמפרטורות של עד 100 מעלות צלזיוס נובע מהמים הפיזיים הלכודים. ההפסד השני בין 100 מעלות צלזיוס ל-200 מעלות צלזיוס נובע מפירוק ה-GNR לתוך פיח פחמן. הירידה המתמדת במסה לאחר מכן עד 500 מעלות צלזיוס נבעה מהתגבשות של nHAP. חימום נוסף הוביל לפירוק המתחמים. הפסד עקב נוכחות של GNR נמצא בין 0.5% ל -0.98% ב- GNR / nHAP ו- nHAP / GNR, בהתאמה. לפיכך, הוא מסכים היטב עם הניתוח הקודם שלנו שבו HAP נמצא כמרכיב העיקרי וה- GNR היו מוכווני פני שטח בתוך ה- GNR / nHAP. מצד שני, ה-GNR היו נפוצים ב-nHAP/GNR, כאשר ה-nHAP יצר טלאים בדידים על הקטעים הארוכים של ה-GNR.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי לסינתזה של מרוכבים היברידיים של גרפן ננו-הידרוקסיאפטיט בעלי אוריינטציה הפוכה: (A) nHAP/GNR ו-(B) GNR/nHAP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח מבני של GNRs: (A) ניתוח HRTEM של GNRs חשופים; (B) סריקת תמונות מצב אלקטרונים שידור (STEM) של GNRs; ו-(C) מיפוי יסודי של ה-GNRs, כאשר הצבעים אדום, ירוק, צהוב וכחול מציינים פחמן, חמצן, זרחן וסידן, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח מבני של nHAP מסונתז כפי שהוא מסונתז: (A) ניתוח HRTEM של nHAP; (B) סריקת תמונות מצב אלקטרונים (STEM) של nHAP עם סרגל קנה המידה המוגדר המייצג 100 ננומטר; ו-(C) מיפוי יסודי של ה-nHAP שבו הצבעים אדום, ירוק, צהוב וכחול מציינים פחמן, חמצן, זרחן וסידן, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח מבני של ה-nHAP הזמין באופן מסחרי מראש: (A) ניתוח HRTEM של nHAP; (B) סריקת תמונות מצב אלקטרונים שידור (STEM) של nHAP; ו-(C) מיפוי יסודי של ה-nHAP שבו הצבעים אדום, ירוק, צהוב וכחול מציינים פחמן, חמצן, זרחן וסידן, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח מבני של nHAP/GNR מסונתז על ידי אסטרטגיית הקו-פונקציונליזציה: (A) ניתוח HRTEM של nHAP/GNR; (B) סריקת תמונות מצב אלקטרונים שידור (STEM) של nHAP/GNR; ו-(C) מיפוי יסודי של nHAP/GNR שבו הצבעים אדום, ירוק, צהוב וכחול מציינים פחמן, חמצן, זרחן וסידן, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: ניתוח מבני של GNR/nHAP: (A) ניתוח HRTEM של GNR/nHAP; (B) סריקת תמונות מצב אלקטרונים שידור (STEM) של GNR/nHAP עם סרגל קנה מידה משובץ המייצג 50 ננומטר; ו-(C) מיפוי יסודי של ה-GNR/nHAP שבו הצבעים אדום, ירוק, צהוב וכחול מציינים פחמן, חמצן, זרחן וסידן, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: ניתוח EDS של הננו-קומפוזיט GNR/nHAP: (A) GNRs, (B) nHAP זמין מסחרית מראש, ו-(C) GNR/nHAP ננו-קומפוזיט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: ניתוח EDS של הננו-קומפוזיט nHAP/GNR: (A) nHAP מסונתז כפי מסונתז ו-(B) nHAP/GNR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: ניתוח FTIR של הננו-קומפוזיטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: ניתוח עקיפת קרני רנטגן (XRD) של nHAP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: אנליזה תרמוגרווימטרית של הננו-קומפוזיטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות שמתכות, פולימרים, קרמיקה ושילוביהם השונים נחקרו כשתלים אורתופדיים ואביזרי קיבוע, HAP נחשב לאחד החומרים העדיפים ביותר בשל הדמיון הכימי שלו לעצם עצמה וכתוצאה מכך ציטו-קומפטביליות גבוהה 20,21,22. במחקר זה, האוריינטציה של HAP הייתה מגוונת, מה שיכול להשפיע באופן משמעותי על תכונותיו הייחודיות, כגון קידום אוסטיאוגנזה, אוסיאו-אינטגרטיה ואוסטאו-מוליכות. יתר על כן, שינוי הכיוון של HAP יכול להשפיע על התכונות המכניות של הננו-קומפוזיטים כדי לחקות עוד יותר את זו של העצם הטבעית, שכן לעצמות ארוכות בגוף יש יישור אניזוטרופי של HA עם קולגן, בעוד שלעצמות הקובואידליות יש סידור אקראי של HA עם קולגן. יש לציין כי למרות ש- HAP טבעי הוא המרכיב העיקרי של השיניים והעצמות האנושיות, תכונותיו הפיזיקליות תלויות במידה רבה בתנאי תגובה כגון זמן התגובה, ה- pH, ריכוז הפוספט והאופי הכימי של שלב CaP23. לפיכך, במחקר זה, שיטה כימית רטובה שימשה כדי לסנתז nHAP ב pH של 10 תחת הקרנה אולטרסאונד (UI). Barbosa et al. (2013) דיווחו גם כי ממשק משתמש בשילוב עם משקעים מימיים ללא סידן היא שיטה פשוטה, מהירה ויעילה המייצרת nHAP עם גבישיות גבוהה וספציפיות18.

חשוב לציין כי ביו-חומרים הקשורים ל-HAP המיוצרים באופן מלאכותי מפגינים לעתים קרובות תכונות מכניות ירודות הכוללות שבירות פנימית, קשיחות שבר נמוכה ובלאי22. לפיכך, nHAP מחוזק כאן עם GNRs כדי להקל: (i) פונקציונליזציה של פני השטח הקשורים לננו-חלקיקים, (ii) אינטראקציות אלקטרוסטטיות בממשק בקומפלקס, ו-(iii) העברת מתח לננו-מילויים מהמטריצה של הפיגומים 24,25,26. הסינתזה הכימית הרטובה שבאה בעקבותיה הביאה ל-nHAP בתולי בעיקר בחלקיקים אציקולריים קטנים שהתאגדו לחלקיקים גדולים יותר (כ-40 ננומטר). תוצאה זו תואמת היטב את הדו"ח של Barbosa et al. (2013), שם העריכו כי ממשק המשתמש מילא תפקיד קריטי בגרימת נוקלאציה על ידי יצירת קירות בועות בסמיכות, המכונים "נקודות חמות"18,27.

מעניין לציין כי ירידה בגודל החלקיקים הן של החלקיקים המארחים והן של החלקיקים האורחים יכולה לשפר את הזרימה רק עד גבול מסוים. לאחר מכן, הפחתה נוספת בממד של החלקיק המארח עלולה להוביל לאגלומרציה שמשפיעה לרעה על יכולת הזרימה28. מלבד גרימת נוקלאציה ראשונית בתמיסה כמעט נטולת חלקיקים, ממשק המשתמש מונע רמות גבוהות של supersaturation. יתר על כן, הפחתה בתיווך ממשק משתמש בזמן שחלף בין יצירת סופר-סטורציה לבין תחילת הנוקלאציה וההתגבשות עשויה להיות המפתח באבולוציית הצורה של nHAP ובדפוס הפונקציונליזציה של ה-GNRs. ניתן לייחס את מבנה ה-nHAP/GNR להשפעה המצטברת של טמפרטורת התגובה, הלחץ הקשור עקב קריסת הבועה וגלי ההלם בנוסף לתסיסה אנרגטית מאוד הנוצרת באזורים מרוכזים מרחבית. באופן דומה, ניתן לייחס את מבנה ה-GNR/nHAP המסונתז על-ידי הוספה סימולטנית של GNR ו-nHAP בתולים בנוכחות ממשק משתמש לקצבי הקירור המקומיים המהירים הבאים המשפרים את ה-supersaturation. תוספת מקומית בלחץ יכולה גם להקטין את טמפרטורת ההתגבשות, בעוד שהמחסום שנוצר על ידי אנרגיית השפעול יכול להיות מוגבר באופן משמעותי על ידי העברת אנרגיה עקב קוויטציה במהלך פונקציונליזציה של פני השטח של GNRs18,27.

דו"ח אחד מראה כי היישום המוגזם של ממשק המשתמש (כ-30-120 דקות) במהלך הסינתזה מקטין את הגבישיות ו/או את גודלם של גבישי ה-nHAP29. זה עשוי לקבוע עוד יותר את הכיוון של הפונקציונליזציה כפי שנצפה במחקר שלנו. אפילו במחקר זה, התוצאות הראו כי ממשק משתמש לזמן חשיפה ארוך יחסית (30 דקות) במהלך הסינתזה של nHAP הוביל לתצהיר nHAP על GNRs. מצד שני, ממשק משתמש במשך 30 דקות עם nHAP ו- GNRs שנוצרו מראש הובילו לתצהיר של GNRs על nHAPs כדוריים. לפיכך, שיטה זו אידיאלית לייצור בקנה מידה גדול של nHAP כדי להשיג מרוכבים משולבים GNR לייצור פיגומים30,31. חומרים מרוכבים חדשניים כאלה בעלי אוריינטציה הפוכה עם תכונות מכניות מעולות יכולים להיות משמעותיים להנדסת רקמות עצם. בפרט, Fan et al. (2014) דיווחו כי החדרת גרפן יכולה לשפר באופן משמעותי את הקשיות ואת המודולוס של יאנג של nHAP אשר בתורו מפגין אוסיאונטגרציה גבוהה יותר עם העצם הסובבת (כלומר, תאימות ביולוגית מעולה), בהשוואה לגרפן בתולי ו- nHAP, בנפרד32. לפיכך, ננו-קומפוזיטים המורכבים מ-GNRs ו-nHAP עם תכונות מכניות מעולות והתאמה ביולוגית יכולים להיות ביו-חומרים מבטיחים עבור יישומים אורתופדיים רבים 33,34,35.

עם זאת, האתגר העיקרי בייצור של ננו-היברידים עם כיוונים מנוגדים הוא שיש להקפיד על פרמטרי התגובה כדי לקבל את הכיוון הרצוי של ננו-קומפוזיטים36,37. יתר על כן, באסטרטגיית הקו-פונקציונליזציה, פחות כמויות של nHAP בצורת מחט הופקדו על ה- GNRs, מה שיכול להפחית את הפוטנציאל שלהם להתחדשות רקמת העצם ולחוזק מכני. הצורות של ה-nHAP בשתי השיטות שונות, מה שיכול להשפיע באופן משמעותי על כמות האוסטיאוגנזה ולכן לגרום לתכונות שונות הרלוונטיות ליישומים ביו-רפואיים.

לסיכום, כאן, סינתזנו ננו-קומפוזיטים המורכבים מ-GNRs ו-nHAP עם סידורים מרחביים מנוגדים שעשויים להיות להם יישומים פוטנציאליים באורתופדיה. התוצאות הראו כי המורפולוגיה והפונקציונאליזציה של nHAP (כלומר, האם פונקציונליזציה מתרחשת לאחר סינתזה או במקביל לסינתזת nHAP) קבעו את הכיוון של nHAP ו- GNRs בננו-קומפוזיטים. פונקציונליזציה משותפת במהלך הסינתזה הביאה ל-nHAP/GNRs, בעוד שפונקציונאליזציה עם nHAP שנוצר מראש הביאה ל-GNRs/nHAP. ננו-קומפוזיטים אלה עשויים להיות ישימים לפיתוח פיגומים לקידום אוסטאוגנזה, ולכן יש להם הבטחה משמעותית בננו-רפואה רגנרטיבית המצדיקה את המשך מחקרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

ד"ר סוגטה גוש מודה למחלקה למדע וטכנולוגיה (DST), למשרד המדע והטכנולוגיה, לממשלת הודו ולמרכז ג'וואהרלאל נהרו למחקר מדעי מתקדם, הודו על מימון במסגרת מלגת פוסט-דוקטורט בחו"ל בננו מדע וטכנולוגיה (Ref. JNC/AO/A.0610.1(4) 2019-2260 מיום 19 באוגוסט 2019). ד"ר סוגטה גוש מודה לאוניברסיטת קסטסארט בבנגקוק, תאילנד על מלגת פוסט-דוקטורט ומימון במסגרת תוכנית האוניברסיטה להמצאה מחדש (Ref. No. 6501.0207/10870 מיום 9 בנובמבר 2021). המחברים מבקשים להודות למתקן הננו-אפיון המתקדם של קוסטאס (KANCF) על הסיוע בניסויי האפיון. KANCF הוא מתקן מחקר וחינוך רב-תחומי משותף בתוך מכון המחקר קוסטאס (KRI) באוניברסיטת נורת'איסטרן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 216003-100G Synthesis
Calcium nitrate tetrahydrate Sigma-Aldrich 237124 Synthesis
Centrifuge Hettich EBA 200S Recovery
Fourier transform infrared spectrometer Brucker Vertex 70 Characterization
Graphene nanoribbon Sigma-Aldrich 922714 Synthesis
High resolution transmission electron microscope Thermo Fisher Scientific Themis Titan 300 Characterization
Magnetic stirrer IKA C-MAG HS7 S68 Functionalization
Micropipettes TreffLab 06H35687 Reagent preparation
pH meter Eutech pH5+ ECPH503PLUSK Reagent preparation
Thermogravimetric analyzer TA Instruments SDT Q600 Characterization
Ultrasonic bath Bandelin DT100 Functionalization
Universal Oven Memmert UF55 Functionalization
Weighing balance Precisa XB220A Reagent preparation
X-ray diffractometer Brucker D8-Advanced Characterization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Novoselov, K. S., et al. Electric field effect in atomically thin carbon films. Science. 306 (5696), 666-669 (2004).
  2. Novoselov, K. S., et al. Unconventional quantum Hall effect and Berry's phase of 2π in bilayer graphene. Nature Physics. 2 (3), 177-180 (2006).
  3. Zhang, Y. B., Tan, Y. W., Stormer, H. L., Kim, P. Experimental observation of the quantum Hall effect and Berry's phase in graphene. Nature. 438 (7065), 201-204 (2005).
  4. Ozyilmaz, B., et al. Electronic transport and quantum hall effect in bipolar Graphene p−n−p junctions. Physical Review Letters. 99 (16-19), 166804 (2007).
  5. Morozov, S. V., et al. Giant intrinsic carrier mobilities in graphene and its bilayer. Physical Review Letters. 100 (1-11), 016602 (2008).
  6. Han, M., Ozyilmaz, B., Zhang, Y., Jarillo-Herero, P., Kim, P. Electronic transport measurements in graphene nanoribbons. Physica Status Solidi B: Basic Solid State Physics. 244 (11), 4134-4137 (2007).
  7. Talyzin, A. V., et al. Synthesis of graphene nanoribbons encapsulated in single-walled carbon nanotubes. Nano Letters. 11 (10), 4352-4356 (2011).
  8. Allen, M. J., Tung, V. C., Kaner, R. B. Honeycomb carbon: A review of graphene. Chemical Reviews. 110 (1), 132-145 (2010).
  9. Ghosh, S., Webster, T. J. Metallic nanoscaffolds as osteogenic promoters: Advances, challenges and scope. Metals. 11 (9), 1356 (2021).
  10. Ghosh, S., Webster, T. J. Mesoporous silica based nanostructures for bone tissue regeneration. Frontiers in Materials. 8, 213 (2021).
  11. Medeiros, J. S., et al. Nanohydroxyapatite/graphene nanoribbons nanocomposites induce in vitro osteogenesis and promote in vivo bone neoformation. ACS Biomaterials Science and Engineering. 4 (5), 1580-1590 (2018).
  12. Faniyi, I. O., et al. The comparative analyses of reduced graphene oxide (RGO) prepared via green, mild and chemical approaches. SN Applied Sciences. 1 (10), 1-7 (2019).
  13. Neelgund, G. M., Oki, A., Luo, Z. In situ deposition of hydroxyapatite on graphene nanosheets. Materials Research Bulletin. 48 (2), 175-179 (2013).
  14. Rajkumar, M., Sundaram, N. M., Rajendran, V. Preparation of size controlled, stoichiometric and bioresorbable hydroxyapatite nanorod by varying initial pH, Ca/P ratio and sintering temperature. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 6 (1), 169-179 (2011).
  15. Mondal, S., et al. Hydroxyapatite coated iron oxide nanoparticles: A promising nanomaterial for magnetic hyperthermia cancer treatment. Nanomaterials. 7 (12), 426 (2017).
  16. Oliveira, F. C., et al. High loads of nano-hydroxyapatite/graphene nanoribbon composites guided bone regeneration using an osteoporotic animal model. International Journal of Nanomedicine. 14, 865-874 (2019).
  17. Murugan, N., Sundaramurthy, A., Chen, S. -M., Sundramoorthy, A. K. Graphene oxide/oxidized carbon nanofiber/mineralized hydroxyapatite based hybrid composite for biomedical applications. Materials Research Express. 4 (12), 124005 (2017).
  18. Barbosa, M. C., Messmer, N. R., Brazil, T. R., Marciano, F. R., Lobo, A. O. The effect of ultrasonic irradiation on the crystallinity of nano-hydroxyapatite produced via the wet chemical method. Materials Science and Engineering C. 33 (5), 2620-2625 (2013).
  19. Rodrigues, B. V. M., et al. Graphene oxide/multi-walled carbon nanotubes as nanofeatured scaffolds for the assisted deposition of nanohydroxyapatite: characterization and biological evaluation. International Journal of Nanomedicine. 11, 2569-2585 (2016).
  20. Sharma, M., Nagar, R., Meena, V. K., Singh, S. Electro-deposition of bactericidal and corrosion-resistant hydroxyapatite nanoslabs. RSC Advances. 9 (20), 11170-11178 (2019).
  21. Kamrujjaman, M., Khandaker, J. I., Haque, M. M., Rahman, M. O., Rahman, M. M. Study of the dependency of pH values on HAp synthesis. Journal of Nanomaterials & Molecular Nanotechnology. 7, 4 (2019).
  22. Baradaran, S., et al. Mechanical properties and biomedical applications of a nanotube hydroxyapatite-reduced graphene oxide composite. Carbon. 69, 32-45 (2014).
  23. Sassoni, E. Hydroxyapatite and other calcium phosphates for the conservation of cultural heritage: A review. Materials. 11 (4), 557 (2018).
  24. Tang, H., Ehlert, G. J., Lin, Y., Sodano, H. A. Highly efficient synthesis of graphene nanocomposites. Nano Letters. 12 (1), 84-90 (2012).
  25. Walker, L. S., Marotto, V. R., Rafiee, M. A., Koratkar, N., Corral, E. L. Toughening in graphene ceramic composites. ACS Nano. 5 (4), 3182-3190 (2011).
  26. Rafiee, M. A., et al. Enhanced mechanical properties of nanocomposites at low graphene content. ACS Nano. 3 (12), 3884-3890 (2009).
  27. Luque de Castro, M. D., Priego-Capote, F. Ultrasound-assisted crystallization (sonocrystallization). Ultrasonics Sonochemistry. 14 (6), 717-724 (2007).
  28. Azhari, A., Toyserkani, E. Additive manufacturing of graphene-hydroxyapatite nanocomposite structures. International Journal of Applied Ceramic Technology. 12 (1), 8-17 (2015).
  29. Li, H., Wang, J., Bao, Y., Guo, Z., Zhang, M. Rapid sonocrystallization in the salting-out process. Journal of Crystal Growth. 247 (1-2), 192-198 (2003).
  30. Zou, Z., Lin, K., Chen, L., Chang, J. Ultrafast synthesis and characterization of carbonated hydroxyapatite nanopowders via sonochemistry-assisted microwave process. Ultrasonics Sonochemistry. 19 (6), 1174-1179 (2012).
  31. Rouhani, P., Taghavinia, N., Rouhani, S. Rapid growth of hydroxyapatite nanoparticles using ultrasonic irradiation. Ultrasonics Sonochemistry. 17 (5), 853-856 (2010).
  32. Fan, Z., et al. One-pot synthesis of graphene/hydroxyapatite nanorod composite for tissue engineering. Carbon. 66, 407-416 (2014).
  33. Ghosh, S., Mostafavi, E., Thorat, N., Webster, T. J. Nanobiomaterials for three- dimensional bioprinting. Nanotechnology in Medicine and Biology. Liu, H., Shokuhfar, T., Ghosh, S. , Elsevier. 1-24 (2021).
  34. Ghosh, S., Sanghavi, S., Sancheti, P. Metallic biomaterial for bone support and replacement. Fundamental Biomaterials: Metals. Vol 2. Woodhead Publishing Series in Biomaterials. Balakrishnan, P., Sreekala, P., Thomas, S. , Woodhead Publishing. 139-165 (2018).
  35. Hazra, A., Basu, S. Graphene nanoribbon as potential on-chip interconnect material-A Review. C Journal of Carbon Research. 4 (3), 49 (2018).
  36. Zanin, H., et al. Fast preparation of nano-hydroxyapatite/superhydrophilic reduced graphene oxide composites for bioactive applications. Journal of Materials Chemistry B. 1 (38), 4947-4955 (2013).
  37. Lobo, A. O., et al. Fast preparation of hydroxyapatite/superhydrophilic vertically aligned multiwalled carbon nanotube composites for bioactive application. Langmuir. 26 (23), 18308-18314 (2010).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 185 ננו-רפואה ננו-נוריבונים של גרפן הידרוקסיאפטיט כיוון הפוך פיגומים
סינתזה של ננו-קומפוזיטים של גרפן-הידרוקסיאפטיט לשימוש פוטנציאלי בהנדסת רקמות עצם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghosh, S., Bhagwat, T., Kitture, R., … More

Ghosh, S., Bhagwat, T., Kitture, R., Thongmee, S., Webster, T. J. Synthesis of Graphene-Hydroxyapatite Nanocomposites for Potential Use in Bone Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (185), e63985, doi:10.3791/63985 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter