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Neuroscience

कार्यात्मक अध्ययन के लिए मानव सिनैप्टिक रिसेप्टर्स को पुन: सक्रिय करने के लिए सिनैप्टिक झिल्ली का माइक्रोट्रांसप्लांटेशन

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64024
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल दर्शाता है कि ज़ेनोपस लेविस ओओसाइट्स में सिनैप्टिक झिल्ली के माइक्रोट्रांसप्लांटेशन का प्रदर्शन करके, α-एमिनो-3-हाइड्रॉक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोक्साज़ोलेप्रोपियोनिक एसिड और γ-एमिनोब्यूट्रिक एसिड रिसेप्टर्स की सुसंगत और विश्वसनीय प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करना संभव है।

Abstract

उत्तेजक और निरोधात्मक आयनोट्रोपिक रिसेप्टर्स आयन प्रवाह के प्रमुख द्वार हैं जो शारीरिक न्यूरोनल संचार के दौरान सिनैप्स की गतिविधि को निर्धारित करते हैं। इसलिए, अन्य अन्तर्ग्रथनी तत्वों के साथ उनकी बहुतायत, कार्य और संबंधों में परिवर्तन को मस्तिष्क समारोह में परिवर्तन और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों और मानसिक विकारों में संज्ञानात्मक हानि के एक प्रमुख सहसंबंध के रूप में देखा गया है। यह समझना कि उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर्स के कार्य को बीमारी से कैसे बदल दिया जाता है, प्रभावी उपचारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। रोग-प्रासंगिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स की विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करना महत्वपूर्ण है जो रोगग्रस्त मानव मस्तिष्क में कार्यात्मक रहते हैं। अब तक यह रिसेप्टर्स के कार्य में रोग संबंधी परिवर्तनों का आकलन करने के लिए निकटतम दृष्टिकोण है। इस काम में, सिनैप्टिक झिल्ली के माइक्रोट्रांसप्लांटेशन करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत की जाती है, जिसमें मानव रिसेप्टर्स युक्त स्नैप जमे हुए मानव मस्तिष्क के ऊतकों से सिनैप्टिक झिल्ली को फिर से सक्रिय करना शामिल है, इसके इंजेक्शन और पीछे के संलयन द्वारा ज़ेनोपस लेविस ओओसाइट्स की झिल्ली में। प्रोटोकॉल α-एमिनो-3-हाइड्रॉक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोक्साज़ोलेप्रोपियोनिक एसिड (एएमपीए) और γ-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीए) रिसेप्टर्स की सुसंगत और विश्वसनीय प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए पद्धतिगत रणनीति भी प्रदान करता है, साथ ही उपन्यास विस्तृत तरीके जो सामान्यीकरण और कठोर डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाते हैं।

Introduction

न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार आबादी के एक बड़े प्रतिशत को प्रभावित करते हैं। यद्यपि उनके विनाशकारी परिणाम अच्छी तरह से ज्ञात हैं, न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के कार्यात्मक परिवर्तनों के बीच की कड़ी, जो मस्तिष्क समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, और उनके रोगसूचकता अभी भी खराब समझ में आती है। अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता, रोग की पुरानी प्रकृति, और लक्षणों की कपटी शुरुआत कुछ ऐसे कारण हैं जिन्होंने कई मस्तिष्क विकारों की समझ में देरी की है जहां रासायनिक असंतुलन अच्छी तरह से प्रलेखित हैं 1,2. पशु मॉडल ने अमूल्य जानकारी उत्पन्न की है और विकासवादी संरक्षित प्रणालियों में शरीर विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार किया है; हालांकि, कृन्तकों और मनुष्यों के बीच कई अंतर-प्रजातियां पशु मॉडल से मानव मस्तिष्क तक रिसेप्टर फ़ंक्शन के प्रत्यक्ष एक्सट्रपलेशन को रोकतीहैं 3. इस प्रकार, देशी मानव रिसेप्टर्स का अध्ययन करने के प्रारंभिक प्रयासरिकार्डो मिलेदी की प्रयोगशाला द्वारा शल्य चिकित्सा द्वारा हटाए गए ऊतक और जमे हुए नमूनों का उपयोग करके विकसित किए गए थे। इन प्रारंभिक प्रयोगों में पूरे झिल्ली का उपयोग किया गया था जिसमें न्यूरोनल सिनैप्टिक और अतिरिक्त सिनैप्टिक रिसेप्टर्स के साथ-साथ गैर-न्यूरोनल न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स शामिल हैं, और हालांकि वे रोगग्रस्त राज्यों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं, एक चिंता है कि रिसेप्टर्स का मिश्रण डेटा 4,5,6,7 की व्याख्या को जटिल करता है। महत्वपूर्ण रूप से, सिनैप्स कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों 8,9 में प्रमुख लक्ष्य हैं; इसलिए, प्रभावित सिनैप्स के कार्यात्मक गुणों का परीक्षण करने के लिए परख सिनैप्टिक संचार को प्रभावित करने वाले रोग-प्रासंगिक परिवर्तनों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए मौलिक हैं। यहां, मूल विधि के एक संशोधन का वर्णन किया गया है: सिनैप्टिक झिल्ली (एमएसएम) का माइक्रोट्रांसप्लांटेशन, जो समृद्ध सिनैप्टिक प्रोटीन तैयारी के शारीरिक लक्षण वर्णन पर केंद्रित है और चूहे और मानव सिनैप्टोसोम 10,11,12,13,14,15 का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है . इस पद्धति के साथ, सिनैप्टिक रिसेप्टर्स को प्रत्यारोपित करना संभव है जो एक बार मानव मस्तिष्क में काम कर रहे थे, अपने स्वयं के मूल लिपिड में एम्बेडेड और संबंधित प्रोटीन के अपने स्वयं के समूह के साथ। इसके अलावा, क्योंकि एमएसएम डेटा मात्रात्मक है, इसलिए बड़े प्रोटिओमिक या अनुक्रमण डेटासेट10 के साथ एकीकृत करने के लिए इस डेटा का उपयोग करना संभव है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सिनैप्टिक रिसेप्टर्स के कई औषधीय और बायोफिजिकल विश्लेषण पुनः संयोजक प्रोटीन16,17 पर किए जाते हैं। हालांकि यह दृष्टिकोण रिसेप्टर्स के संरचना-कार्य संबंधों में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, यह न्यूरॉन्स में पाए जाने वाले जटिल मल्टीमेरिक रिसेप्टर परिसरों और बीमारी में उनके परिवर्तनों के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकता है। इसलिए, देशी और पुनः संयोजक प्रोटीन का संयोजन सिनैप्टिक रिसेप्टर्स का अधिक व्यापक विश्लेषण प्रदान करना चाहिए।

सिनैप्टोसोम10,11,12,13,14,15 तैयार करने के कई तरीके हैं जिन्हें प्रयोगशाला की आवश्यकताओं के लिए समायोजित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल इस धारणा के साथ शुरू होता है कि सिनैप्टोसोमल समृद्ध तैयारी अलग-थलग थी और माइक्रोट्रांसप्लांटेशन प्रयोगों के लिए संसाधित होने के लिए तैयार हैं। प्रयोगशाला में, निर्माता निर्देशों का पालन करते हुए सिन-प्रति विधि का उपयोग किया जाता है। यह इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों10,11 में उच्च प्रजनन क्षमता के कारण किया जाता है। ज़ेनोपस ओओसाइट्स18,19 को अलग करने के तरीके को समझाते हुए प्रचुर मात्रा में साहित्य भी है, जिसे इंजेक्शन20 के लिए तैयार भी खरीदा जा सकता है।

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Protocol

सभी शोध संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए जाते हैं और कैलिफोर्निया इरविन विश्वविद्यालय (आईएसीयूसी-1998-1388) और टेक्सास मेडिकल ब्रांच विश्वविद्यालय (आईएसीयूसी -1803024) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए जाते हैं। कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय इरविन अल्जाइमर रोग अनुसंधान केंद्र (यूसीआई-एडीआरसी) द्वारा एक गैर-अल्जाइमर रोग (एडी) मस्तिष्क (महिला, 74 वर्ष, पोस्टमॉर्टम अंतराल 2.8 घंटे) और एक एडी-मस्तिष्क (महिला, 74 वर्ष, पोस्टमॉर्टम अंतराल 4.5 घंटे) से अस्थायी प्रांतस्था प्रदान की गई थी। मस्तिष्क दान के लिए सूचित सहमति यूसीआई-एडीआरसी द्वारा प्राप्त की गई थी।

नोट: अनफिक्स्ड मानव मस्तिष्क के ऊतकों को रक्त जनित रोगजनकों (बीबीपी) के स्रोत के रूप में माना जाना चाहिए। तदनुसार, प्रयोग शुरू करने से पहले बीबीपी प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल बीएसएल 2 आवश्यकताओं के तहत जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल 2) प्रयोगशाला में किया जाता है। प्रयोगशाला के भीतर दिशानिर्देशों और सावधानियों में शामिल हैं: प्रयोगशाला में कोई भोजन या पेय की अनुमति नहीं है, अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं का पालन किया जाना चाहिए, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (दस्ताने, गाउन, कोई खुले पैर के जूते) की आवश्यकता नहीं है, और दरवाजा हर समय बंद होना चाहिए।

1. ज़ेनोपस ओओसाइट माइक्रोइंजेक्शन तैयारी

  1. इंजेक्शन सुई बनाने के लिए, माइक्रोपिपेट खींचने वाले का उपयोग करके 3.5 इंच बोरोसिलिकेट ट्यूब खींचें। एक बार माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को खींचने के बाद, सुई की नोक को काटने के लिए एक माइक्रोस्कोप और एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें ताकि माइक्रोइंजेक्शन किया जा सके (आमतौर पर 2-3 मिमी के बीच)।
    नोट: काटने के लिए सुई की नोक की लंबाई अलग-अलग हो सकती है।
  2. 200 मिलीलीटर बार्थ के स्टॉक सॉल्यूशन (5एक्स) को 800 एमएल डिस्टिल्ड वॉटर में जोड़कर 1एक्स बार्थ का घोल तैयार करें। 18 डिग्री सेल्सियस 1x बार्थ के समाधान के साथ एक 24-अच्छी तरह से, फ्लैट नीचे टिशू कल्चर प्लेट भरें।
    1. निम्नानुसार 5x बार्थ का स्टॉक समाधान तैयार करें। आसुत जल के 1 एल में, 25.71 ग्राम एनएसीएल (सोडियम क्लोराइड), 0.372 ग्राम केसीएल (पोटेशियम क्लोराइड), 0.301 ग्राम सीएसीएल2 (कैल्शियम डाइक्लोराइड),0.389 ग्राम सीए (एनओ 3)2(4 एच2ओ) (कैल्शियम नाइट्रेट टेट्राहाइड्रेट), एमजीएसओ4 (7 एच 2 ओ) (मैग्नीशियम सल्फेट हेप्टा) का 1.01 ग्राम जोड़ें और 11.91 ग्राम एचईपीईएस (4-(2-हाइड्रॉक्सीथिल) -1-पिपराज़िनेथेनेसल्फोनिक एसिड)।
  3. 18,19 में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके और 2एक्स आवर्धित स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके ज़ेनोपस ओओसाइट्स को अलग करें, स्वस्थ दिखने, चरण वी-6 ओओसाइट्स का चयन करें। प्रति अच्छी तरह से लगभग 10 ओओसाइट्स रखें और रिकॉर्डिंग करते समय नियंत्रण कोशिकाओं के रूप में उपयोग किए जाने वाले गैर-इंजेक्शन वाले ओओसाइट्स को घर देने के लिए कुओं में से एक का उपयोग करें।
  4. एक छोटा पेट्री डिश, 1 सेमी लंबा और 6 सेमी व्यास प्राप्त करें, और नायलॉन जाल को अंदर रखें ताकि यह पकवान के नीचे कवर करे। फिर, ओओसाइट्स के माइक्रोइंजेक्शन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले 1 एक्स बार्थ के समाधान के 15 एमएल डालें।
  5. माइक्रोस्कोप प्लेटफ़ॉर्म की मध्य रेखा के साथ एक नैनोइंजेक्टर रखें। चुंबक को बंद स्थिति में घुमाएं और धीरे-धीरे नैनोइंजेक्टर को सावधानीपूर्वक समर्थन करते हुए वांछित स्थिति में ले जाएं। जब नैनोइंजेक्टर ठीक से तैनात हो जाता है, तो चुंबक को पूरी तरह से चालू स्थिति में वापस कर दें और सुनिश्चित करें कि यह सुरक्षित है।
  6. 50.6 एनएल के नमूना आकार के लिए, नैनोइंजेक्टर के किनारे निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: 1 डी (डाउन), 2 डी है, 3 यू (अप), 4 डी है, और 5 यू है माइक्रोस्कोप स्टैंड पर सेल्फ-सीलिंग थर्माप्लास्टिक, या माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब कैप का एक टुकड़ा रखें, इसे नैनोइंजेक्टर के प्रक्षेपवक्र के साथ संरेखित करें।
    नोट: 50 एनएल इंजेक्शन सामग्री की अधिकतम मात्रा के पास है जो साइटोप्लाज्म21 का सामना कर सकता है।
  7. खनिज तेल (लगभग 0.5 एमएल / सीसी) के साथ इसकी आधी मात्रा के बारे में इंसुलिन सिरिंज भरें। इस सिरिंज का उपयोग करके, खनिज तेल के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई भरें। सुनिश्चित करें कि सुई की नोक पर तेल का एक दृश्य मनका देखा जाता है।
  8. नैनोइंजेक्टर प्लंजर को कम से कम 1-2 सेमी तक उजागर करें। खाली बटन को दबाकर ऐसा करें जब तक कि प्लंजर वांछित लंबाई पर दिखाई न दे। एक बार प्लंजर उजागर होने के बाद, धीरे-धीरे और सावधानी से खनिज तेल से भरे माइक्रोइंजेक्शन ग्लास सुई को नैनोइंजेक्टर प्लंजर पर रखें, और सुनिश्चित करें कि यह काले प्रतिरोध ओ-रिंग के माध्यम से अच्छी तरह से फिट बैठता है और सफेद प्रतिरोध अंगूठी पर रुक जाता है। सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया में नैनोइंजेक्टर प्लंजर को मोड़ना नहीं है।
  9. एक बार जब माइक्रोइंजेक्शन ग्लास सुई सुरक्षित और जगह में होती है, तो किसी भी संभावित हवा के बुलबुले को शून्य करने के लिए खाली दबाएं। धीरे से, एक पेपर ऊतक के साथ, अतिरिक्त खनिज तेल को साफ करें।

2. नमूना लोड हो रहा है

  1. 10,11,12,13,14,15 में वर्णित ब्याज के मानव मस्तिष्क क्षेत्र से सिनैप्टोसोमल समृद्ध तैयारी (नमूने) तैयार करें, और उन्हें इंजेक्शन के क्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 5 μL के विभाज्य में स्टोर करें।
  2. इंजेक्शन से पहले, विभाज्य को गीली बर्फ में स्थानांतरित करें और इसे सोनिकेशन और पुनर्प्राप्ति को छोड़कर हर समय बर्फ पर रखें। नमूनों की संख्या और प्रकार प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा निर्धारित किए जाएंगे।
  3. नमूना के गर्म होने से बचने के लिए फ्लोटिंग गीली बर्फ के साथ स्नान में चयनित नमूनों को 3x सोनीकेट करें। चक्रों के बीच में गीली बर्फ पर 1 मिनट प्रतीक्षा करते हुए, हर बार 5 एस चक्रों का उपयोग करें।
  4. थर्माप्लास्टिक पर नमूने के 1 μL रखें। नमूना के आंदोलन को रोकने के लिए नमूना प्लेसमेंट से पहले, यदि आवश्यक हो, तो सतह में एक इंडेंटेशन बनाएं।
  5. सुई की स्थिति के लिए नैनोइंजेक्टर को पकड़ने वाले मैनिपुलेटर के घुंडी का उपयोग करें और इसे भरने के लिए नमूने की ओर ले जाएं। एक बार सुई टिप नमूने में है, प्रेस और भरण बटन दबाए रखें जब तक पर्याप्त नमूना लिया जाता है। 10 ओओसाइट्स के लिए लगभग 0.5 μL की आवश्यकता होती है। घुंडी का उपयोग करके, नैनोइंजेक्टर की सुई को उच्चतम स्थिति में वापस ले जाएं।

3. ओओसाइट्स को इंजेक्ट करना

नोट: मानकीकृत चूहे प्रांतस्था सिनैप्टोसोमल झिल्ली को ओओसाइट्स के विभिन्न बैचों के बीच संलयन क्षमता में परिवर्तन को मापने के लिए ओओसाइट्स के एक सेट में सभी प्रयोगों में भी इंजेक्ट किया जाता है।

  1. चयनित ओओसाइट्स को छोटे पेट्री डिश पर रखें जिसमें फिट नायलॉन जाल और बार्थ का समाधान (लगभग 10 ओओसाइट्स) है। ओओसाइट्स को व्यवस्थित करें ताकि वे एक दूसरे के ऊपर न हों; यह इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान सहायक होगा।
  2. नैनोइंजेक्टर को पकड़ने वाले मैनिपुलेटर पर घुंडी का उपयोग करके, सुई को ओओसाइट्स की ओर ले जाएं। एक बार जब सुई बार्थ के समाधान में डूब जाती है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए नैनोइंजेक्टर के लिए पैर पेडल का उपयोग करें कि माइक्रोइंजेक्शन सुई नमूना जारी कर रही है। यदि नमूना जारी किया जा रहा है तो यह माइक्रोस्कोप दृश्य से दिखाई देगा।
  3. एक बार जब यह आत्मविश्वास से स्थापित हो जाता है कि नमूना जारी किया जा रहा है, तो ओओसाइट को माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए आगे बढ़ें। यदि नमूना जारी नहीं किया जा रहा है, तो सुई भरने की प्रक्रिया को दोहराएं।
  4. सुई के साथ सतह के ठीक नीचे ओओसाइट में प्रवेश करें, कोई गहरा नहीं है, और नमूना इंजेक्ट करने के लिए पैर पेडल का उपयोग करें। नमूना जारी होने पर पैर पेडल एक बीप ध्वनि कर देगा। 2-3 सेकंड के बारे में प्रतीक्षा करें। यदि इंजेक्शन सफल रहा, तो सेल का विस्तार होगा। एक बार ऐसा होने के बाद, सेल से बाहर निकलने के लिए मैनिपुलेटर पर घुंडी का उपयोग करें।
    नोट: ओओसाइट में झिल्ली का संलयन एक ध्रुवीकृत प्रक्रिया है; इसलिए, ओओसाइट को कोशिका के पशु पक्ष में इंजेक्ट किया जाना चाहिए, अधिमानतः भूमध्य रेखा के ऊपर, झिल्ली संलयन को अधिकतम करने के लिए पशु पक्ष की ओर सुई के कोण के साथ।
  5. पेट्री डिश को स्थानांतरित करें ताकि अगला ओओसाइट सुई के साथ गठबंधन हो और इस प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि डिश में सभी ओओसाइट्स इंजेक्ट नहीं हो जाते। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि ओओसाइट्स की वांछित संख्या इंजेक्ट नहीं हो जाती। सुनिश्चित करें कि ओओसाइट्स का एक कुआं नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए गैर-इंजेक्शन छोड़ दिया गया है।
  6. एक बार जब सभी ओओसाइट्स इंजेक्ट हो जाते हैं, तो नैनोइंजेक्टर को अपनी मूल स्थिति में वापस ले लें और सुई को हटा दें।

4. दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप का उपयोग करके आयन धाराओं की रिकॉर्डिंग

  1. दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप (टीईवीसी) इलेक्ट्रोड सुइयों को बनाने के लिए, माइक्रोपिपेट खींचने वाले का उपयोग करके 15 सेमी लंबी आग पॉलिश बोरोसिलिकेट ग्लास ट्यूब खींचें। एक बार खींचना पूरा हो जाने के बाद, लंबी केशिका सुइयों का उपयोग करके 3 एम केसीएल से भरें, या वैकल्पिक रूप से, एक निरंतर वैक्यूम के तहत 15 मिनट के लिए 3 एम केसीएल समाधान में सुइयों को डुबोएं और उबालें। उच्च तापमान इलेक्ट्रोड को भरने और हवा के बुलबुले को हटाने में मदद करता है।
    1. क्रिस्टलीय रूप और विआयनीकृत पानी में केसीएल का उपयोग करके 3 एम केसीएल इलेक्ट्रोड भरण समाधान तैयार करें, और इन चरणों का सावधानीपूर्वक पालन करें ताकि इलेक्ट्रोड की संदर्भ क्षमता न बदले। केसीएल को 2-3 घंटे के लिए ओवन में सावधानीपूर्वक सुखाएं। एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक 223.68 ग्राम केसीएल का वजन करें केसीएल को 1 एल कांच की बोतल में स्थानांतरित करें। चांदी इलेक्ट्रोड तारों को क्लोरीनेट करने के लिए इस समाधान का उपयोग करें।
      नोट: ग्लास इलेक्ट्रोड खींचने के लिए, पिपेट कुकबुक यहां डाउनलोड किया जा सकता है: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf।
  2. आयन धाराओं की रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को चालू करें: मुख्य सिस्टम, समाधान वाल्व, माइक्रोस्कोप प्रकाश, वाल्व सिस्टम, ओओसाइट क्लैंप और वैक्यूम सिस्टम। डेस्कटॉप कंप्यूटर चालू करें, WinEDR V3.9.1 में लॉग इन करें., और सुनिश्चित करें कि प्रोग्राम चल रहा है और सेटअप मान निम्नानुसार सही हैं: डिस्क पर रिकॉर्ड करें, रिकॉर्डिंग अवधि सेट करें, और सिम्युलेटर विकल्प साफ़ करें।
    1. एम्पलीफायर के लिए निम्नलिखित प्रारंभिक सेटअप मान प्रदान करें: वोल्टेज इलेक्ट्रोड (वीएम) अनुभाग के लिए, नकारात्मक क्षमता मुआवजा (-सी) बंद करें; स्नान इलेक्ट्रोड (आईएम) अनुभाग के लिए, लाभ चयनकर्ता स्विच (0.1 से 10 तक की सीमा) को 10 पर सेट करें, और तीन-स्थिति टॉगल स्विच जो लाभ गुणक (x0.1, x1.0 और x10) का चयन करता है, x1.0 पर। एलईडी रोशनी लाभ गुणक चयन का संकेत देगी; क्लैंप अनुभाग के लिए, क्लैंप मोड चयनकर्ता को बंद करें, डीसी लाभ नियंत्रण को आईएन पर सेट करें, और लाभ नियंत्रण पूर्ण-बैंडविड्थ ओपन-लूप (रेंज 0 से 2000) लगभग 1200 तक; कमांड के लिए, 40 एमवी पर सेट करें और एक्स 2 में होने के लिए होल्ड कंट्रोल नकारात्मक और स्केल गुणक सेट करें; वर्तमान इलेक्ट्रोड के लिए, ओओसाइट को इम्पाल करने से पहले शून्य संदर्भ स्थापित करने के लिए वी ऑफसेट का उपयोग करें।
    2. रिकॉर्ड करने के लिए, WinEDR V3.9.1 सॉफ़्टवेयर खोलें, शीर्ष मेनू पर जाएँ, और फ़ाइल > नई फ़ाइल खोलें का चयन करें। अपना खुद का फ़ोल्डर बनाएं और फ़ाइल सहेजें।
    3. अगला, मुख्य मेनू में रिकॉर्ड > रिकॉर्ड टू डिस्क का चयन करें। जब दो इलेक्ट्रोड ऊक्टाइट के अंदर होते हैं, तो वीसी -8 वाल्व नियंत्रक में रिंगर चालू करें, और क्लैंप को ओसी -725 सी एम्पलीफायर में धीमा कर दें। फिर, WinEDR सॉफ़्टवेयर पर वापस जाएं और स्क्रीन के ऊपरी बाईं ओर रिकॉर्ड का चयन करें।
    4. नीचे बाईं ओर मार्क चार्ट में, अपनी प्रारंभिक झिल्ली क्षमता लिखें और एंटर दबाएं। जैसे-जैसे प्रयोग जारी रहता है, आप उपयोग की जा रही दवाओं का नाम लिख सकते हैं। एक बार प्रयोग समाप्त हो जाने के बाद, स्क्रीन के ऊपरी बाईं ओर स्टॉप का चयन करें ।
      नोट: हम टीईवीसी करने के लिए विनईडीआर या विनडब्ल्यूसीपी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हैं क्योंकि ये प्रयोगों के लिए स्वतंत्र और अच्छी तरह से अनुकूल हैं, लेकिन उपलब्ध किसी भी अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है।
  3. प्रयोग करने के लिए आवश्यक सभी दवा समाधान (जैसे, गाबा, कैनेट) बनाएं और पुष्टि करें कि समाधान वाल्व उन्हें चालू और बंद करके और चुटकी वाल्व के विस्थापन को देखकर ठीक से काम कर रहे हैं।
  4. ट्यूब से जुड़े सिरिंज रिसेप्टेक पर संबंधित समाधान डालकर ट्यूबों को भरें और समाधान ट्यूबों के साथ सहसंबंधित करने के लिए वाल्व नियंत्रक को लेबल करें। सुनिश्चित करें कि समाधान का प्रवाह स्थिर है, कोई बुलबुले नहीं हैं और वैक्यूम सिस्टम ठीक से काम कर रहा है।
  5. माइक्रोस्कोप और रिकॉर्डिंग कक्ष क्षेत्र की स्थापना करें। ग्राउंड संदर्भ और रिकॉर्डिंग कक्ष के रूप में उपयोग किए जाने वाले इलेक्ट्रोड के लिए कुओं को जोड़ने, रिकॉर्डिंग कक्ष (हैंडलिंग क्षेत्र से डिस्टल) के पीछे संबंधित परिपत्र छेद में अगर पुलों (नीचे देखें) रखें। रिकॉर्डिंग कक्ष और जमीन संदर्भ इलेक्ट्रोड कुओं के लिए रिंगर के काम समाधान (1x) जोड़ें।
    1. अगर पुल यू-आकार के बोरोसिलिकेट ट्यूब हैं, जो 2-3 सेमी लंबे हैं, जो रिंगर के समाधान में 3% अगर से भरे हुए हैं। 15 सेमी लंबी ट्यूबों को काटकर, उन्हें खुली आंच पर झुकाकर, और फिर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके गर्म 3% अगर के साथ भरकर यू-आकार की ट्यूब बनाएं। उपयोग होने तक फ्रिज में रिंगर के समाधान में भरे हुए अगर पुलों को स्टोर करें।
    2. आसुत जल के 1 एल में, 134.4 ग्राम एनएसीएल, 2.982 ग्राम केसीएल, 5.29 ग्राम सीएसीएल 2, और 23.83 ग्राम एचईपीईएस (4- (2-हाइड्रॉक्सीथाइल) -1-पिपराज़ीनथेनेसल्फोनिक एसिड) जोड़ें। 1x रिंगर के कामकाजी समाधान के लिए, वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में, 3,800 मिलीलीटर आसुत जल में रिंगर के स्टॉक समाधान (20x) के 200 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. 3 एम केसीएल समाधान में चांदी के तारों को रखकर और चांदी इलेक्ट्रोड को 9 वी बैटरी के सकारात्मक टर्मिनल से जोड़कर इलेक्ट्रोलिसिस द्वारा प्रत्येक प्रयोग से पहले क्लोरीनयुक्त चांदी इलेक्ट्रोड तैयार करें। लगभग 3 मिनट के बाद एजीसीएल की एक ठोस भूरे रंग की परत इलेक्ट्रोड में जमा हो जाती है। इलेक्ट्रोड आवास में क्लोरीनयुक्त चांदी इलेक्ट्रोड तारों रखें।
    नोट: ग्राउंड संदर्भ और रिकॉर्डिंग क्लोरीनयुक्त इलेक्ट्रोड चांदी / चांदी क्लोराइड (एजी / एजीसीएल) इलेक्ट्रोड हैं।
  7. केसीएल समाधान से बोरोसिलिकेट सुइयों को हटा दें। इलेक्ट्रोड सुई के खुले छोर से केसीएल समाधान की एक छोटी मात्रा निकालने और खनिज तेल के साथ केसीएल समाधान को बदलने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें; यह पानी के वाष्पीकरण और सुई के भीतर केसीएल एकाग्रता में परिवर्तन से बचेगा। क्लोरीनयुक्त चांदी इलेक्ट्रोड तार पर कांच की सुई स्लाइड और जगह में उन्हें कस लें।
  8. इलेक्ट्रोड को पकड़ने वाले दाएं और बाएं मैनिपुलेटर का उपयोग करके, इलेक्ट्रोड सुइयों को रिकॉर्डिंग कक्ष में मार्गदर्शन करें जो रिंगर के समाधान से भरा हुआ है।
  9. वीएम और वी ऑफसेट घुंडी को शून्य करके और फिर इलेक्ट्रोड टेस्ट बटन दबाकर प्रत्येक इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध की जांच करें। प्रतिरोध 0.5-3 एमΩ के बीच होना चाहिए (सीधे स्क्रीन में 5-30 एमवी के रूप में पढ़ा जाता है)। यदि प्रतिरोध सीमा से बाहर है, तो नए माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करके बदलें।
  10. ताजा रिंगर के समाधान के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष भरें। एक ग्लास पिपेट का उपयोग करके, रिकॉर्डिंग कक्ष के केंद्र में एक गैर-इंजेक्शन या एक माइक्रोट्रांसप्लांटेड ओओसाइट रखें। सुनिश्चित करें कि ओओसाइट माइक्रोस्कोप के नीचे स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है, जानवरों की तरफ ऊपर (चरण 3.4 में नोट देखें)।
  11. इलेक्ट्रोड को रिंगर के समाधान में तब तक गाइड करें जब तक कि वे ओओसाइट झिल्ली को स्पर्श न करें। धीरे दोनों इलेक्ट्रोड के साथ पशु पक्ष में ओओसाइट झिल्ली छेद (चरण 3.4 में नोट देखें) और आराम झिल्ली क्षमता रिकॉर्ड। रिंगर के समाधान प्रवाह को चालू करें।
  12. ओओसाइट क्लैंप एम्पलीफायर का उपयोग करके, मोड को वोल्टेज क्लैंप में बदलें और -80 एमवी के होल्डिंग वोल्टेज को सेट करें। मॉनिटर पर वर्तमान नकारात्मक होना चाहिए, आमतौर पर 0 और 0.4 माइक्रोएम्पियर के बीच।
  13. रिकॉर्डिंग को फ़ाइल > नया के रूप में सहेजने के लिए कोई नई फ़ाइल बनाएँ > सॉफ़्टवेयर पर रिकॉर्डिंग सहेजें . रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें, रिकॉर्ड > रिकॉर्ड को डिस्क पर दबाएँ. मार्क बॉक्स संवाद (परीक्षण नाम, उपयोग की जाने वाली दवाएं, आदि) का उपयोग करके फ़ाइल में प्रासंगिक जानकारी जोड़ें।
  14. वाल्व खोलकर और उन्हें 15 एस के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष में छिड़काव करके रासायनिक उत्तेजना के लिए एगोनिस्ट (जैसे, गाबा, ग्लूटामेट, या कैनेट) लागू करें। आमतौर पर, अधिकतम अंकों को प्लॉट करने और प्रतिक्रिया का पुनर्निर्माण करने के लिए 10x के लाभ का उपयोग करें। यदि धाराएं बहुत छोटी हैं, तो उनका मूल्यांकन और दृश्यमान होने के लिए प्रवर्धन, या लाभ बढ़ाएं। इन बदलावों पर हमेशा ध्यान दें।
    नोट: छिड़काव की अवधि प्रयोगात्मक प्रतिमान पर निर्भर करती है। यदि प्रमुख लक्ष्य अधिकतम आयाम को मापना है, तो जीएबीए के लिए चोटी या कैनेट के लिए पठार तक पहुंचने के लिए 15 एस पर्याप्त होगा।
  15. हमेशा समाधान के स्तर की निगरानी करें। रिंगर के समाधान को अक्सर फिर से भरने की आवश्यकता होगी क्योंकि इसका उपयोग सभी समाधान उपयोगों के बीच किया जाता है। एक बार रिकॉर्डिंग पूरी हो जाने के बाद, वोल्टेज क्लैंप को बंद स्थिति में बदल दें और रिंगर के समाधान वाल्व को बंद कर दें। ओओसाइट को हटा दें। रिकॉर्डिंग बंद करें और फ़ाइल सहेजें. सभी इंजेक्शन ओओसाइट्स के लिए इन चरणों को दोहराएं।

5. टीईवीसी रिकॉर्डिंग का विश्लेषण

  1. रिकॉर्डिंग की एक प्रति यूएसबी ड्राइव पर सहेजें। वहां से, विश्लेषण करने के लिए वांछित फ़ाइल खोलें। खुलने वाली फ़ाइल में, रिकॉर्डिंग को देखा, चिह्नित और मापा जा सकता है। सबसे आम विश्लेषण में अधिकतम आयाम, सक्रियण समय, डिसेंसिटाइजेशन और दोहराए जाने वाले अनुप्रयोगों की सूची को मापना शामिल है।
  2. एएमपीए अधिकतम प्रतिक्रिया और गाबा शिखर प्रतिक्रिया को मापें। इन मापों को प्राप्त करने के लिए, पहले कर्सर के साथ लाल रेखा को खोजकर और रिंगर एप्लिकेशन या बेसलाइन द्वारा उत्पन्न वर्तमान में खींचकर एक शून्य स्तर या आधाररेखा स्थापित करें।
  3. एक बार शून्य स्तर स्थापित हो जाने के बाद, ग्राफ ट्रेसर के वांछित भाग में हरे, ऊर्ध्वाधर रीडआउट कर्सर को खींचने के लिए माउस का उपयोग करके प्रतिक्रिया माप निर्धारित करें। यदि वांछित है, तो किसी अन्य पसंदीदा सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण किए जाने वाले निशान निर्यात करें
    नोट: यदि शून्य स्तर परिभाषित करने में असमर्थ है या ट्रेसर पर बहुत अधिक शोर इंगित किया गया है, तो WinEDR फ़ाइल को एक ऑफ़लाइन विश्लेषणात्मक सॉफ़्टवेयर में निर्यात करें, जो शोर को कम करने के लिए एक स्तर आधाररेखा और फ़िल्टर के अलावा प्रदान करने के लिए संशोधनों की अनुमति देगा।

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Representative Results

इंजेक्शन के कुछ घंटों के भीतर, सिनैप्टिक झिल्ली, अपने न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स और आयन चैनलों को ले जाते हुए, ओओसाइट प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज करना शुरू कर देते हैं। चित्रा 1 एएमपीए और गाबाए रिसेप्टर्स की रिकॉर्डिंग को ज़ेनोपस ओओसाइट्स में माइक्रोट्रांसप्लांट करता है। अधिकांश विश्लेषण के लिए, प्रति नमूना दो या तीन ओओसाइट्स की प्रतिक्रियाओं को मापा गया था, विभिन्न मेंढकों से ओओसाइट्स के दो या तीन बैचों का उपयोग करके, प्रति नमूना कुल छह से नौ ओओसाइट्स के लिए। यह समूह मतभेदों का निरीक्षण करने के लिए मानव विषयों के एक बड़े समूह के लिए किया जाता है। विश्लेषण सीधा है और प्रतिक्रियाओं के आयाम को मापता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रत्यारोपित झिल्ली का संलयन एक ध्रुवीकृत प्रक्रिया है, इस प्रकार इंजेक्शन साइट का चयन बहुत महत्वपूर्ण है। वनस्पति गोलार्ध में या भूमध्य रेखा में इंजेक्शन लगातार परिणाम देता है, सभी इंजेक्शन वाले ओओसाइट्स सफलतापूर्वक रिसेप्टर्स को सम्मिलित करते हैं और आयन धाराओं को उत्पन्न करते हैं जो एक यूनिमोडल वितरण22 का पालन करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि जब झिल्ली को शुरू में पशु ध्रुव में इंजेक्ट किया गया था, तो ओओसाइट प्रतिक्रियाओं ने एक बिमोडल वितरण का पालन किया: ओओसाइट्स के एक समूह में कोई या बहुत कम प्रतिक्रियाएं नहीं थीं, जबकि दूसरे समूह में बड़ी प्रतिक्रियाएं थीं, यहां तक कि वनस्पति ध्रुव या भूमध्य रेखा में इंजेक्शन वाले ओओसाइट्स से भी बड़ी थीं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या पशु ध्रुव में इंजेक्ट किए गए कुछ ओओसाइट्स में कम प्रतिक्रियाएं थीं क्योंकि मानव झिल्ली को ओओसाइट के नाभिक के भीतर इंजेक्ट और फंसाया जा रहा था, टारपीडो के विद्युत अंग से अलग झिल्ली का मिश्रण और गैबाω1 सबयूनिट के लिए सीडीएनए कोडिंग पशु पक्ष के ध्रुव में इंजेक्ट किया गया था। टारपीडो झिल्ली से निकोटिनिक रिसेप्टर्स ने एसिटाइलकोलाइन23 के छिड़काव के दौरान एक तेज सक्रियण और तेजी से डिसेंसिटाइजेशन दिखाया, जबकि ω1 सबयूनिट होमोमेरिक गाबा 1 रिसेप्टर्स बनाता है जोगाबा 24,25,26,27 के निरंतर छिड़काव के दौरान असंवेदनशील नहीं होते हैं। यदि सह-इंजेक्शन नमूना गलती से नाभिक में वितरित किया जा रहा था और साइटोप्लाज्म नहीं, तो सीडीएनए को आरएनए में स्थानांतरित किया जाएगा और कार्यात्मक जीएबीए 1 रिसेप्टर्स में अनुवादित किया जाएगा। चित्रा 2 से पता चलता है कि जब इंजेक्शन नाभिक के उद्देश्य से था, तो एसिटाइलकोलाइन के लिए उच्च प्रतिक्रियाओं वाले ओओसाइट्स ने जीएबीए 1 रिसेप्टर्स को व्यक्त नहीं किया; इसके विपरीत, एसिटाइलकोलाइन के लिए शून्य या कम प्रतिक्रिया वाले ओओसाइट्स ने गाबा रिसेप्टर्स को व्यक्त किया। इस प्रयोग के परिणाम बताते हैं, सबसे पहले, कम प्रतिक्रिया वाले ओओसाइट्स में, झिल्ली गलती से ओओसाइट के नाभिक में जमा हो गई थी; दूसरा, नाभिक में टारपीडो झिल्ली का इंजेक्शन ω1 सीडीएनए के प्रतिलेखन में बहुत हस्तक्षेप नहीं करता है। कुछ सह-इंजेक्शन वाले ओओसाइट्स में एसिटाइलकोलाइन और जीएबीए दोनों के लिए बड़ी प्रतिक्रियाएं थीं, जो इंजेक्शन के दौरान नाभिक के टूटने का सुझाव देती हैं। ओओसाइट के पशु गोलार्ध में प्रत्यारोपित झिल्ली का बढ़ाया सम्मिलन विषम रूप से व्यक्त न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स 26,28 के ध्रुवीकृत स्थानीयकरण को प्रतिबिंबित करता है। इसलिए, नाभिक को लक्षित किए बिना पशु गोलार्ध में इंजेक्शन लगाकर, बड़ी प्रतिक्रियाएं प्राप्त करना संभव है। रिसेप्टर्स के कम घनत्व वाले नमूनों का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए अल्जाइमर रोग (एडी) ऊतक से रिसेप्टर्स की कम संख्या (चित्रा 3) के साथ।

Figure 1
चित्रा 1: ओओसाइट्स के प्रतिनिधि आयन धाराएं। मानव सिनैप्टिक रिसेप्टर्स से झिल्ली के साथ इंजेक्शन ओओसाइट्स से आयन धाराओं को दर्ज किया गया था। एएमपीए रिसेप्टर्स को 100 एमएम कैनेट के साथ सक्रिय किया गया था, और गाबाए रिसेप्टर्स 1 एमएम गाबा के साथ। वीएच = -80 एमवी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: टारपीडो और जीएबीए 1 का सह-इंजेक्शन। टारपीडो के विद्युत अंग से फ़िल्टर्ड झिल्ली (0.1 μm) का सह-इंजेक्शन, एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स में समृद्ध, और पशु ध्रुव में GABAω1 रिसेप्टर के लिए सीडीएनए कोडिंग ने मुख्य रूप से उनकी प्रतिक्रियाओं के आधार पर ओओसाइट्स के दो समूहों का उत्पादन किया: ओओसाइट्स (ए) के एक समूह में एसिटाइलकोलाइन (आच; 1 एमएम) के लिए बड़ी प्रतिक्रियाएं थीं, लेकिन 1 μM जीएबीए (वोल्टेज क्लैंप) के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं थी और समूह (बी) में ओओसाइट्स में एसीएच के लिए शून्य या कम प्रतिक्रियाएं थीं लेकिन गाबा के लिए बड़ी प्रतिक्रियाएं थीं। (सी) ग्राफ समूह 1 (एन = 5 ओओसाइट्स) और समूह 2 (एन = 11 ओओसाइट्स) में पीक करंट के माध्य (एसईएम) की माध्य (एसईएम) की औसत ± मानक त्रुटि दिखाता है। समूह 2 में एक ओओसाइट में नाभिक के टूटने का सुझाव देने वाली बड़ी गाबा और एसीएच प्रतिक्रियाएं थीं; नतीजतन प्रतिक्रियाओं का वितरण कम मूल्यों के लिए तिरछा था, जैसा कि झिल्ली वर्तमान (22 एनए बनाम 6 एनए) के वितरण के माध्य और माध्यिका के बीच के अंतर से उल्लेख किया गया है। यह परिणाम इंगित करता है कि कम प्रतिक्रिया वाले ओओसाइट्स के कारणों में से एक यह है कि झिल्ली को इंजेक्शन दिया जा रहा है और ओओसाइट के नाभिक में फंस गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ज़ेनोपस ओओसाइट्स में कोशिका झिल्ली का ध्रुवीकृत सम्मिलन। गैर-एडी मस्तिष्क (महिला, 74 वर्ष, पोस्टमॉर्टम अंतराल 2.8 घंटे) और एक एडी-मस्तिष्क (महिला, 74 वर्ष, पोस्टमॉर्टम अंतराल 4.5 घंटे) से प्राप्त अनफ़िल्टर्ड झिल्ली के साथ जानवर या वनस्पति ध्रुवों में इंजेक्ट किए गए ओओसाइट्स की गाबा और कैनेट प्रतिक्रियाएं। नाभिक को लक्षित किए बिना पशु ध्रुव के पास इंजेक्ट किए गए ओओसाइट्स ने वनस्पति ध्रुव में इंजेक्ट किए गए ओओसाइट्स की तुलना में बड़ी प्रतिक्रियाएं दीं, इस प्रकार रिसेप्टर्स की बहुत कम संख्या के साथ ऊतक के नमूनों के अध्ययन की अनुमति दी। वनस्पति और पशु ध्रुवों के बीच छात्र का टी-टेस्ट: ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, बार्स पीक करंट के औसत ± एसईएम का संकेत देते हैं, एन = 5 ओओसाइट्स प्रत्येक कॉलम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मस्तिष्क विकारों में होमियोस्टैटिक और रोग प्रक्रियाओं को समझने और बीमारियों को रोकने या इलाज के लिए चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए मानव मस्तिष्क से देशी प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण आवश्यक है। इस प्रकार, स्नैप जमे हुए नमूनों वाले मस्तिष्क बैंक शारीरिक जानकारी29,30 के एक बड़े और ज्यादातर अप्रयुक्त धन का एक अमूल्य स्रोत हैं। पोस्टमॉर्टम ऊतक का उपयोग करने के लिए एक प्रारंभिक चिंता एमआरएनए या प्रोटीन गिरावट की स्पष्ट संभावना है जो डेटा की व्याख्या को भ्रमित कर सकती है। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क का पीएच लगातार मात्रात्मक वास्तविक समय-पीसीआर द्वारा एमआरएनए की मात्रा का ठहराव के साथ एक सकारात्मक सहसंबंध दिखाता है, और यह सहसंबंध पैथोलॉजी31 से स्वतंत्र है। पीएच के अंतर-विषय मतभेदों से बड़े विचरणों के साथ एमआरएनए परिमाणीकरण के अंतर हो सकते हैं जो परिणामों की व्याख्या को अस्पष्ट कर सकते हैं32. दिलचस्प बात यह है कि पीएच अम्लीय होने के रूप में एमआरएनए टेपों के कम परिमाणीकरण के बावजूद, विभिन्न टेपों के बीच सहप्रसरण33 बनाए रखा जाता है, जो पैथोलॉजिकल राज्यों के विश्वसनीय ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग प्राप्त करने के लिए एक ढांचा प्रदान करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि एमआरएनए अत्यधिक अपमानजनक है, पोस्टमॉर्टम ऊतक में ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन गिरावट34 के लिए बहुत प्रतिरोधी हैं। प्रयोगशाला में पिछले प्रयोगों से पता चला है कि मानव मस्तिष्क के गाबा और ग्लूटामेट रिसेप्टर्स बहुत बड़े पोस्टमॉर्टम अंतराल35 के बाद कार्यात्मक हैं। इसके अलावा, एमएसएम विधि सीधे रिसेप्टर्स के कार्य पर मृत्यु के क्षण में पीएच, एगोनल राज्य, और एमआरएनए और प्रोटीन क्षरण जैसे संभावित भ्रमित कारकों के प्रभावों को मापने की अनुमति देती है, इस प्रकार डेटा के विश्लेषण और व्याख्या में इस जानकारी का उपयोग करने के तरीके प्रदान करती है।

तकनीक के संशोधन और समस्या निवारण
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एमएसएम कुल झिल्ली के मूल प्रत्यारोपण का एक मामूली संशोधन है, जो एक ऐसी विधि है जिसे शिक्षाविदों और दवा उद्योग 12,36,37,38,39,40 में कई प्रयोगशालाओं द्वारा व्यापक रूप से मान्य और पुष्टि की गई है। उदाहरण के लिए, एली लिली के एलवाई 3130481 के विकास में रिसेप्टर्स का माइक्रोट्रांसप्लांटेशन महत्वपूर्ण था, जो एएमपीए रिसेप्टर्स का एक टीएआरपी गामा -8-चयनात्मक विरोधी है जो मस्तिष्क क्षेत्र चयनात्मकता12 दिखाता है। एमएसएम सिनैप्टोसोमल समृद्ध तैयारी का उपयोग करके एक ही माइक्रोट्रांसप्लांटेशन सिद्धांत का पालन करता है; इसलिए, अच्छी सिनैप्टोसोमल तैयारी होना महत्वपूर्ण है। हम सिन-प्रति विधि का उपयोग करते हैं क्योंकि इस प्रक्रिया के साथ प्राप्त परिणाम बहुत सुसंगत हैं और आयन धाराओं का आयाम प्रोटिओमिक प्रयोगों में सिनैप्टिक प्रोटीन के स्तर के साथ बहुत अच्छी तरह से सहसंबंधितहै 10. हालांकि, माइक्रोट्रांसप्लांटेशन या एमएसएम को उत्कृष्ट परिणामों के साथ कई स्रोतों (जैसे, कीट झिल्ली38,39, न्यूरोलेमा40) से रिसेप्टर्स का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कुछ विकार हैं जहां सिनैप्स अल्जाइमर रोग की तरह दृढ़ता से प्रभावित होते हैं, या कम मात्रा में उपलब्ध होते हैं; इस मामले में, पशु पक्ष में झिल्ली का इंजेक्शन बड़ी धाराओं को प्राप्त करने में मदद करता है। इंजेक्शन प्रोटीन की मात्रा में वृद्धि भी झिल्ली के संलयन और प्रतिक्रियाओं के आकार को बढ़ाती है। यद्यपि इंजेक्शन झिल्ली की एकाग्रता और ओओसाइट्स के अस्तित्व के बीच एक नकारात्मक सहसंबंध है, झिल्ली की एक उपयुक्त एकाग्रता खोजना संभव है जो दिए गए प्रयोगात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है।

एमएसएम की सीमाएं
एमएसएम एक मात्रात्मक विधि है जिसे मानव रिसेप्टर्स या आयन चैनलों के अध्ययन के लिए विकसित किया गया था; इसलिए, यह सीमित उपलब्धता के साथ ऊतक का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। क्योंकि ज़ेनोपस ओओसाइट्स में अंतर्जात ग्लूटामेट या गाबा रिसेप्टर्स नहीं होते हैं, माइक्रोट्रांसप्लांटेड ओओसाइट्स में जीएबीए या ग्लूटामेट की कोई प्रतिक्रिया इंजेक्शन रिसेप्टर्स से आती है जो ओओसाइट्स की झिल्ली के साथ जुड़ी होती है। हालांकि, एमएसएम की एक महत्वपूर्ण सीमा आयन चैनलों या ट्रांसपोर्टरों का अध्ययन है जो ओओसाइट्स में अंतर्जात रूप से व्यक्त किए जाते हैं, क्योंकि माइक्रोट्रांसप्लांटेड और अंतर्जात चैनलों / ट्रांसपोर्टरों से आयन धाराओं का पृथक्करण मुश्किल है। अंतर्जात जीन को चुप कराने वाले भविष्य के अध्ययन इस सीमा के साथ सहायक हो सकते हैं।

मौजूदा तरीकों का महत्व यह है कि एमएसएम अपने संबंधित प्रोटीन और रिसेप्टर्स के साथ देशी झिल्ली को शामिल करता है, और इस प्रकार, विश्लेषण के लिए अधिक शारीरिक वातावरण प्रदान करता है। यह पाया गया है कि उनके मूल झिल्ली में रिसेप्टर्स के गुणों को ओओसाइट्स में प्रत्यारोपण के बाद बनाए रखा जाता है, जैसा कि सुसंस्कृत कोशिकाओं41 से न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स एएमपीए-प्रकार ग्लूआर 1, α7-एसीओआर और α4β2-एसीओआर में देखा गया है।

तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में स्वस्थ और रोगग्रस्त मानव मस्तिष्क से सुसंस्कृत और गैर-सुसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतकों की झिल्ली में रुचि के विभिन्न प्रोटीन और रिसेप्टर्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन शामिल है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एनआईएच अनुदान आर01एजी070255 और एएल को आर01एजी073133 द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस पांडुलिपि में दिखाए गए मानव ऊतक प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय इरविन अल्जाइमर रोग अनुसंधान केंद्र (यूसीआई-एडीआरसी) को भी धन्यवाद देते हैं। यूसीआई-एडीआरसी को एनआईएच/एनआईए अनुदान पी30 एजी066519 द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 185
कार्यात्मक अध्ययन के लिए मानव सिनैप्टिक रिसेप्टर्स को पुन: सक्रिय करने के लिए सिनैप्टिक झिल्ली का माइक्रोट्रांसप्लांटेशन
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Miller, B., Powell, A., Gutierrez,… More

Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).

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